牛磺膽酸促進肝硬化發展的機制

樂英彪，王昆華，鄒 雷

1 昆明醫科大學，昆明醫科大學第一附屬醫院 胃腸與疝外科，昆明醫科大學第一附屬醫院 科研實驗中心，國家衛健委毒品依賴和戒治重點實驗室，昆明 650032；2 昆明醫科大學第一附屬醫院 肝膽外科，國家衛健委毒品依賴和戒治重點實驗室，昆明 650032

肝硬化是慢性肝損傷的終末階段，其特點是肝細胞反復慢性變性壞死，繼之纖維組織增生和肝細胞結節狀再生，使肝臟正常小葉結構破壞和血液循環途徑發生改變[1-2]。膽汁淤積是肝硬化病理表現，肝硬化產生的纖維間隔可壓迫肝內膽管樹，進一步加重膽汁淤積。而在非肝硬化的膽汁淤積患者中，膽汁在肝內積聚，高水平的膽汁酸損傷膽管上皮，膽道壓力升高導致膽管破裂，使肝細胞暴露于高水平膽汁酸，隨著時間的推移也會發展為肝硬化，最終導致肝衰竭。膽汁淤積與肝硬化互為因果形成惡性循環，在此過程中牛磺膽酸(taurocholic acid，TCA)的水平升高顯著[3]。根據國內外現有研究，這些水平異常的TCA可以作用于不同種類的肝細胞從而加速肝硬化進展，具有成為肝硬化臨床治療靶點的潛力。

1 TCA與膽汁淤積性肝硬化嚴重程度呈正相關

TCA屬于初級結合型膽汁酸，在膽汁中主要以膽鹽的形式存在。人類肝臟膽汁酸的合成90%通過經典合成途徑(圖1)，僅10%通過替代合成途徑合成[4]。在肝病中，膽固醇7α羥化酶活性降低，替代合成途徑的占比升高。但替代合成途徑只生成鵝脫氧膽酸，因此即使在肝硬化條件下，TCA也只通過經典合成途徑合成[5-6]。

注：C1，7α-羥基-4-膽甾烯-3-酮；C2，7α，12α-羥基-4-膽甾烯-3-酮；C3，5β-膽甾烷-3α，7α，12α-三醇；CYP7A1，膽固醇7α-羥化酶；HSD3B7，3β-羥基-Δ5-C27-類固醇脫氫酶；CYP8B1，甾醇12α-羥化酶；AKR1D1，Δ4-3-氧類固醇-5β還原酶；AKR1C4，3α-羥基類固醇脫氫酶；CYP27A1，甾醇27-羥化酶；THCA，3α，7α，12α-三羥基膽甾酸；BACS，膽脂酰CoA合成酶；VLCS，超長鏈脂酰CoA合成酶；AMACR，α-甲基酰基輔酶A消旋酶；DBP，D-雙功能蛋白；SCPx，甾醇載體蛋白x；BAAT，氨基酸N-酰基轉移酶；ASBT，鈉依賴回腸尖端膽汁轉運體；NTCP，牛磺膽酸鈉轉運蛋白；OATP，有機陰離子轉運蛋白。

肝硬化嚴重影響患者生存質量，為了準確評估肝損傷程度以及肝硬化預后，現在使用最為廣泛的為Child-Pugh(CP)分級標準和終末期肝病模型(MELD)，但是CP分級在臨床實踐中仍然存在缺陷，如CP分級不能提供肝硬化病理階段的直接證據；其量化指標中存在主觀成分，評判還需依賴臨床醫師的經驗等[7-8]。因此需要一個更為客觀準確的量化標準來彌補CP評分的不足，以便能更早對肝硬化進行干預。膽汁淤積是肝硬化的突出表現，與非膽汁淤積患者相比，膽汁淤積患者的血清膽汁酸譜發生了巨大的改變，其中以TCA升高最為顯著。在非膽汁淤積患者體內，TCA約占總膽汁酸10%，而在膽汁淤積患者體內這一比例升高到34%[3]。TCA、牛磺鵝脫氧膽酸(TCDCA)、甘氨膽酸(GCA)是肝硬化患者血清中升高最多的膽汁酸，且這些膽汁酸與CP評分正相關，使用MELD評分進行驗證也得到了同樣的結果[9-10]。Horvatits等[11]也發現急性失代償期肝硬化患者血清中TCA、GCA、TCDCA的水平顯著高于代償期肝硬化患者，并且與肝病嚴重程度相關。同時生化分析也得出牛磺膽酸鹽、甘氨膽酸鹽等膽汁酸鹽與血小板計數、國際標準化比值、血清白蛋白、C反應蛋白呈顯著正相關的結論。表明TCA可作為肝硬化患者分層的潛在標志物，能夠輔助現有分級系統更加客觀的評價肝硬化患者的肝功能，以實現更早的干預，提高患者生存質量。

2 膽汁淤積狀態下TCA加速肝硬化的機制

2.1 TCA通過肝星狀細胞(HSC)加速肝硬化進展 正常肝臟中的HSC位于Disse的內皮下間隙，在生理上負責細胞外基質的合成和重塑，也可以作為肝臟特異性周細胞發揮作用[2]。在肝纖維化的發展過程中，HSC經歷了轉分化或激活的過程。這個過程的特點是細胞從靜止型HSC向激活型HSC轉變[2,12]，主要包括形態轉化為肌成纖維樣細胞、細胞增殖增加、細胞外基質成分的合成改變、生長因子和細胞因子的分泌增加和細胞收縮能力的增強。而TCA可以誘導HSC上述轉變從而加速肝硬化進展。

Liu等[10]將LX-2細胞(肝星狀細胞系)在TCA的環境下培養，發現TCA能顯著促進LX-2細胞的增殖，呈劑量依賴性。經過TCA處理后，LX-2細胞Ⅰ型膠原蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達明顯增加，也呈劑量依賴。肝纖維化過程中細胞外基質的沉積與Disse間隙中的Ⅳ型膠原被纖維狀的Ⅰ型和Ⅲ型膠原取代是肝纖維化的標志性過程[13]，α-SMA也是HSC向肌成纖維樣細胞轉化的標志物，這表明TCA可以直接刺激HSC增殖，誘導其向肌成纖維樣細胞轉化，釋放Ⅰ型膠原，從而促進肝纖維化。

TCA還能促進LX-2細胞Toll樣受體(TLR)4的表達，經TCA處理后，TLR4的表達相較于對照組呈劑量依賴增加[10]。TLR是一類高度保守的模式識別受體，參與體內病原體的識別。TLR刺激后產生的強烈促炎癥作用以及抗病原反應在短期內有利于機體對抗病原，但是TLR長期或過度激活會對機體產生不利影響[14]。肝硬化患者腸黏膜通透性改變以及腸道細菌易位造成門靜脈以及體循環中LPS水平升高，LPS可以通過受體TLR4作用于HSC，增強TGFβ介導的HSC活化和膠原的產生[15]。TGFβ在肝細胞增殖和肝再生、誘導實質細胞凋亡、免疫監視和肝纖維化形成中發揮重要作用[16-17]。肝臟TGFβ主要來源于HSC、Kupffer細胞和肝竇內皮細胞，最近也有證據[18]表明血小板也是TGFβ的重要來源。TGFβ在體內和體外均可激活HSC，TLR4不僅能夠促使Kupffer細胞分泌TGFβ，還能下調靜止型HSC上的TGFβ假受體Bambi，以增強HSC對TGFβ的敏感性[15]。TLR4誘導的Bambi下調依賴MyD88/NF-κB途徑，在實驗中MyD88基因缺陷小鼠的肝纖維化程度相較于對照組減輕也證明了這一點[15,19]。TCA增強了HSC中TLR4的表達，通過依賴于TGFβ的機制激活HSC促進肝硬化進展。而TCA對HSC作用的劑量依賴成為上述TCA水平與肝硬化分期呈正相關臨床表現的分子證據。

2.2 TCA通過肝細胞加速肝硬化進展 疏水性膽汁酸在體外可以通過其對脂質的去污作用破壞細胞膜，促進活性氧的生成，導致肝細胞壞死和凋亡[20]。TCA是疏水性膽汁酸的一種，但將肝細胞暴露于高水平TCA后，檢測發現肝細胞caspase-3的活性沒有增加，培養液中沒有檢測到ALT，也沒有發現與肝細胞凋亡和壞死的相關形態的改變[21]。這些研究表明，TCA并不會直接導致肝細胞的死亡。與之相反的是，將原代小鼠肝細胞暴露于病理水平下的TCA會顯著刺激細胞因子(CXCL1、CXCL6、MIP2、MCP-1等)和黏附分子(ICAM1、VCAM-1等)的表達。而這些細胞因子及黏附分子(包括ICAM-1、MIP2等)參與中性粒細胞在肝臟中的運輸，導致肝炎癥反應，造成肝損傷[21-23]。同時一些細胞因子(例如CXCL6)還可誘導Kupffer細胞產生TGFβ，通過前述途徑直接激活HSC，從而促進肝硬化[24]。上述細胞因子的表達都不同程度依賴于早期生長反應蛋白-1(early growth response protein-1，EGR-1)，EGR-1是一種重要的核轉錄因子，EGR-1依賴的信號可以增強血管和肝臟的炎癥[25]，其上調依賴細胞外調節蛋白激酶(ERK1/2)信號的激活[24-25]。EGR-1基因敲除小鼠在膽汁淤積過程中炎癥反應及肝損傷程度均減低[25]。在實驗中也發現TCA能夠增加肝細胞EGR-1 mRNA以及蛋白質的表達[21]。綜上，病理水平的TCA作為炎癥介質能通過ERK1/2途徑促進肝細胞EGR-1表達，刺激其產生一系列細胞因子及黏附因子，趨化中性粒細胞進入肝臟實質誘發肝臟炎癥，從而促進肝纖維化。

TCA刺激肝細胞分泌的單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)不僅是一種招募單核細胞和淋巴細胞的趨化因子，也是體外HSC募集相關的主要趨化因子[26]。循環中的MCP-1與肝硬化的嚴重程度有關，并且其主要來源于病變的肝臟[27]。在纖維化形成早期，血清MCP-1水平就已經升高，原位雜交證實瘢痕組織生長邊緣及再生結節內的肝細胞是MCP-1的主要來源[28]。在體外研究[28]中發現，TCA能夠誘導人肝細胞(HepG-2細胞)和原代正常小鼠肝細胞表達MCP-1。在囊性纖維化肝病中，膽汁中MCP-1水平增加與TCA水平呈正相關。同樣在膽汁淤積性大鼠中也發現血清和肝臟中MCP-1的表達與TCA呈正相關。Marra等[26]將HSC與MCP-1培養，發現MCP-1能促進HSC遷移，并呈劑量依賴性，而MCP-1對靜止型HSC無趨化作用。使用抗MCP-1中和抗體進行干預，MCP-1對HSC的趨化作用被抑制了80%[28]。此外MCP-1作為促炎因子也能直接招募外周血單核細胞到肝臟產生炎癥反應從而加速肝硬化[29]。

2.3 TCA通過肝祖細胞加速肝硬化進展 膽管反應(ductular reaction，DR)是指在肝祖細胞介導的肝臟修復過程中形成的局部細胞復合體[30]。這種復合體包括激活的肝祖細胞(liver progenitor cells，LPC)、中間型肝膽細胞和反應膽管細胞，DR被認為與許多慢性肝病的纖維化發生有關，LPC增殖和向膽管細胞分化都是DR的重要特征[31]。在對60例囊性纖維化肝病患兒的肝活檢發現，DR與肝纖維化分期和TCA水平顯著相關[32]。TCA可刺激LPC增殖，誘導其釋放MCP-1和MIP1α，前述已經提到MCP-1對HSC有趨化效應，而MIP1α能通過CCR5募集HSC，并且這些細胞因子還能誘導其他細胞(如炎性細胞)聚集到LPC的利基環境中從而參與肝纖維化[32-33]。TCA還能誘導LPC膽管細胞分化相關基因的表達，促使其向膽管細胞分化，并且這種誘導分化呈時間依賴性[32]。LPC與HSC之間直接的膜接觸是肝纖維化的重要一步[33-34]，暴露于病理水平TCA的LPC能夠分泌趨化因子募集HSC進入其利基環境，導致兩者直接接觸。HSC膜上表達淋巴毒素-β受體，而LPC膜上表達淋巴毒素-β，兩者細胞間的直接接觸可以通過淋巴毒素-β受體之間的相互作用導致HSC激活，從而促進肝纖維化[33]。

2.4 TCA通過膽管上皮細胞(bile duct epithelial cells，BEC)促進肝硬化進展 長期膽汁淤積損害毛細膽管，如不能及時修復會逐漸纖維化甚至消失，為了維持體內膽汁代謝相對平衡，肝臟會再生出新的膽管來代償毛細膽管纖維化，即膽管再生。BEC是膽管的主要構成細胞，能夠分泌細胞因子，如MCP-1、IL-6，在促進HSC增殖和膠原合成中起到重要作用。Lamireau等[35]將BEC在不同種膽汁酸的環境下培養，觀察膽汁酸對細胞的影響。發現有且僅有在TCA的培養環境下，MCP-1和IL-6的分泌顯著增加，MCP-1增加4倍，IL-6增加3倍。

前述已經說明MCP-1作為趨化因子，不僅能夠募集中性粒細胞進入肝實質導致炎癥反應，而且還對HSC有直接的趨化作用。而IL-6能促進細胞外基質合成，對HSC有促進有絲分裂的作用[36]。肝硬化患者血清IL-6水平升高與病死率有關[37]，相較于無肝性腦病患者，患有肝性腦病的患者血清IL-6水平顯著增高[38]。向小鼠體內注射IL-6可引發小鼠肝臟炎癥和纖維化，還可誘導脂肪細胞膠原合成。因此，IL-6不僅作為肝病及并發癥的標志物，其在肝纖維化過程中也發揮重要作用[36]。此外IL-6可以調節培養的腸上皮細胞Clandin-2的表達以此增加腸道通透性，在局部炎癥和腸通透性之間建立了明確聯系[39]。但是腸道IL-6主要來源于激活的腸巨噬細胞，因此TCA所促進BEC分泌的IL-6能否對腸道屏障產生作用還有待考證。

3 小結

肝硬化是許多慢性肝病的終末階段，肝硬化的臨床表現之一為膽汁淤積，而長期的膽汁淤積也會促進肝纖維化，兩者互為因果。不僅在膽汁淤積性疾病患者中觀察到TCA水平大幅升高，在肝硬化患者中也是如此，特別是失代償期患者血清TCA水平相較于代償期患者更高，而且TCA水平也與肝病嚴重程度呈正相關。TCA作為肝硬化患者體內水平顯著升高的膽汁酸，其在肝纖維化進程也發揮獨特的作用。高水平TCA不僅能直接刺激HSC增殖和分泌，還能促進肝細胞和BEC分泌多種細胞因子及趨化因子激活、募集肝星狀細胞，同時TCA可以刺激肝祖細胞誘導膽管反應從而在肝纖維化中起到重要作用(圖2)。上述所涉及的機制均在TCA高水平(≥50 μmol/L)的前提下，而處于低水平的TCA能夠維持膽管細胞增殖，在一定程度上對抗肝損傷。例如咖啡酸苯乙酯能增加膽管結扎大鼠膽管細胞凋亡，而TCA能通過增加膽管細胞血管內皮生長因子的表達來減輕這一凋亡作用[40-41]，提示降低體內TCA水平可能在肝硬化治療中起積極作用，表明TCA具有成為肝硬化臨床生物標志物以及治療靶點的潛力，為肝硬化患者的治療策略提供了新思路。

注：Erk1/2，細胞外調節蛋白激酶；EGR-1，早期生長反應蛋白-1。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：樂英彪、鄒雷參與起草和修改文章關鍵內容；王昆華對研究的思路有關鍵貢獻。