痰咳凈片質量標準改進研究

康小鳳 南榮華 劉嘉澍 王夢琪 李 青 黃 艷

陜西省食品藥品監督檢驗研究院中藥室，陜西西安 710065

痰咳凈片具有通竅順氣、消炎鎮咳、促進排痰的功效，療效顯著，其處方是由桔梗、咖啡因、遠志、冰片、苦杏仁、五倍子、甘草7味中藥材組成，臨床上用于急慢性支氣管炎、胸悶、咽喉炎、肺氣腫等引起的咳嗽痰多、氣促、氣喘等癥狀[1-3]。該品種現行質量標準只考察個別成分及企業的產品，為了更有效的控制質量，該品種被列為2018年度國家藥品標準。故本研究收集了不同產地四家企業的產品，在對原有鑒別方法學驗證的基礎上，增加甘草、桔梗的薄層色譜（thin-layer chromatography，TLC）法鑒別，對含量測定進行方法學驗證及修訂。修訂后的質量標準簡單、準確、靈敏度高，能達到快速準確檢測的效果，方法均經過耐用性的考察，為痰咳凈片的質量控制提供了依據，現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（型號：LC-30AD、四元梯度泵、紫外檢測器）；高效液相色譜儀（型號：LC-2030C-3D、四元梯度泵、二極管檢測器）；高效液相色譜儀（型號：Waters e2695-2489、四元梯度泵、紫外檢測器）；高效液相色譜儀（型號：Agilent 1260、四元梯度泵、紫外檢測器）；Empower工作站（美國沃特斯公司）；電子分析天平（德國Sartorius公司,型號：BP211D、BS224S、ME204）；數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司,型號：KH-300DE），OVENS 075臺式干燥器等。

1.2 試驗用藥

冰片（批號：0992-200001）、五倍子（批號：121078-201504）、沒 食 子 酸（批 號：110831-201204）、甘草（批 號：120904-201519）、桔 梗（批 號：121028-201612）、咖啡因（批號：110777-201711）、甘草酸銨（批號：110731-201720，純度：97.7%），均購自中國食品藥品檢定研究院。痰咳凈片及陰性樣品由陜西委托方提供。硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠）；聚酰胺薄膜（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）；色譜乙腈（美國天地公司）、色譜甲醇（美國天地公司），水為優普超純水；其他試劑均為分析純，購自西安化學試劑廠。

2 TLC鑒別研究方法

2.1 甘草[4-6]

2.1.1 供試品溶液的制備 取本品15片，研細，取約2 g，加乙醚40 ml，加熱回流1 h，濾過，棄去乙醚液，藥渣揮去乙醚，加甲醇30 ml，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水40 ml使溶解，用正丁醇提取3次，每次20 ml，合并正丁醇液，正丁醇液用水洗滌3次，每次20 ml，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇2 ml使溶解，作為供試品溶液。

2.1.2 對照藥材溶液的制備 取甘草對照藥材1 g，同2.1.1法制成對照藥材溶液。

2.1.3 陰性對照溶液的制備 取甘草陰性對照2 g，同2.1.1法制成陰性對照溶液。

2.1.4 結果分析 按照TLC（《中國藥典》2015年版四部 0502）試驗，吸取 2.1.1、2.1.2、2.1.3項下溶液各5 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與甘草對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾，斑點分離較好，方法基本可行。見圖1。

圖1 甘草的薄層色譜圖

2.2 桔梗[7-9]

2.2.1 供試品溶液的制備 取本品25片，研細，取約 4 g，加水 20 ml，稀鹽酸 6 ml，放置 30 min，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液用三氯甲烷振搖提取2次，每次20 ml，合并提取液，蒸干，殘渣加甲醇2 ml使溶解，作為供試品溶液。

2.2.2 對照藥材溶液的制備 取桔梗對照藥材1 g，同2.2.1法制成對照藥材溶液。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 取桔梗陰性對照4 g，同2.2.1法制成陰性對照溶液。

2.2.4 結果分析 依據TLC（《中國藥典》2015年版四部 0502）試驗，吸取 2.2.1、2.2.2、2.2.3項下溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（3∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與桔梗對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的主斑點，陰性無干擾，斑點分離較好，方法基本可行。見圖2。

圖2 桔梗的薄層色譜圖

3 高效液相色譜含量測定研究方法

3.1 甘草酸的含量測定

3.1.1 色譜條件及系統適應性 色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（柱長為4.6 mm×250 mm，內徑5 m）；流動相：甲醇-0.2 mol/L醋酸銨溶液-冰醋酸（65∶34∶1）；檢測波長：250 nm；理論板數按甘草酸峰計算應不低于2000。

3.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取甘草酸銨對照品適量，加流動相制成每1 ml約含40 g的溶液，即得（相當于每1 ml含甘草酸39.18 g）。

3.1.3 供試品溶液的制備 取本品40片，精密稱定，研細，取3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入流動相50 ml，稱定重量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用流動相補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

3.1.4 專屬性考察 取甘草陰性樣品3 g，按3.1.3法制成陰性溶液，分別精密吸取3.1.2、3.1.3項下溶液及此陰性溶液各10 μl，注入液相色譜儀，按3.1.1測定，結果陰性無干擾，表明方法專屬性較強。見圖3。

圖3 甘草酸含量測定的HPLC圖

3.1.5 線性關系考察 精密取每1 ml含甘草酸銨0.0455 mg 的甘草酸銨對照品 1 溶液 2、5、10、15、20、25 L及每1 ml含甘草酸銨0.0911 mg的甘草酸銨對照品2溶液15、20、25 L分別注入液相色譜儀，按3.1.1測定，以甘草酸銨的進樣質量（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標，作標準曲線，計算甘草酸銨的回歸方程為Y=794 996.5X（r=0.99 999，n=9），結果表明，甘草酸銨在進樣質量為0.091～2.278 μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

3.1.6 精密度考察 精密吸取甘草酸銨對照品溶液，注入液相色譜中，重復進樣7次，按3.1.1測定峰面積和保留時間，結果RSD%分別為0.27%，0.05%（n=6），表明儀器精密度良好。

3.1.7 穩定性考察 取本品（批號：180801）按3.1.3 法制備、3.1.1 測定，分別在 0、2、6、11、16、24、35、42 h測定峰面積，結果RSD%為2.38%（n=8），表明樣品溶液在42 h內穩定性良好。

3.1.8 重復性考察 按3.1.3法制備樣品（批號：180801），平行6份，按 3.1.1測定，結果RSD% 為2.51%，表明供試品重現性良好。

3.1.9 回收率考察 分別往具塞錐形瓶中精密量取甘草酸銨對照品（濃度為0.0869 mg/ml）溶液7 ml，平分6份，揮干溶劑，再取已知含量的樣品（批號：180801，甘草酸銨含量為0.4316 mg/g）6份，精密稱定，每份1.5 g，依法制備供試品溶液，測定，計算。結果平均回收率為96.98%，RSD為2.88%，表明回收率良好。

3.1.10 樣品含量測定 按4.1.1色譜條件，取12批次樣品照3.1.3法制備供試品溶液，精密吸取10 μl，注入高效液相色譜儀，測定。見表1。

表1 甘草酸含量測定結果

3.2 咖啡因的含量測定[10]

3.2.1 色譜條件及系統適應性 色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（柱長為4.6 mm×250 mm，內徑5 m）；流動相：甲醇-0.2 mol/L醋酸銨溶液-冰醋酸（33∶66∶1）；檢測波長：273 nm；理論板數按咖啡因計算應不低于2000。

3.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取咖啡因對照品適量，加水制成每1 ml約含50 g的溶液，即得。

3.2.3 供試品溶液的制備 取本品20片，精密稱定，研細，取0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水100 ml，稱定重量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液5 ml，置50 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

3.2.4 專屬性考察 取咖啡因陰性樣品0.5 g，按3.2.3法制備陰性對照溶液，分別精密吸取3.2.2、3.2.3項下溶液及此陰性對照溶液各10 μl，注入液相色譜儀中，按3.2.1測定，結果陰性對照無干擾，表明方法專屬性較強。見圖4。

圖4 咖啡因含量測定的HPLC圖

3.2.5 線性關系考察 精密取每1 ml含咖啡因0.04 524 mg 的咖啡因對照品溶液 5、8、10、12、15、18、20 μl注入液相色譜儀，按3.2.1測定，以咖啡因的進樣質量（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標，作標準曲線，計算咖啡因的回歸方程為Y=1519 520X（r=0.99 999，n=7），結果表明，咖啡因在進樣質量為0.2262～0.9048 μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

3.2.6 精密度考察 精密吸取咖啡因對照品溶液，注入液相色譜中，重復進樣7次，按3.2.1測定峰面積和保留時間，結果RSD%分別為0.04%，0.00%，表明儀器精密度良好。

3.2.7 穩定性考察 取本品（批號：180801）按4.3.3 法制備、4.3.1 測定，分別在 0、2、4、6、8、16、24、36、48 h測定峰面積，結果RSD%為0.10%，表明樣品溶液在48 h內穩定性良好。

3.2.8 重復性考察 按3.2.3法制備樣品（批號：180801），平分 6份，按 3.2.1測定，結果RSD% 為1.18%，表明供試品重現性良好。

3.2.9 回收率考察 分別往具塞錐形瓶中精密稱取咖啡因對照品約25 mg，平分6份，再取已知含量的樣品（批號：180801，咖啡因含量為96.1400 mg/g）6份，每份0.25 g，依法制備供試品溶液，測定，計算。結果平均回收率為98.21%，RSD為1.77%，表明回收率良好。

3.2.10 樣品含量測定 按3.2.1色譜條件，取12批次樣品照3.2.3法制備供試品溶液，精密吸取10 μl，注入高效液相色譜儀，測定。見表2。

表2 咖啡因含量測定結果

4 討論

本研究對方中苦杏仁[10]、遠志[11]藥材進行了TCL鑒別，采用不同的提取方法及展開劑，結果特征性不強，斑點模糊、陰性有干擾等，故未收入標準中，需進一步研究。

本研究對含量測定方法進行驗證，考察耐用性，分別采用不同柱溫、色譜柱、液相色譜儀進行考察。對同一批樣品甘草酸含量的考察：柱溫分別在30、35、40℃時，對分離效果影響不大，含量RSD為0.63%，僅對保留時間有影響；分別采用Phenomenex、Agilent、SPOLAR C18品牌色譜柱，島津 LC-30AD、LC-2030C-3D、Waters e2695-2489型號儀器，含量RSD為2.59%；對同一批樣品咖啡因含量的考察[12]：柱溫分別在30、35、40℃時，對分離效果影響不大，含量RSD為0.78%，僅對保留時間有影響；分別采用Phenomenex、Agilent品牌色譜柱，島津LC-30AD、LC-2030C-3D、Waters e2695-2489型號儀器，含量RSD為1.10%；故采用不同色譜柱、儀器對測定結果影響不大，說明該方法耐用性良好。

桔梗為方中的君藥用量較大，其宣肺利咽，祛痰排膿的功能與成藥功能密切相關，且有研究表明，桔梗中起鎮咳作用的活性成分之一是桔梗皂苷D[13]。故本研究對方中桔梗中桔梗皂苷D采用不同的提取方法[3，14-15]，進行檢測分析，四個不同廠家的四批樣品桔梗皂苷D的含量均小于萬分之一，故暫不列入標準正文，需進一步研究。

綜上所述，本研究建立的方法符合制劑質量標準建立的要求，方法簡便、快捷、重現性較好、限度合理，對痰咳凈片的用藥安全和質量控制具有重要的指導作用。