外周血NK細胞培養的擴增效率及殺傷活性的變化趨勢

陽 莉， 胡 元， 陳曉燕 ，黃夢淳，盧建溪?

（1.中山大學附屬第三醫院生物治療中心，廣東 廣州 510000；2.東莞長安港灣醫院內科 ，廣東 東莞 523000）

免疫療法作為繼手術、化療和放療之后治療惡性腫瘤的第四種方法，近年來正在快速發展并受到廣泛關注。目前，臨床上使用的免疫療法包括免疫檢查點阻斷劑療法、細胞因子療法、分子靶向療法和過繼免疫療法等[1-3]。過繼免疫療法又叫免疫細胞療法，是指取患者自體淋巴細胞或免疫力強的健康供者的淋巴細胞，經體外活化、擴增后，再回輸至患者體內以發揮抗腫瘤作用的一種治療手段。自然殺傷（natural killer，NK）細胞是人體內重要的免疫細胞，負責殺傷老化細胞、感染病毒的細胞、腫瘤細胞等異常細胞。NK 細胞的這種天然殺傷活性無需抗原致敏，且無主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）限制性，能自動識別并攻擊受病毒感染的細胞、腫瘤細胞等異常細胞。NK細胞由于其獨特的抗腫瘤特點，在腫瘤免疫治療中的作用越來越受到重視[4-8]。人體外周血中NK 細胞的數量較少，且腫瘤患者體內NK 細胞的活性較低，故需要在體外活化和擴增NK 細胞，使其達到一定數量后再回輸至患者體內，這樣才能發揮更好的抗腫瘤作用。本研究主要是探討NK 細胞在體外培養過程中細胞數量、免疫表型及殺傷活性的變化趨勢。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主 要 儀 器 與 試 劑 ALYS505NK-AC 培 養 液 和ALYS505NK-EX 培養液（由日本CSTI 公司生產），重組人白細胞介素-2（由山東泉港藥業生產），人淋巴細胞分離液（由挪威Axis-shield 公司生產），赫賽汀（由美國Roche 公司生產），淋巴細胞檢測試劑盒CD45/CD56/CD19/CD3（由美國Beckman Coulter 公司生產），K562 細胞株（本實驗室保存），細胞培養袋（由日本Takara 公司生產），倒置顯微鏡（由日本Nikon 公司生產），CytoFLEX 流式細胞分析儀（由美國Beckman Coulter 公司生產），Centrifuge 5810R 離心機（由德國Eppendorf公司生產），240i 二氧化碳培養箱（由美國Thermo Scientific 公司生產）。

1.1.2 實驗對象 采用本中心的NK 細胞無血清培養基，分別對10 份健康人的外周血進行NK 細胞擴增培養，并在培養過程中對相關指標進行檢測。

1.2 方法

1.2.1 外周血NK 細胞的培養 采用無血清培養法對外周血NK 細胞進行擴增培養，方法是：采用密度梯度離心法分離得到外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMCs），用ALYS505NK-AC 培養液對PBMCs 進行重懸處理，將細胞密度調整至（1 ～3）×106/mL后裝入預先用赫賽汀包被好的培養瓶中，并置于37℃、二氧化碳體積分數為5%、飽和濕度的培養箱中進行培養。每隔3 d 用ALYS505NK-EX 培養液對細胞進行補液。

1.2.2 外周血NK 細胞的細胞計數、表型分析及殺傷活性檢測 分別在培養的第0 天、第4 天、第8 天、第12天、第16 天和第20 天對培養標本進行取樣，進行細胞計數和存活率的測定，并用淋巴細胞檢測試劑盒CD45/CD56/CD19/CD3 在流式細胞儀上測定外周血NK（CD3-CD56+）細胞和NKT（CD3+CD56+）細胞的比例。采用臺盼藍染色法對NK 細胞進行活細胞計數并計算細胞的存活率。采用CFSE/PI 雙染法檢測NK 細胞的殺傷活性，具體步驟是：1）標記靶細胞。將K562 細胞濃度調整為1.0×106/mL，加入熒光染料羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰 亞 胺 酯（carboxyfluorescein diacetate n-succinimidyl ester，CFSE）對靶細胞進行標記，在37 ℃下避光染色20 min。加入5 倍體積預冷的含10% 胎牛血清的RPMI1640 培養液，冰浴5 min，終止染色，調整細胞濃度至1.0×105/mL。2）共培養。加入1.0×106/mL 的NK細胞作為效應細胞，效應細胞與靶細胞的比例為10:1，同時設靶細胞自然凋亡對照孔，在250 g 的離心力下離心5 min 后置于37℃、二氧化碳體積分數為5%、飽和濕度的培養箱中孵育4 h。3）標記細胞。采用熒光染料碘化丙啶（propidium iodide，PI）標記死亡細胞，在24℃下避光染色30 min 后用生理鹽水洗去未結合的染料。4）上機檢測及分析。采用CytoFLEX 流式細胞儀對外周血NK 細胞進行檢測及數據分析。計算公式：靶細胞的殺傷率=（靶細胞的死亡率-靶細胞的自然凋亡率）/（100- 靶細胞的自然凋亡率）×100%。

1.3 統計學方法

用GraphPad Prism 6 統計軟件處理本研究中的數據，重復測量資料用±s表示，采用重復測量資料方差分析，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血NK 細胞的形態學觀察

在培養的第2 天～第3 天，培養基中開始形成細胞集落，隨著培養時間的延長，細胞集落逐漸變大，數量也隨之增多，肉眼可見許多小顆粒懸浮物，在顯微鏡下可見這些小顆粒懸浮物為懸浮生長的細胞克隆團。

2.2 外周血NK 細胞的免疫表型變化

采用流式細胞技術進行檢測的結果顯示，隨著培養時間的延長，外周血NK 細胞中CD3-CD56++細胞和CD3+CD56+細胞的有效細胞數量逐漸增加，至第16 天后出現下降的趨勢。不同培養時間點（第4 天、第8 天、第12 天、第16 天和第20 天）外周血NK 細胞中CD3-CD56++細胞和CD3+CD56+細胞的比例相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖1、圖3、表1。

圖1 不同培養時間NK 細胞的比例

2.3 外周血NK 細胞的擴增效率和殺傷活性

在培養的第8 天～第20 天（快速增殖期），不同培養時間點（第8 天、第12 天、第16 天和第20 天）外周血NK 細胞的存活率均＞95%。細胞總數由培養初始的（1.15e×107±0.10×107）個，至第20 天達到了（4.78×109±1.63×109）個，擴增了（602.20±210.70）倍。不同時間點（第4 天、第8 天、第12 天、第16 天和第20 天）外周血NK 細胞的擴增倍數相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。在效靶細胞比例為10:1、孵育4 h 的條件下，檢測各時間點外周血NK 細胞的殺傷活性發現，不同培養時間點（第4 天、第8 天、第12 天、第16 天和第20 天）外周血NK 細胞的殺傷活性相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖2、表1。

圖2 不同培養時間外周血NK 細胞的殺傷活性

2.4 外周血NK 細胞擴增效率及殺傷活性的變化趨勢

隨著培養時間的延長，外周血中NK 細胞的數量逐漸增加，不同培養時間點（第4 天、第8 天、第12 天、第16 天和第20 天）外周血NK 細胞的數量相比，差異有統計學意義（P＜0.05）；NK 細胞的殺傷活性從培養第8 天開始升高，至第12 天達到峰值后開始下降，不同培養時間點（第4 天、第8 天、第12 天、第16 天和第20 天）外周血NK 細胞的殺傷活性相比，差異有統計學意義（P＜0.05）；NK 細胞的比例先增加后下降（培養至16 d 達到峰值后開始下降），其比例的下降趨勢較殺傷活性的下降趨勢滯后。不同培養時間點（第4 天、第8 天、第12 天、第16 天和第20 天）外周血NK 細胞的比例相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表1、圖3。綜合考慮外周血NK 細胞的存活率、細胞數量、細胞比例和殺傷活性等因素，發現培養第12 天～第16天外周血NK 細胞的綜合質量較優，此時間段為患者回輸NK 細胞較為合適。

表1 不同培養時間外周血NK 細胞的擴增效率、比例和殺傷活性（n=10，± s）

表1 不同培養時間外周血NK 細胞的擴增效率、比例和殺傷活性（n=10，± s）

注：10:1 指效靶細胞比例為10:1，4 h 指孵育時間為4 h。

指標 第4 天 第8 天 第12 天 第16 天 第20 天 F 值 P 值數量（×108） 0.58±0.19 3.74±1.15 12.59±3.19 24.62±6.23 47.77±16.28 8.236 0.025擴增倍數 5.35±1.63 48.31±16.09 155.10±37.36 293.90±63.27 602.20±210.70 6.503 0.041 CD56+細胞的數量（%） 47.25±3.27 61.76±2.74 70.07±3.23 73.20±4.90 65.69±6.60 31.170 ＜0.001殺傷活性（%）（10:1，4 h） 16.95±4.24 25.26±5.63 34.21±4.59 28.07±3.27 24.50±3.21 6.587 0.010

3 討論

NK 細胞可通過釋放顆粒酶和穿孔素等殺傷性介質及分泌大量細胞因子直接攻擊靶細胞，或通過抗體依賴的細胞毒作用殺傷腫瘤細胞，或通過誘導Fas/Fasl 和腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TNF-related apoptosisinducing ligand，TRAIL）分子使靶細胞凋亡，進而可起到抗腫瘤的作用[9]。通常情況下，人體內NK 細胞的生存周期較短，一個成年人體內約含有2×109個NK 細胞[10]。通過向惡性腫瘤患者體內輸注經體外活化擴增的NK 細胞，可使其體內NK 細胞的數量提升約兩倍。本研究優化了NK 細胞的體外活化擴增方案，建立了一種NK細胞無血清培養方法，在培養基中只需將白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）的濃度維持在1000 IU/mL，經過約兩周的培養就可使總細胞數達到約600 倍的擴增，其中NK 細胞的比例高達80%。此方法雖然在擴增效率及提取純度方面低于滋養細胞培養法，但能滿足臨床使用的要求，且安全性較高。目前，臨床常用的NK 細胞培養時間一般為14 d 左右[4]。隨著培養時間的延長，雖然NK 細胞的數量會不斷增加，但細胞的殺傷活性會逐漸下降，因此并不是培養時間越長越好。NK 細胞在臨床使用的過程中，受患者自身狀態、醫學檢查、用藥或接受其他治療等因素的影響，經常會出現細胞回輸時間需要提前或推后的情況。為了使患者達到最佳的治療效果，本文深入研究了外周血中NK 細胞數量、比例和殺傷活性的變化趨勢，明確了NK 細胞臨床應用的時間窗。

綜上所述，采用無血清培養法對外周血NK 細胞進行培養時，隨著培養時間的延長，外周血NK 細胞的數量呈逐漸增加的趨勢。外周血NK 細胞的殺傷活性在培養12 d 后出現下降的趨勢。在培養的第12 天～第16 天，NK 細胞的殺傷活性較強，細胞數量較多，細胞純度較高，此階段細胞的質量較好，是臨床應用的最佳時期。采用無血清培養法體外擴增NK 細胞的效率較高。