地西他濱與DNA相互作用的光譜研究

張 璨

（天津生物工程職業技術學院，天津 300462）

DNA 是遺傳信息的貯存和攜帶者，是生命體重要的遺傳物質，也是細胞和病毒的主要組成部分。DNA 上平行堆積的堿基、聚合的陰離子磷酸骨架及兩條由核苷酸鏈形成的大溝、小溝組成了藥物分子識別的位點[1]。研究藥物與DNA 的相互作用有助于闡明藥物的作用機制。地西他濱（Decitabin, 分子式為C8H12N4O4）是一種DNA甲基轉移酶抑制劑。此藥可抑制DNA 甲基轉移酶，減少DNA 的甲基化，從而可起到抑制腫瘤細胞增殖的作用。有研究指出，用地西他濱治療骨髓增生異常綜合征可取得良好的效果[2]。在本文中，筆者主要是研究DNA 對地西他濱的熒光猝滅機制，并通過紫外法和黏度測定法進一步確認地西他濱與DNA 的結合方式。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

本研究中所用的儀器主要包括：Qubit ? Flex 熒光分光光度儀；紫外可見分光光度計（UV-1800）；pHS-s 型pH 計；烏貝路德黏度計；微量注射器；電子分析天平。

1.2 實驗試劑

本研究中所用的試劑主要包括：鯡魚精DNA、地西他濱、鹽酸小檗堿溶液、二次蒸餾水等。

1.3 實驗方法

配制DNA 溶液，方法是：用電子分析天平稱取一定量的鯡魚精DNA（簡稱DNA），加入100 mL 的容量瓶中，并用二次蒸餾水定容至刻度。用紫外可見吸收光譜法確定其濃度和純度，并將其置于0℃～4℃的環境中保存。配制地西他濱溶液，方法是：用電子分析天平稱取一定量的地西他濱，加入100 mL 的容量瓶中，并用二次蒸餾水定容至刻度（使其濃度為10-3mol/L）。將其置于0℃～4℃的環境中保存。配制緩沖溶液：將稀鹽酸滴加到0.1 mol/L 的三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液中，借助pH 計將該溶液的pH 調節至4.0，即制得Tris-HCl緩沖溶液。用微量注射器在10 mL 的容量瓶中依次加入相同劑量的地西他濱溶液及不同劑量的DNA 溶液, 再加入相同量的Tris-HCl 緩沖溶液，加水稀釋至刻度，搖勻靜置，并測定熒光激發光譜和發射光譜。熒光測量的激發波長為241 nm，熒光發射波長為530 nm，激發和發射狹縫均為10 nm。用微量注射器在10 mL 的容量瓶中依次加入相同劑量的DNA 溶液及不同劑量的地西他濱溶液，再加入相同量的Tris-HCl 緩沖溶液，加水稀釋至刻度，搖勻靜置后用烏貝路德黏度計測定黏度。用微量注射器在10 mL 的容量瓶中依次加入相同劑量的地西他濱溶液、DNA 溶液及不同量的KCl 溶液，然后再加入相同量的Tris-HCl 緩沖溶液，加水稀釋至刻度，搖勻靜置后，測定熒光強度。熒光測量的激發波長為241 nm，熒光發射波長為530 nm，激發和發射狹縫均為10 nm。用微量注射器在10 mL 的容量瓶中依次加入相同劑量的鹽酸小檗堿溶液、DNA 溶液及不同劑量的地西他濱溶液，然后再加入相同量的Tris-HCl 緩沖溶液，加水稀釋至刻度，搖勻靜置后，測定熒光強度。熒光測量的激發波長為241 nm，熒光發射波長為530 nm，激發和發射狹縫均為10 nm。

2 結果與討論

2.1 熒光光譜實驗

2.1.1 DNA 存在下地西他濱的熒光發射光譜 本實驗的結果顯示，地西他濱的熒光發射光譜在530 nm 處出現最大發射峰，隨著DNA 的加入，530 nm 處熒光發射峰的熒光強度逐漸降低，說明DNA 和地西他濱可能通過結合形成了復合物。詳見圖1。

圖1 DNA 存在下地西他濱的熒光發射光譜

2.1.2 熒光猝滅機制 本實驗的結果顯示，DNA 對地西他濱的猝滅速率常數遠大于各猝滅劑對生物大分子最大擴散控制的碰撞猝滅常數；在溫度升高后，其猝滅常數基本不變。在地西他濱發生動態猝滅時，其猝滅常數會隨溫度的升高而升高。由此可見，DNA 對地西他濱的熒光猝滅作用并非由分子間動態碰撞引起，而是由二者形成復合物所引起的靜態猝滅作用。

2.1.3 地西他濱與DNA 二元絡合物的組成及其結合常數通過熒光-猝滅分子間的結合常數可推出靜態猝滅熒光強度與猝滅劑的關系[3]。本實驗的結果顯示，在25℃下，地西他濱與DNA 之間的結合常數為2.51×104L·mol-1，結合位點數為1.1151，線性相關系數為0.9986。在40℃下，地西他濱與DNA 之間的結合常數為2.86×104L·mol-1，結合位點數為1.1227，線性相關系數為0.9908。

2.1.4 地西他濱與DNA 結合反應的作用力 不同藥物與DNA 之間相互作用力的類型也不盡相同。藥物與生物大分子最常見的作用力有氫鍵作用力、范德華作用力、靜電作用力、疏水作用力等。有研究表明，可根據熱力學公式計算出藥物與生物大分子之間作用力的熱力學參數，并據此判斷其相互作用力的類型。ΔH ＞0 及ΔS ＞0 可判定為疏水作用力；ΔH ＜0 及ΔS ＞0 可判定為靜電作用力；ΔH ＜0 及ΔS ＜0 可判定為氫鍵作用力或范德華作用力[4]。根據地西他濱與DNA 的結合常數進行計算，可得出二者結合過程的熱力學函數，從而可判定地西他濱與DNA 之間的主要作用力為疏水作用力。

2.2 地西他濱對小檗堿-DNA 體系熒光強度影響的研究

鹽酸小檗堿（又叫黃連素）是一種異喹啉生物堿，由于其與DNA 有較強的相互作用，且可顯示出較好的光敏作用，故可將其作為熒光指示劑進行研究[4]。其原理是在鹽酸小檗堿嵌入DNA 雙螺旋的堿基對之間后，可使原來較弱發射帶的熒光強度增強。本實驗的結果數據證實，隨著地西他濱濃度的增大，小檗堿-DNA 體系熒光強度無明顯的變化。這說明，地西他濱與DNA 之間的結合方式并非嵌入。

2.3 地西他濱與DNA 作用的黏度研究

黏度法是檢測溶液狀態下藥物與DNA 作用模式的重要手段之一。當藥物與DNA 以靜電作用結合時，DNA溶液的黏度無明顯變化；當藥物與DNA 的結合方式為嵌入時，為容納嵌入的配體，DNA 相鄰堿基對的距離會變大，導致DNA 螺旋增長，從而使DNA 溶液的黏度增大[5]。本研究中為進一步確定地西他濱與DNA 的結合方式，用烏貝路德黏度計測定了DNA 溶液在不同濃度地西他濱存在下的黏度變化。即向固定濃度的DNA 溶液中加入不同劑量的地西他濱，并計算其相對黏度。實驗結果顯示，DNA 溶液的相對黏度基本不變。這說明，地西他濱與DNA 之間的結合方式并非嵌入。

2.4 離子強度對地西他濱-DNA 體系熒光強度的影響

某些鹽類陽離子（如K+）與DNA 的磷酸基可通過產生靜電作用的方式發生強烈的相互作用。若地西他濱與DNA 的相互作用為靜電作用，在地西他濱與DNA 溶液中加入K+時，K+會與地西他濱產生競爭，從而可減弱地西他濱與DNA 之間的作用，使熒光猝滅程度減弱。本實驗的結果顯示，當離子強度升高時，地西他濱和鯡魚精DNA 的熒光強度都基本不變，猝滅程度無明顯變化。這表明，地西他濱與鯡魚精DNA 之間的相互作用類型并非靜電作用。詳見圖2。

圖2 離子強度對地西他濱-DNA 體系熒光強度的影響

為進一步確定地西他濱和鯡魚精DNA 之間的作用模式，本實驗用紫外光譜法研究了在不同濃度DNA 存在下地西他濱的圖譜變化。實驗結果顯示，在pH=4.0 的Tris-HC1 緩沖溶液中，地西他濱在194 nm 和238 nm 處有兩個吸收峰。這表明，鯡魚精DNA 的加入未對地西他濱UV 峰的位置產生影響。其在194 nm 處的吸收峰有下降趨勢，而在238 nm 處吸收峰的峰位和峰強均沒有變化。可見，地西他濱與DNA 的結合方式為溝槽結合。詳見圖3。

圖3 不同DNA 濃度下地西他濱的紫外吸收光譜圖

3 小結

本研究采用熒光法和紫外法對DNA 與地西他濱的相互作用進行研究。研究結果表明，在Tris-HCl 緩沖溶液（pH=4.0）中，DNA 對地西他濱熒光(530 nm) 產生了猝滅作用。根據其猝滅常數未隨溫度升高而變化，得出了其熒光猝滅機制是由形成復合物而引起的靜態猝滅。進一步通過計算，分析出DNA 與地西他濱的相互作用類型為疏水作用。根據地西他濱對配合物熒光強度的影響和與DNA 作用的黏度變化情況可知，地西他濱與DNA 的結合方式并非嵌入結合。由離子強度對地西他濱-DNA體系熒光強度的影響可知，地西他濱與DNA 的相互作用類型并非靜電作用。結合紫外光譜變化情況可知，地西他濱與DNA 的結合方式為溝槽結合。