PTBP1在膠質瘤進展中的作用研究

王克朕，蘭春根，谷峰，馬勇杰

（天津醫科大學腫瘤醫院1.腫瘤細胞生物學實驗室；2.乳腺病理科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心，天津300060）

膠質瘤是成年人中最常見，同時致死率最高的腦部腫瘤[1-2]。盡管現階段對膠質瘤的認識日漸加深，包括手術切除、放療和化療在內的治療手段已取得長足進步，但由于膠質瘤的高侵襲性，治療效果仍不令人滿意[3-6]。進一步探索膠質瘤惡性進展過程中的關鍵分子對于實現膠質瘤患者的精準治療具有重要價值。多聚嘧啶區結合蛋白1（PTBP1）是核不均一性核糖核蛋白（hnRNP）家族的成員，參與調控多種分子的轉錄后修飾[7-8]。研究表明，PTBP1在正常神經發育過程中表達受到抑制，而在多種腦腫瘤中高表達[9-10]，但是其在膠質瘤惡性進展中發揮的功能尚不明確。本研究利用多個數據庫分析PTBP1在膠質瘤和癌旁組織中的表達水平及其與膠質瘤的組織學級別和患者預后的關系；并通過慢病毒感染篩選出穩定敲低PTBP1的LN229細胞株，進而探究PTBP1蛋白對膠質瘤細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞系和主要試劑 人膠質瘤細胞系LN229和人胚胎腎細胞系HEK-293T（American Type Culture Collection），胎牛血清（GIBCO公司），DMEM細胞培養基（GIBCO公司），Transwell小室（Corning公司），Matrigel基質膠（Corning公司），聚凝胺（polybrene，Sigma公司），遺傳霉素（G418，Solarbio公司），EdU細胞增殖試劑盒（碧云天生物技術有限公司），PCR引物（生工生物工程股份有限公司），膠回收試劑盒（TaKaRa公司），限制性內切酶BamH1-HF和EcoR1-HF（NEB公司），質粒小提試劑盒（天根生物科技有限公司），Trizol（Invitrogen公司），MMLV逆轉錄酶和SYBR Green（TaKaRa公司），PTBP1抗體（Santa Cruz公司），β-actin抗體（Santa Cruz公司）。

1.2 研究對象 下載并整理GTEx（Genotype-Tissue Expression）數據庫中的正常腦組織樣本信息，選取資料完善的1 152例正常腦組織樣本的轉錄組數據和臨床信息進行分析。下載并整理TCGA（The Cancer Genome Atlas）數據庫中的膠質瘤樣本信息，選取資料完善的603例膠質瘤樣本（GradeⅡ：n=213，GradeⅢ：n=238，GradeⅣ：n=152）的轉錄組數據和臨床信息進行分析。下載并整理CGGA（Chinese Glioma Genome Atlas）數據庫中的膠質瘤樣本信息（數據集ID：mRNAseq_325），選取資料完善的309例膠質瘤樣本（GradeⅡ：n=98，GradeⅢ：n=74，GradeⅣ：n=137）的轉錄組數據和臨床信息進行分析。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 LN229和HEK-293T細胞系用含10%胎牛血清的DMEM培養，放置在含有5%CO2的37℃恒溫培養箱中。

1.3.2 穩定敲低PTBP1重組質粒的構建 將引物（上游引物：5′-GATCCGCGTGAAGATCCTGTTCAATACTCGAGTATTGAACAGGATCTTCACGCTTTTTG-3′；下游引物：5′-AATTCAAAAAGCAAAGTGCAACGTATTGTTACTCGAGTATTGAACAGGATCTTCACGCG-3′）退火，用限制性內切酶BamH1-HF和EcoR1-HF對質粒空載體pLVX-scramble進行雙酶切，直接與退火產物連接，轉化DH5α感受態宿主細菌，最終提取質粒，然后進行雙酶切和測序驗證，得到pLVX-shPTBP1重組質粒。

1.3.3 慢病毒載體的包裝 在10 cm培養皿中提前鋪好HEK-293T細胞，待細胞貼壁并長到80%~90%時，將目的質粒、包裝質粒1和包裝質粒2共轉染進HEK-293T細胞，6~8 h換液，48 h收集上清于離心管中，3 000 r/min離心5 min，取上清在-80℃保存。

1.3.4 細胞的感染 在3.5 cm培養皿中鋪入約30%~40%的LN229細胞，次日待細胞貼壁后移除培養液，重新加入1 mL新培養液和1 mL制備好的病毒液，以及2μL polybrene（10 mg/mL），5 h后更換培養液。慢病毒感染48 h后加入G418（2 g/L）進行藥篩，藥篩1周后即可進行后續驗證。

1.3.5 Western印跡檢測 移除細胞培養液，加入PBS沖洗3次，將PBS移除干凈，加入裂解液于冰上裂解細胞蛋白，測定濃度并定量后進行SDS-PAGE變性電泳（膠濃度：10%），然后轉到硝酸纖維素膜上，用5%的脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗（β-actin：蛋白上樣量：40μg，一抗稀釋比例：1∶5 000；PTBP1：蛋白上樣量：40μg，一抗稀釋比例：1∶1 000）4℃過夜孵育。孵育完成后用TBST洗膜3次，每次10 min，然后避光加入二抗（稀釋比例：1∶8 000），室溫孵育50 min。孵育完成后用TBST洗膜4次，每次10 min。使用雙色紅外激光成像系統進行曝光。

1.3.6 RNA提取和RT-qPCR 使用Trizol試劑從LN229細胞中提取總RNA，并通過M-MLV逆轉錄酶逆轉得到cDNA。以cDNA為模板，使用SYBR Green進行RT-qPCR對PTBP1的mRNA表達進行定量。以GAPDH的表達量作為對照。使用△△Ct法計算差異倍數。

1.3.7 EdU實驗 將細胞接種于12孔板，使其匯合度小于10%。移除細胞培養液，加入PBS沖洗3次，移除PBS，加入含有10%胎牛血清的新培養液，然后加入10μmol/L EdU，在含有5%CO2的37℃恒溫培養箱中孵育2 h。孵育完成后移除培養液并用PBS沖洗3次，將PBS移除干凈后加入4%的多聚甲醛（PFA），室溫固定30 min。固定完成后移除4%的PFA并用PBS沖洗3次，然后加入DAPI（PBS稀釋，稀釋比例1：1 500）染色10 min。移除DAPI，用PBS沖洗3次后在倒置顯微鏡下觀察細胞染色情況并拍照計數。

1.3.8 細胞遷移實驗 在Transwell小室上室中加入200μL無血清的DMEM培養基重懸的5×104個細胞，下室加入500μL含有2%胎牛血清的DMEM培養基，置于含有5%CO2的37%恒溫培養箱中培養12 h后取出，用棉簽小心擦拭掉上室細胞，然后將Transwell小室用4%的PFA溶液固定30 min，用吉姆薩染液染色45 min，用DDW清洗3次后封片并在顯微鏡下拍照計數。

1.3.9 細胞侵襲實驗 在Transwell小室上室中鋪入用無血清的DMEM培養基7：1稀釋的Matrigel基質膠35μL，置于37℃凝膠1 h以上后取出，上室加入200μL無血清的DMEM培養基重懸的1×105個細胞，下室加入500μL含有2%胎牛血清的DMEM培養基，置于含有5%CO2的37%恒溫培養箱中培養24 h后取出，用棉簽小心擦拭掉上室細胞，然后將Transwell小室用4%的PFA溶液固定30 min，用吉姆薩染液染色45 min，用DDW清洗3次后封片并在顯微鏡下拍照計數。

1.4 統計學處理 使用SPSS 22.0統計軟件進行統計學分析，正態分布的計量數據用±s表示，正態、方差齊資料組間比較采用Wilcoxon符號秩檢驗和t檢驗，Kaplan-Meier分析患者的預后情況，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PTBP1在膠質瘤中的表達 數據顯示，與正常腦組織相比，膠質瘤組織中PTBP1的mRNA水平升高（圖1）。PTBP1 mRNA在膠質瘤中的表達隨著組織學級別的升高而升高（GradeⅣ＞GradeⅢ＞GradeⅡ），即與組織學級別呈正相關（圖2）。

圖1 PTBP1在膠質瘤和正常腦組織中的表達Fig 1 Theexpression of PTBP1 in glioma and normal brain tissues

圖2 PTBP1在不同WHO分級的膠質瘤中的表達Fig 2 Theexpression of PTBP1 in different WHO gradesof glioma

2.2 PTBP1的表達與膠質瘤患者預后的關系 如圖3所示，Kaplan-Meier生存分析結果表明PTBP1高表達患者擁有更短的總生存期（OS），預后更差，即PTBP1的高表達與膠質瘤患者的不良預后呈正相關。

圖3 PTBP1的表達與膠質瘤患者預后的關系Fig 3 Relationship between the expression of PTBP1 and the prognosisof glioma patients

2.3 穩定敲低PTBP1的膠質瘤細胞系的構建及驗證 人膠質瘤細胞系LN229用慢病毒感染后，獲得穩定敲低目的蛋白的細胞株shPTBP1/LN229及對照scr/LN229。Western印跡和RT-qPCR結果顯示PTBP1蛋白和mRNA在LN229細胞中穩定敲低（圖4），mRNA水平的差異有統計學意義（P＜0.001）。

圖4 LN229細胞系中PTBP1的表達情況Fig 4 Theexpression of PTBP1 in LN229 cell line

2.4 敲低PTBP1對膠質瘤細胞增殖能力的影響 結果表明，shPTBP1/LN229的增殖能力弱于對照組細胞系（圖5），差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖5 Ed U實驗檢測敲低PTBP1對LN229細胞增殖能力的影響Fig 5 Effect of PTBP1 knockdown on thecell proliferation ability of LN229 by EdUassay

2.5 敲低PTBP1對膠質瘤細胞遷移、侵襲能力的影響 結果表明，shPTBP1/LN229遷移的細胞數目少于對照組細胞系（圖6），差異有統計學意義（P＜0.001）。另外，shPTBP1/LN229侵襲的細胞數目也少于對照組細胞系（圖7），差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖6 細胞遷移實驗檢測敲低PTBP1對LN229細胞遷移能力的影響Fig 6 Effect of PTBP1 knockdown on thecell migration ability of LN229 by migration assay

圖7 細胞侵襲實驗檢測敲低PTBP1對LN229細胞侵襲能力的影響Fig 7 Effect of PTBP1 knockdown on thecell invasion ability of LN229 by invasion assay

3 討論

膠質瘤是源自神經上皮的腫瘤，占顱腦腫瘤的40%～50%，是最常見的原發性顱內腫瘤。年發病率為3人/10萬人～8人/10萬人。膠質瘤一般呈侵襲性生長，總體療效不佳，尤其是具有高度間變的生長特性的高分級膠質瘤，術后復發快且預后差，是神經外科治療中最棘手的難治性腫瘤之一。現階段，隨著分子生物學、免疫學及基因組學的發展，人們對其發病機制有了更深的認識，靶向治療、免疫治療等內科綜合治療有望成為膠質瘤極具潛力的治療方式。所以，深入探索膠質瘤惡性進展過程中的關鍵分子對于提高膠質瘤治療效果，實現膠質瘤患者的精準治療具有重要意義。

hnRNP家族包括一大類RNA結合蛋白，它們在核酸代謝的多個方面發揮作用，包括選擇性剪接、維持mRNA穩定性以及轉錄和翻譯調節。盡管在結構域組成和功能上不盡相同，但是多種hnRNP都具有相似的特征[11]。近年來越來越多的研究發現，hnRNP蛋白在許多腫瘤中高表達。已有報道發現，在非小細胞癌中可以監測到hnRNP A2/B1單克隆抗體，大部分肺癌細胞系中高表達hnRNP A2/B1，且在肺癌早期表達高于晚期，因此有學者推測它可以用作監測肺癌早期發生的血清腫瘤標志物[12]。此外，還有報道發現，hnRNP K、E1及E2可以促進原癌基因c-myc mRNA的翻譯；hnRNPK也在腫瘤細胞擴散過程中起限速作用[13]。以上研究結果表明，hn－RNP家族作為腫瘤標志物可能擁有良好的前景。

PTBP1作為hnRNP家族的一員，是一種已知的轉錄后基因表達調節因子，可以調控mRNA的剪接、翻譯、穩定性和定位，具有多種與RNA代謝相關的分子功能[14-15]。在腫瘤細胞中，糖酵解是PTBP1參與的重要過程之一[16]。PTBP1促進丙酮酸激酶（PK）M2亞型的表達，同時降低PKM1的表達，導致腫瘤細胞從氧化磷酸化到糖酵解的代謝轉變，最終影響腫瘤發生[17-18]。另外，PTBP1通過與自噬相關蛋白10（ATG10）的直接相互作用負反饋調節其表達水平，在結腸癌細胞的遷移和侵襲中發揮關鍵作用[19]。敲降PTBP1能夠促進細胞分化周期蛋白（CDC42）的抑癌亞型CDC42-v2的表達，進而影響卵巢癌的惡性進展[20]。此外，PTBP1通過調控可變剪接以及與多種分子相互作用，在膠質瘤的惡性進展中發揮作用。已有研究證實，PTBP1能夠通過其內部核糖體進入位點（IRES）樣元件調節RNA特異性腺苷脫氨酶1（ADAR1）p110的翻譯模式，進而影響膠質瘤細胞的增殖[21]。膠質瘤組織和細胞中長鏈非編碼RNA（lncRNA）PVT1和PTBP1表達增強，miR-128-1-5p表達降低。PVT1的下調或miR-128-1-5p的上調通過抑制PTBP1的表達，促進膠質瘤細胞的凋亡[22]。PTBP1的升高介導人膜聯蛋白A7（ANXA7）外顯子的可變剪接，削弱其腫瘤抑制功能并促進膠質瘤的轉移[23]。另外，絲氨酸和精氨酸富含剪接因子3（SRSF3）通過與PTBP1及其同源蛋白多聚嘧啶區結合蛋白2（PTBP2）相互作用，促進膠質瘤細胞的遷移、侵襲[24]。

本研究利用多個數據庫以及生物信息學分析探究了PTBP1在膠質瘤中的表達情況，發現其在膠質瘤中高表達并與膠質瘤的組織學級別和膠質瘤患者的不良預后呈正相關。此外，本研究通過感染慢病毒的方法在膠質瘤細胞系中敲低PTBP1，利用功能學實驗證實了PTBP1蛋白可以促進膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

綜上所述，PTBP1在膠質瘤中的高表達及其在膠質瘤細胞系中發揮的促癌功能，提示PTBP1具有在膠質瘤中作為生物標志物和重要治療靶點的潛力，其在膠質瘤中發揮功能的具體分子機制具有重要研究價值。