利拉魯肽對人胰島淀粉樣多肽聚集性及胰島細胞毒性的影響

趙夕琛，靳育靜，孫曉薇，李代清，朱鐵虹

（1.天津醫科大學總醫院內分泌與代謝科,天津300052；2.天津醫科大學朱憲彝紀念醫院代謝病科,天津300134）

人胰島淀粉樣多肽（hIAPP）是胰島β細胞分泌的淀粉樣物質，也稱為人胰淀素[1-3]。已有研究表明，hIAPP聚集過程的中間產物對胰島細胞具有毒性作用，且為2型糖尿病患者胰島細胞功能異常及凋亡的主要原因之一[4-7]，而臨床上尚缺乏能有效抑制hIAPP聚集的藥物。最近研究表明，利拉魯肽可以減少阿爾茲海默病模型鼠腦內的Aβ淀粉樣蛋白沉積與相關炎癥反應，改善鼠的記憶功能[8-9]。Aβ與hIAPP具有相似的二級折疊結構與致病機制。因此本研究主要探討利拉魯肽是否可以通過抑制hIAPP聚集并減少hIAPP相關的胰島細胞損傷。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 250～300 g雄性Wistar大鼠購自中國人民解放軍醫學科學院衛生學環境醫學研究所動物實驗中心，動物級別為SpF級。

1.2 主要試劑 膠原酶（Ⅴ型）、hIAPP購自Sigma公司；Annexin-V/PI熒光染色試劑盒購自萬類生物有限公司；利拉魯肽注射液由諾和諾德公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 硫磺素T實驗 新鮮配置硫磺素T、hIAPP的母液，分別為1 mmol/L與100μmol/L。在黑色96孔酶標板中，每孔中加入相應體積的母液和PBS緩沖液構建100μL反應體系：硫磺素T終濃度為10μmol/L，hIAPP終濃度為5μmol/L，單獨或聯合相應濃度利拉魯肽（500 nmol/L和5μmol/L）共同孵育。酶標板中的體系液按照上述比例配置完畢后，置于全波長掃描多功能讀數儀上，37℃孵育。每5 min搖10 s，靜置10 s后讀數，記錄在440 nm激發波長和485 nm發射波長下的熒光強度。每組設立4個復孔，本底孔為未加藥物僅含硫磺素T的檢測液，各組最終熒光強度為實測熒光數值與本底孔熒光數值的差值。

1.3.2 磷鎢酸負染滴染法電鏡實驗 于EP管中分別配置3組體系：20μmol hIAPP（人胰淀素）、20μmol hIAPP和2μmol利拉魯肽、20μmol hIAPP和20μmol利拉魯肽。將反應液室溫過夜后，在37℃溫箱中孵育2 h后，取20μL待檢測的孵育樣品滴在200目-碳包銅網上，靜置3 min，用濾紙從銅網周邊小心吸干未吸收的樣品，再用200μL 1%磷鎢酸溶液染色3 min，之后用濾紙吸干銅網周邊多余染液，室溫晾干或白熾燈下烤干后利用透射電子顯微鏡（Hitachi-HT7700）在180 KV加速電壓下檢測各組胰淀素淀粉樣纖維形成情況。

1.3.3 大鼠胰島分離與培養 10%水合氯醛經腹腔注射麻醉Wistar大鼠，以75%乙醇消毒皮膚，無菌剖腹，從膽總管進針，逆行緩慢注入4℃預冷的膠原酶p（0.8 g/L）8～10 mL，使胰腺充分膨脹。剪心放血處死大鼠，剝離出胰腺組織，快速將完整胰腺放入含有3 mL 4℃預冷膠原酶p的50 mL離心試管中。37℃水浴消化10~15 min，振蕩使其呈細砂狀，加入4℃含10%新生牛血清（FBS）的Hanks液約30 mL，終止消化，冰浴5 min待靜置分層后小心吸棄上層液體，再次加入40~50 mL冰Hanks液，重復2次。于體視鏡下手工挑取形狀規則的圓形或橢圓形的胰島細胞團。最后將分離純化好的胰島細胞團加入含有100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素、10%胎牛血清、10 mmol/L Hepes、11.1 mmol/L葡萄糖的RPMI1640培養液中，5%CO2、37℃培養箱中培養。

1.3.4 采用臺盼藍以染色鑒定胰島的活性 在96孔板中將0.4%的臺盼藍溶液與含有胰島細胞的培養基1∶9混合，10 min內鏡下觀察細胞死亡情況。細胞損傷或死亡時，臺盼藍可穿透變性的細胞膜，與解體的DNA結合，使其著色，而活細胞能阻止染料進入細胞內。死亡細胞被染成藍色，活細胞不著色。

1.3.5 細胞分組 將獲取的胰島簡單隨機化分為3組，每組15個胰島：空白對照組（NC）；胰淀素組（10μmol/L hIAPP）；胰淀素+利拉魯肽組（10μmo/L hIAPP+100 nmol/L Lira）。

1.3.6 Annexin-V/PI熒光染色法檢測胰島細胞的凋亡 按照試劑說明，配好Annexin-V/PI凋亡染色液（250μL Binding buffer，5～10μL Annexin V-FITC，10μL propidium Iodide），加入到干預12 h后的胰島中，室溫避光孵育15 min，隨即進行熒光顯微鏡觀察。正常活細胞無著色，細胞的早期凋亡呈綠色熒光，細胞晚期凋亡與壞死紅色熒光。用Imageproplus7.0軟件分析計算細胞凋亡的比率。

1.3.7 實時熒光定量檢測mRNA表達水平 胰島細胞處理完成后，Trizol法提取胰島的RNA，根據Thermo First Strand cDNA Synthesis Kit進行反轉錄反應，合成cDNA第1鏈。然后采用熒光法進行RT-PCR擴增反應，所用試劑盒為生工Sybr-Green qPCR Master Mix（2×）。按照說明書完成體系后瞬時離心，放入羅氏LightCycler96熒光定量PCR儀進行PCR擴增。結果采用2-△△CT相對定量比較，以β-actin為內參照基因進行標準化[10]，見表1

表1 PCR中基因引物序列Tab 1 Primer sequencesof genesin the PCR

1.4 統計學處理 采用SPSS22.0軟件分析，正態分布的計量資料采用±s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，3組以上組間比較采用單因素方差分析LSD法檢驗。非正態分布的計量資料采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 利拉魯肽對hIAPP聚集的影響

2.1.1 硫磺素T實驗結果 5μmol/L胰淀素單獨孵育時，熒光于1.6 h左右開始上升，并逐漸增加，3.4 h后平穩。動力學曲線呈“S”型。5μmol/L胰淀素與500 nmol/L的利拉魯肽（濃度比10:1）共同孵育后，熒光信號直到2.5 h后才開始上升，出現延遲。5μmol/L胰淀素與5μmol/L利拉魯肽（濃度比1:1）孵育后，幾乎檢測不到胰淀素的聚集信號。胰淀素的聚集信號減弱，未見明顯上升（圖1）。

圖1 硫磺素T染色實驗結果Fig 1 Reswltsof thioflavin T assays

2.1.2 透射電鏡結果 20μmol hIAPP單獨孵育可見大量纖維狀聚集物質，表明其聚集性良好（圖2A）；但是20μmol hIAPP和2μmol利拉魯肽（濃度比10∶1）共同孵育后纖維數量明顯減少，并且聚集物形態較模糊且短小（圖2B）；20μmol hIAPP和20μmol利拉魯肽（濃度比1∶1）共同孵育后，無法找到hIAPP所聚集的纖維裝結構（圖2C）。

2.2 胰島分離后的活性檢測 臺盼藍染色結果如圖3所示：新分離的胰島細胞團大小不一，呈圓形或卵圓形，大多數胰島細胞團胞膜完整，折光性好。胰島分離過夜后，臺盼藍染色顯示胰島細胞膜完整活力良好。

圖3 正常胰島與臺盼藍染色后細胞形態Fig 3 The natural islet and cell morphology after Trypan blue excluding test

2.3 不同干預組胰島細胞炎癥相關因子的表達與分泌 熒光定量結果如圖4所示：與空白對照組相比，胰淀素組的白細胞介素（IL）-1、腫瘤壞死因子（TNF）、單核細胞趨化蛋白-2（CCL-2）基因的mRNA表達均增加，分別為3.65±0.14、2.41±0.29、3.65±0.44；利拉魯肽干預后IL-1、TNF、CCL-2基因的mRNA表達均下降，分別為1.44±0.12，1.36±0.18，1.33±0.17，差異具有統計學意義（F=429.68、48.79、153.39,P均＜0.05），見表2。

圖4 不同干預組炎癥相關基因IL-1、TNF、CCL-2 mRNA的表達Fig 4 ThemRNA expression of theinflammatory factors,including IL-1,TNF and CCL-2 in different group

2．4 同干預組胰島細胞凋亡及凋亡相關基因表達的變化 Annexin-V/PI熒光染色如圖5A所示，10μmol的hIAPP干預24 h后，胰島細胞凋亡增加了22.9倍（17.16%vs.0.75%）；利拉魯肽干預后凋亡顯著減少（3.33%vs.17.16%），差異具有統計學意義（F=514.34，P＜0.05）。

RT-PCR結果如圖5B所示：與空白對照組相比，胰淀素組促凋亡基因Bax mRNA相對表達量增加（1.21±0.05 vs.1.00±0.05），抗凋亡基因Bcl-2 mRNA相對表達量顯著下降（0.51±0.12 vs.1.00±0.09），差異具有統計學意義（P均＜0.05）；與胰淀素組相比，利拉魯肽組Bax mRNA表達沒有減少（1.20±0.05 vs.1.21±0.05），抗凋亡基因Bcl-2表達增加（0.78±0.08 vs.0.51±0.12），差異具有統計學意義（P均＜0.05），見表2。

表2 各組胰島細胞凋亡相關基因的變化（±s）Tab 2 Comparison of apoptosisrelated genesin each groups（±s）

表2 各組胰島細胞凋亡相關基因的變化（±s）Tab 2 Comparison of apoptosisrelated genesin each groups（±s）

注：IL-1:白細胞介素-1；TNF:腫瘤壞死因子；CCL-2:單核細胞趨化蛋白-2；NC:空白對照組；hIAPP:胰淀素組；hIAPP+Lira：胰淀素+利拉魯肽組

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圖5 各組細胞凋亡情況Fig 5 Theapoptosisof each groups

3 討論

本研究結果提示hIAPP本身具有聚集性，并且與胰島細胞共同孵育時，促進炎癥因子表達、細胞凋亡，以上均表明hIAPP對胰島細胞的毒性作用，與之前研究一致[3，11]。利拉魯肽可以濃度依賴性抑制hIAPP自我聚集，并且與hIAPP共同孵育胰島細胞時，炎癥與細胞凋亡減少，對胰島細胞具有一定保護作用。

與糖尿病類似，阿爾茲海默病的是一種蛋白沉積性疾病，其主要構成成分為Aβ多肽，導致靶器官的損害。最近，在阿爾茲海默病的實驗研究中發現：利拉魯肽的早期干預可以減少Aβ寡聚體水平，減少阿爾茲海默病模型鼠腦內斑塊樣沉積，從而改善鼠的記憶功能[12]。Park等[13]以人胰島為體外模型發現，胰高血糖素樣肽（GLP）-1類藥物可以使胰島淀粉樣寡聚體及蛋白的沉積減少。利拉魯肽是否可以直接通過抑制多肽的自我聚集或改變其動力學曲線，減少寡聚體的數量或其纖維形成尚不清楚。本研究采用硫磺素T熒光實驗觀察hIAPP的聚集動力學，該聚集性試驗參照IAPP相關分子抑制實驗采用常規比例[14-15]，細胞實驗采用利拉魯肽常用細胞學濃度[16-17]，發現胰淀素與利拉魯肽以10:1分子濃度共同孵育時，胰淀素聚集過程延緩，提高利拉魯肽濃度（1:1）后，胰淀素未出現明顯聚集，動力學曲線由S型變為直線型。并且進一步透射電鏡的實驗結果同樣顯示了利拉魯肽可以濃度依賴性抑制hIAPP自我聚集的作用：利拉魯肽與人胰淀素共同孵育后纖維數量明顯減少。提示利拉魯肽抑制了hIAPP的聚集。研究顯示艾塞那肽不能抑制胰淀素聚集[18]，利拉魯肽與其不同的是分子中獨特的疏水作用脂肪酸側鏈[19]，或許使其具有抑制胰淀素聚集潛能。進一步的分子結構相互作用的研究將有助于胰淀素自我折疊過程的理解以及抗聚集類藥物的研發。

本課題組既往研究顯示：hIAPP造成的胰島細胞凋亡與炎癥損傷有關,IL-1信號通路在其中發揮了重要作用[11]。利拉魯肽可以減少阿爾茲海默病的β-淀粉樣斑塊相關的炎癥損傷[8-9]。本次實驗結果顯示在利拉魯肽與hIAPP共同孵育時，IL-1、TNFα、CCL-2炎癥因子表達下降。既往細胞學、動物學及臨床試驗也表明利拉魯肽具有一定抗炎作用。利拉魯肽可以與GLP-1受體結合，通過激活細胞內PKA通路減少炎癥因子的表達，從而起到細胞保護作用[20]。然而，本研究發現在體外相對獨立環境下，利拉魯肽可以直接抑制胰淀素的聚集，因此減少hIAPP聚集過程的毒性產物也許是利拉魯肽發揮細胞保護作用的重要原因之一。

本實驗中經hIAPP孵育后，胰島細胞凋亡比率增加，Bax mRNA表達增加，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達下降。提示胰淀素導致細胞凋亡增加。hIAPP可改變細胞膜的通透性，增加內質網應激以及激活降鈣素受體等影響胰島細胞的功能及存活[4、21-22]。利拉魯肽孵育后，除炎癥因子表達下降外，抗凋亡基因Bcl-2表達增加，細胞凋亡比率減少。hIAPP相關的細胞損傷作用與其聚集性密切相關，利拉魯肽是否直接通過抑制其聚集發揮作用或間接通過抗炎等機制保護胰島細胞尚需要更深入研究。

總之，hIAPP可以造成胰島細胞炎癥損傷，增加胰島細胞凋亡，利拉魯肽可直接抑制胰淀素聚集，并減少IL-1、TNFα、CCL-2炎癥因子表達，增加Bcl-2抗凋亡基因，發揮胰島細胞保護作用，為利拉魯肽與淀粉樣沉積物間的關系提供基礎研究證據及新思路。