臍帶采集液中抗生素的合理選擇

史麗，郁春艷，李巖，許現輝，楊棟林，沈洋洋，鄧為民

（1.天津醫科大學基礎醫學院免疫學系，國家教育部免疫微環境與疾病重點實驗室，天津300070；2.協和干細胞基因工程有限公司，天津300384；3.中國醫學科學院血液學研究所血液病醫院，天津300020）

間充質干細胞（MSCs）是成體干細胞的一種，具有自我更新、高度增殖和多向性分化潛能[1-2]。研究表明MSCs在神經系統疾病、血液系統疾病、糖尿病等疾病的治療中應用前景廣闊[3-10]。目前，骨髓被認為是MSCs的經典來源，人臍帶間充質干細胞（human umbilical cord mesenehymal stem cells，HUCMSCs）因具有數量豐富、繁殖力強、安全可靠、免疫原性低、治療疾病種類多、取材方便等優點被認為是替代骨髓源MSCs的理想選擇[11-13]。然而在臍帶采集過程中，臍帶污染的風險較高，因此如何控制臍帶污染成為HUCMSCs應用中一個亟待解決的問題。本研究對臍帶間充質公共庫386份微生物培養陽性標本進行鑒定和藥敏分析，選擇敏感性較高的抗生素加入培養基中，觀察其對HUCMSCs生長、增殖和多向誘導分化的影響，為臍帶采集液中抗生素的合理添加提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料 菌株來源為386份臍帶采集液微生物培養陽性標本。天津市中心婦產科醫院采集的1 562份臍帶，放入臍帶采集液中保存，送至臍帶間充質公共庫；HUCMSCs由臍帶間充質公共庫提供。

1.2 儀器 BacT/Alert 3D全自動血培養儀（法國梅里埃公司）；ATB微生物鑒定及藥敏分析儀（法國梅里埃公司）；CO2培養箱（Thermo）；超凈工作臺（北京冠鵬凈化設備有限公司）；OLYMPUS倒置顯微鏡X70（日本OLYMPUS公司）；MultiskanTM FC型酶標儀（Thermo）；Fj-2008全自動免疫計數儀（西安262廠）。

1.3 試劑與藥品 BacT/Alert系統專用需氧厭氧瓶（法國梅里埃公司）；血瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基、沙保羅瓊脂培養基（天津金正公司）；API系統的細菌鑒定卡與藥敏試驗卡（法國梅里埃公司）；細胞培養基（DMEM∶F12=1∶1）（GIBCO公司）；青霉素（GIBCO公司）；兩性霉素B（GIBCO公司）；頭孢西丁、臺盼藍、地塞米松、吲哚美辛、油紅O、β-磷酸甘油、2-磷酸-L-抗壞血酸和胰島素（Sigma公司）。

1.4 方法

1.4.1 微生物鑒定和藥敏 臍帶采集后放入臍帶采集液中保存，然后送至臍帶間充質庫。注射器抽取12 mL臍帶采集液，需氧瓶、厭氧瓶各6 mL進行微生物培養。凡系統報告為陽性瓶時，應從菜單擴展功能項進入觀察曲線狀態，并及時轉種血瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基、沙保羅瓊脂培養基，置恒溫孵箱35℃培養18~24 h。按照標準化操作流程，將細菌或真菌制成菌懸液，接種于相應的鑒定卡和藥敏卡，35℃溫箱培養18~24 h，其中ATB STAPH藥敏卡需培養48 h，讀取結果。

1.4.2 HUCMSCs形態、生長和增殖情況 根據細菌及真菌的鑒定和藥敏結果選擇頭孢西丁、青霉素、兩性霉素B。隨機選取10份標本觀察加入的抗生素對細胞生長和增殖是否有影響。將已培養2~3 d生長旺盛的HUCMSCs，用0.25%胰酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液（D培養液）將其稀釋成1×104/mL，加入24孔培養板，每孔1 mL，置于37℃的5%二氧化碳培養箱中24 h后，吸出培養液。分組處理如表1。倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞培養4 d后的形態。再更換培養液第0、1、3、5、7天臺盼藍染色作活體計數，10份標本取均值繪制HUCMSCs的生長曲線。

1.4.3 HUCMSCs體外向脂肪細胞誘導分化 按1.4.2 分5組，取第3代HUCMSCs，按每孔1×104/mL細胞濃度接種于6孔板中，按表1分組加入抗生素。待細胞融合達80%時分別更換為加入成脂誘導液（1μmol/L地塞米松+100μmol/L吲哚美辛+10 mg/L胰島素+0.5 mmol/L1-甲基-3-異丁基黃嘌呤）的D培養液。每3 d或4 d換液1次，連續誘導3周，去除含誘導液的D培養液，PBS洗滌液洗滌2次，用多聚甲醛固定，油紅O染色。另設一空白對照孔為a組，也按每孔1×104/mL細胞濃度接種于6孔板中，只加D培養液，不加誘導液，油紅O染色。加入異丙醇作用10 min，洗脫細胞內的脂滴，轉移到96孔板，酶標儀490 nm處讀取OD值。

1.4.4 HUCMSCs向骨細胞誘導分化 按1.4.2分5組，取第3代HUCMSCs，按每孔1×104/mL細胞濃度接種于6孔板中，用D培養液培養，按表1分組加入抗生素。待細胞融合達80%時分別更換為加入成骨誘導液（0.1μmol/L地塞米松+10 mmol/Lβ-磷酸甘油+50μmol/L 2-磷酸-L-抗壞血酸）的D培養液。每3 d或4 d換液一次，連續誘導4周，其他處理同步驟1.4.3，茜素紅染色。另設一空白對照孔為a組，也按每孔1×104/mL細胞濃度接種于6孔板中，只加D培養液，不加誘導液，茜素紅染色。

收集成骨誘導分化4周后的細胞培養基，采用放射免疫法檢測各組培養基中骨鈣素含量。

1.5 統計學處理 使用GraphPad prism 5進行統計學分析并繪圖。符合正態分布的計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 污染菌分布和藥敏 微生物培養陽性的386份臍帶采集液，共檢出細菌及真菌438株。其中革蘭陰性菌193株（44.1%），主要為大腸埃希菌；革蘭陽性菌210株（48.0%），主要為腸球菌，其次是葡萄球菌和鏈球菌；真菌35株（8.0%），主要為白假絲酵母菌。轉種后檢出的主要污染菌分布見圖1。其中，4例轉種未生長判定為假陽性。56例轉種發現有兩種微生物污染，其中剖腹產10份，順產46份。未發現2種以上微生物污染的情況。臍帶采集液主要檢出菌對3種抗生素的敏感率見表2。

表2 臍帶采集液主要檢出菌對抗生素的敏感率Tab 2 Sensitivity rate of main bacteria detected in umbilical cord collection fluid to antibiotics

2.2 HUCMSCs形態 各組細胞培養4 d后的形態顯示：試驗組c組、d組、e組和f組細胞形態良好，為梭形和多角形，渦旋狀排列生長，并可見圓形分裂細胞，表明細胞生長旺盛，細胞折光性強，與對照b組相似（圖2）。各組進行細胞計數，繪制細胞的生長曲線（圖3），各組加抗生素分別與不加抗生素對照組比較，差異均無統計學意義（P=0.57）。結果表明頭孢西丁、青霉素、兩性霉素B和頭孢西丁+青霉素+兩性霉素B對HUCMSCs生長和增殖無顯著影響。

圖2 各組人臍帶間充質干細胞培養4 d后的形態（40×）Fig 2 Morphology of HUCMSCsin each group after 4 daysof culture（40×）

圖3 各組人臍帶間充質干細胞增殖情況的比較Fig 3 Comparison of theproliferation of HUCMSCsin each group

2.3 HUCMSCs向脂肪細胞分化 顯微鏡下可見細胞胞漿中充滿明亮橙紅色油滴。試驗組b組、c組、d組、e組和f組與對照組a組無明顯差別（圖4）。酶標儀定量檢測細胞內脂滴，加抗生素各組分別與不加抗生素對照組比較，差異均無統計學意義（P=0.89）。

圖4 各組人臍帶間充質干細胞成脂分化潛能Fig 4 Theadipogenic differentiation ability of HUCMSCsin each group

2.4 HUCMSCs向骨分化 顯微鏡下可見紅色骨結節。試驗組b組、c組、d組、e組和f組與對照組a組無明顯差別（圖5）。檢測各組培養基中骨鈣素含量，各組加抗生素分別與不加抗生素對照組比較，差異均無統計學意義（P=0.71）。

圖5 各組人臍帶間充質干細胞成骨分化潛能Fig 5 Theosteogenic differentiation ability of HUCMSCsin each group

3 討論

本研究通過對386份臍帶采集標本的研究發現，共檢出細菌及真菌438株。其中革蘭陰性菌193株（44.1%），主要為大腸埃希菌；革蘭陽性菌210株（48.0%），主要為腸球菌，其次是葡萄球菌和鏈球菌；真菌35株（8.0%），主要為白假絲酵母菌。

細胞培養時常出現污染現象，常在培養基中加青霉素和鏈霉素預防污染[14]。本研究發現，大腸埃希菌對頭孢西丁的敏感率為90.3%，腸球菌、葡萄球菌、鏈球菌對青霉素的敏感率分別為93.1%、19.7%、92.9%，真菌對兩性霉素B的敏感率為100%。因此，保存臍帶的采集液中加入頭孢西丁、青霉素和兩性霉素B，可有效減少臍帶污染。

HUCMSCs的生長曲線和細胞形態均反映頭孢西丁、青霉素、兩性霉素B和三者混合使用（終濃度均為16 mg/L）對HUCMSCs生長和增殖無影響，也不影響HUCMSCs經誘導向脂肪細胞分化和向骨細胞的分化。頭孢西丁的藥理機制是通過與一個或多個青霉素結合蛋白（PBPs）結合，抑制細菌分裂活躍的細胞的細胞壁生物合成，從而起抗菌作用。青霉素所含的青霉烷能使細菌細胞壁的合成發生障礙，導致細菌溶解死亡。兩性霉素B為多烯類抗真菌抗生素，通過影響細胞膜通透性發揮抑制真菌生長的作用。人體細胞沒有細胞壁，僅有細胞膜，頭孢西丁、青霉素均作用于細胞壁，故不損害人體細胞。本研究結果提示16 mg/L頭孢西丁和青霉素對HUCMSCs形態、生長、增殖和誘導分化無影響；16 mg/L兩性霉素B既能抑制真菌生長，又對HUCMSCs形態、生長、增殖和誘導分化無影響。與黃文敬等[15]研究認為兩性霉素B在劑量高于30 mg/L時才有細胞毒性結果一致。

綜上，本研究證實，保存臍帶的采集液中加入頭孢西丁、青霉素和兩性霉素B（終濃度均為16 mg/L），可有效減少臍帶采集細菌和真菌污染，很大程度上避免臍帶HUCMSCs因被污染而廢棄。本研究可為臍帶采集液中抗生素的合理添加提供實驗依據，為HUCMSCs的應用提供保障。