R848對哮喘患兒外周血中IFN-γ、IL-33和IgE表達(dá)的影響及臨床意義

熊蕾蕾，張松林，張向峰，張志英，靳秀紅

（鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院、河南省兒童醫(yī)院、鄭州兒童醫(yī)院南院區(qū)呼吸科，鄭州450000）

哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，在過去幾十年來，兒童哮喘的發(fā)病率呈顯著上升趨勢[1]。氣道上皮是呼吸道的第一道屏障，受到刺激后可引發(fā)Th2型反應(yīng)，誘導(dǎo)IgE型速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，IgE可誘導(dǎo)嗜酸粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放炎癥介質(zhì)，引起氣道慢性炎癥反應(yīng)和氣道重塑[2]。白細(xì)胞介素（IL）-33是Th2型反應(yīng)中強(qiáng)大的炎癥因子，在哮喘中發(fā)揮重要作用[3]。T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫紊亂在哮喘中發(fā)揮一定作用，其中包括Th1型細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素（IFN-γ）。哮喘是免疫因素、基因因素和環(huán)境因素等相互作用造成的，Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）在免疫性和炎癥性疾病中扮演重要角色，且與哮喘的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。有研究顯示，TLR4可促進(jìn)炎癥因子的釋放，抑制TLR4信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)和相關(guān)炎癥因子的表達(dá)[5-6]。R848是一種咪唑喹啉，可通過TLR7/TLR8 MyD88依賴性信號通路活化免疫細(xì)胞。TLR7通過刺激MyD88途徑激活A(yù)PC，從而導(dǎo)致促炎因子、趨化因子、Ⅰ型干擾素（IFN）及共刺激分子的上調(diào)[7]。在大鼠中，R848已顯示出抑制炎癥反應(yīng)并消除氣道重塑的作用[8]。在本研究中作者通過收集哮喘急性發(fā)作期患兒外周血，分離培養(yǎng)外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），檢測R848刺激PBMC后對IFN-γ、IL-33和IgE水平的影響，為哮喘的治療提供新的思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2018年6月—2020年5月接受治療的急性發(fā)作期哮喘患者125例，男55例，女70例，年齡4～12歲，及同時(shí)期來院就診的臨床緩解期哮喘患者30例，男13例，女17例，年齡3～10歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）急性發(fā)作期哮喘患者和臨床緩解期哮喘患者的診斷符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）》[9]。（2）近3個(gè)月未使用免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）近1個(gè)月有呼吸道感染史或合并其他炎癥性疾病。（2）合并免疫系統(tǒng)性疾病。（3）合并過敏性鼻炎。（4）合并血液系統(tǒng)性疾病。（5）合并腫瘤。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，家屬知情并簽署知情同意書。

1.2 外周血PBMC分離 抽取急性發(fā)作期哮喘患者和臨床緩解期哮喘患者的外周靜脈血5 mL，肝素抗凝，加入5 mL Hank′s進(jìn)行稀釋，利用Ficoll進(jìn)行梯度離心（常溫，2 000 r/min，20 min），吸取分離液與血漿間的白膜層。加入3 mL PBS溶液混合均勻，1 500 r/min離心10 min，吸去上清。加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，在室溫下孵育5 min，裂解紅細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，吸去裂解液。加入3 mL PBS溶液混合均勻，1 500 r/min離心5 min，吸去上清。用RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞傳2代后凍存待用。

1.3 qRT-PCR檢測急性加重期患者PBMC中TLR7/8 mRNA的相對表達(dá)水平 Trizol提取PBMC的總RNA，依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR檢測TLR7/8 mRNA的相對表達(dá)水平。TLR7上游引物序列為5′-GACCGGTCAAGTCCCAGTGTAGAAC-3′，下游引物序列為5′-TTACTGACTTCATGGCATGTACGGT-3′，TLR8上游引物序列為5′-TACGGGGATCGGCCTTGACTCGCCT-3′，下游引物序列為5′-CCTGGAAATGCGACTGAATGGTTGC-3′，磷酸甘油醛脫氫酶為內(nèi)參，上游引物序列為5′-GGTACGGTCCGTACGTGATGCCGTAG-3′，下游引物序列為5′-CCGTAGTTGCTAGCTGAATGTGATGC-3′。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2 min，再變性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸35 s，總共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，利用2-ΔΔCt計(jì)算TLR7/8 mRNA的相對表達(dá)水平。

1.4 ELISA實(shí)驗(yàn)檢測IFN-γ、IL-33和IgE的水平 不同濃度R848（0 mg/L、0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L）刺激急性發(fā)作期PBMC細(xì)胞（隨機(jī)抽取10例患者的PBMC細(xì)胞）24 h后檢測IFN-γ、IL-33和IgE的水平。根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行以下操作：利用鼠抗人IFN-γ、IL-33和IgE抗體包被ELISA板，放置4℃冰箱中過夜，用PBS溶液（含有0.5 ml/LTween20）洗滌1次，再加入PBS溶液洗滌1次，然后放置室溫靜置1 h。向ELISA板中加入不同稀釋濃度的IFN-γ、IL-33和IgE標(biāo)準(zhǔn)品及待檢測的樣品，放置室溫2 h。加入對應(yīng)的生物素標(biāo)記的鼠抗人IFN-γ、IL-33和IgE抗體，放置室溫1 h。加入底物顯色在室溫下避光放置30 min，最終加入100 ml/L的硫酸終止顯色，用酶標(biāo)儀檢測IFN-γ、IL-33和IgE的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用SPSS21.0軟件行統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)過正態(tài)性檢測，符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。非正態(tài)分布資料以中位數(shù)（四分位間距）表示，組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。Pearson進(jìn)行相關(guān)性檢測，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性發(fā)作期患者外周血中PBMC分泌IFN-γ、IL-33和IgE的水平 急性發(fā)作哮喘患者外周血中PBMC分泌IFN-γ的水平低于臨床緩解期，分泌IL-33和IgE的水平高于臨床緩解期（均P<0.05）。急性發(fā)作期患者外周血中TLR7/8 mRNA相對表達(dá)水平低于臨床緩解期（P<0.05），見表1。

表1 兩組外周血中PBMC分泌IFN-γ、IL-33和IgE的水平[±s，M（P25，P75）]Tab 1 Thelevelsof IFN-γ，IL-33 and IgE secreted by PBMC in peripheral blood of two groups[±s，M（P25，P75）]

表1 兩組外周血中PBMC分泌IFN-γ、IL-33和IgE的水平[±s，M（P25，P75）]Tab 1 Thelevelsof IFN-γ，IL-33 and IgE secreted by PBMC in peripheral blood of two groups[±s，M（P25，P75）]

注：IL-33：白細(xì)胞介素-33；IFN-γ：干擾素-γ；TLR7：Toll樣受體7；TLR8：Toll樣受體8

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2.2 急性發(fā)作期患者外周血中IL-33、IFN-γ和IgE水平與TLR7/8 mRNA相對表達(dá)水平相關(guān)性分析 急性發(fā)作期患者外周血中IL-33水平與TLR7/8 mRNA相對表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.887，P<0.001；r=-0.910，P<0.001），IFN-γ水平與TLR7/8 mRNA相對表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.818，P<0.001；r=0.808，P<0.001），IgE水平與TLR7/8 mRNA相對表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.850，P<0.001；r=-0.838，P<0.001），見圖1。

圖1 IL-33、IFN-γ和IgE水平與TLR7/8 mRNA相對表達(dá)水平相關(guān)性分析Fig 1 Correlation analysisbetween IL-33,IFN-γand IgElevelswith therelativeexpression levelsof TLR7/8 mRNA

2.3 不同濃度R848刺激急性發(fā)作期患者PBMC分泌IFN-γ、IL-33和IgE的水平比較 R848刺激急性發(fā)作期患者PBMC細(xì)胞后，IL-33和IgE水平在R848 1 mg/L時(shí)降低，至R848 10 mg/L后趨于平穩(wěn)（F=56.231、42.310，均P<0.001）。IFN-γ水平在R848 0.1 mg/L時(shí)逐漸升高，至R848 10 mg/L后趨于平穩(wěn)（F=62.352，P<0.001），見圖2。

圖2 不同濃度R848刺激急性發(fā)作期患者PBMC分泌IFN-γ、IL-33和IgE的水平比較Fig 2 Comparison of thelevelsof IFN-γ,IL-33and IgEsecreted by PBMCof patientswithdifferent concentrationsof R848in theacutestage

2.4 R848刺激急性發(fā)作期患者PBMC分泌IFNγ、IL-33和IgE的動態(tài)觀察 R848 10 mg/L刺激急性發(fā)作期PBMC 6~48 h，IL-33和IgE水平在12 h時(shí)降低，至36 h后趨于平穩(wěn)（F=32.658、36.521，均P<0.001），IFN-γ在12 h時(shí)增加，至36 h后趨于平穩(wěn)（F=42.321，P<0.001），見圖3。

圖3 R848刺激急性發(fā)作期PBMC分泌IFN-γ、IL-33和IgE的動態(tài)觀察Fig 3 Thedynamic observation of R848 stimulatesthesecretion of IFN-γ,IL-33and IgEfrom PBMCin theacutestage

3 討論

過敏性哮喘是一種影響氣道的異質(zhì)性疾病，其特征是涉及多種細(xì)胞和體液介質(zhì)的慢性炎癥反應(yīng)。典型的哮喘性氣道炎癥是由IgE依賴性肥大細(xì)胞脫粒引發(fā)的，并可誘導(dǎo)Th2型細(xì)胞因子分泌。這種慢性炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是氣道重塑的根本原因，其特征是上皮下基層纖維化，杯狀細(xì)胞和平滑肌增生[10]。目前哮喘的管理策略一是使用支氣管擴(kuò)張劑（短效和長效2型激動劑）作用于急性加重期和延長緩解時(shí)間，二是吸入皮質(zhì)類固醇以最大程度減少哮喘發(fā)作，現(xiàn)已證明控制炎癥是治療哮喘的有效方法[11]。TLR可介導(dǎo)病原體相關(guān)分子模式識別，在先天和適應(yīng)性免疫中都起著至關(guān)重要的作用[12-13]。這些廣泛表達(dá)的蛋白質(zhì)是第一個(gè)參與對環(huán)境刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答的分子，該過程由細(xì)胞激活和刺激細(xì)胞因子產(chǎn)生介導(dǎo)。已有研究顯示TLR2和TLR4的多態(tài)性與哮喘的發(fā)病相關(guān)[14]，致敏的炎癥性單核細(xì)胞中TLR信號的激活可通過促進(jìn)Th1相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，減弱卵清蛋白誘導(dǎo)的過敏性哮喘[15]。

R848已被證明可誘導(dǎo)從嚙齒類到靈長類的許多物種中多種細(xì)胞因子的表達(dá)[16]。有研究顯示在急性哮喘小鼠模型中，R848治療可以預(yù)防肺部疾病的發(fā)展，包括氣道高反應(yīng)性和嗜酸性粒細(xì)胞增多[17]。對BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠哮喘模型的研究發(fā)現(xiàn)，R848均表現(xiàn)出抑制急性炎癥反應(yīng)的作用[18-19]。鑒于R848治療可以預(yù)防幾種遺傳多樣的小鼠品系與過敏原激發(fā)有關(guān)的急性炎癥反應(yīng)，筆者推測該化合物也可以抑制人哮喘的急性炎癥反應(yīng)。因此本研究收集急性發(fā)作期哮喘患者的外周血，分離培養(yǎng)PBMC。經(jīng)過一系列實(shí)驗(yàn)檢測顯示，急性發(fā)作哮喘患者外周血中PBMC分泌IFN-γ的水平較低，分泌IL-33和IgE的水平較高，IFN-γ與TLR7/8 mRNA水平呈正相關(guān)，IL-33和IgE與IFN-γ及TLR7/8 mRNA水平呈負(fù)相關(guān)。提示IL-33、IgE和IFN-γ與TLR7/8密切相關(guān)，TLR7/8可能通過調(diào)控IL-33、IgE和IFN-γ水平參與哮喘的發(fā)生和發(fā)展。R848處理PBMC后可呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性的抑制IL-33和IgE的分泌，促進(jìn)IFN-γ的分泌，發(fā)揮抗炎作用。有研究顯示TLR7配體可刺激CD4+淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)物中Th1細(xì)胞因子IL-12、IFN-γ和IFN-α的產(chǎn)生[20]。對人類細(xì)胞的研究表明，R848可以直接誘導(dǎo)效應(yīng)記憶CD4+T細(xì)胞增殖并上調(diào)IFN-γ生成[21]。Shen等[22]研究顯示，TLR7/8配體R848以劑量依賴的方式抑制鼠脾細(xì)胞中抗CD40和IL-4介導(dǎo)的IgE和IgG1的產(chǎn)生，R848對脾細(xì)胞抗CD40和IL-4誘導(dǎo)的IgE合成的抑制作用似乎是由至少3種不同的機(jī)制介導(dǎo)的。首先，R848抑制了抗CD40和IL-4刺激的脾細(xì)胞中B細(xì)胞的增殖和分裂。其次，R848促進(jìn)了IFN-γ和IL-12的產(chǎn)生，而這部分是抑制IgE產(chǎn)生的原因。第三，R848對B細(xì)胞具有直接的抑制IgE產(chǎn)生的作用。以上結(jié)果均顯示，R847對哮喘的炎癥反應(yīng)有一定的抑制作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示R848可調(diào)節(jié)急性發(fā)作期哮喘患者PBMC分泌的IL-33、IgE和IFN-γ水平，發(fā)揮抗炎作用。但具體的作用機(jī)制、對于預(yù)防慢性氣道重塑的影響還有待進(jìn)一步研究。