免疫膠體金試劑盒檢測碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細(xì)菌的臨床性能評(píng)價(jià)

張偉錚 阿依姑再·艾力 鄧光遠(yuǎn) 李松 張軒 黃彬 蔡依玫

1廣州市干部健康管理中心廣州市第十一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科 510530；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 510006；3廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部510006；4中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣州 510075

腸桿菌目細(xì)菌（Enterobacterales）是一種無芽孢、周身鞭毛或無鞭毛的革蘭陰性桿菌，通?？梢鹉c道、泌尿道、膽道、腹腔及血流感染（菌血癥和敗血癥）［1］。碳青霉烯類藥物是治療多重耐藥菌感染的首選藥物。近幾十年來，隨著臨床抗菌藥物的廣泛使用，碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細(xì)菌（carbapenem-resistantEnterobacterales，CRE）的數(shù)量明顯增多，現(xiàn)如今已成為院內(nèi)感染的高危病原菌［2］。CRE 因耐藥性強(qiáng)和致死率高，被稱為“超級(jí)細(xì)菌”。CRE 的耐藥機(jī)制主要是細(xì)菌自身產(chǎn)生的碳青霉烯酶［3-6］，其次是超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase，ESBL）和/或AmpC 酶過度表達(dá)合并膜孔蛋白缺失、外排泵過表達(dá)和藥物靶位改變［7］。碳青霉烯酶按Ambler 分子分類為A、B、D 3 類酶。A類為絲氨酸酶，KPC 是最具臨床意義的A 類酶；B 類為金屬β-內(nèi)酰胺酶，是研究最多的碳青霉烯酶，主要包括NDM、IMP和VIM；D類也屬于絲氨酸酶，主要是OXA-48。碳青霉烯酶的臨床檢測方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、改良Hodge 試驗(yàn)、Carba NP 試驗(yàn)、改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)（modified carbapenem in activation method，mCIM）、EDTA 碳青霉烯滅活試驗(yàn)（EDTA-modified carbapenem in activation method，eCIM）和免疫層析法等［8］。mCIM 聯(lián)合eCIM 可以區(qū)分碳青霉烯酶是產(chǎn)A 類絲氨酸酶或產(chǎn)B 類金屬β-內(nèi)酰胺酶，相對(duì)于Carba NP 和MHT，它操作簡便、價(jià)格低廉且已獲得美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）認(rèn)可［9］。其主要缺點(diǎn)是孵育時(shí)間長，總耗時(shí)長。商品化免疫膠體金試劑盒是通過碳青霉烯酶抗原與膠體金標(biāo)記的抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，通過層析作用而顯色的一種試劑盒?，F(xiàn)如今國外已有NG-Test CARBA 5試劑盒［10］。該試劑盒可以直接檢測5 類常見的碳青霉烯酶（KPC、NDM、IMP、VIM 和OXA-48），操作簡便快速，可是成本較高。本實(shí)驗(yàn)使用的商品化免疫膠體金試劑盒檢測單個(gè)類型的碳青霉烯酶試劑盒，相較于NG-Test CARBA 5，該試劑盒可依據(jù)菌種特征，優(yōu)先選擇不同的碳青霉烯酶單獨(dú)測試，相對(duì)成本較低，利于常見表型（如KPC 和NDM 酶）的檢出，指導(dǎo)臨床合理用藥。本研究通過對(duì)免疫膠體金試劑盒的性能評(píng)價(jià)，評(píng)估其能否廣泛應(yīng)用于臨床碳青霉烯酶的檢測。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 菌株 收集廣東省2 家三甲醫(yī)院2016 年1 月至2020 年 12 月臨床分離的 88 株 CRE（廣東省中醫(yī)院 64 株，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院24 株），剔除來自同一患者的重復(fù)株。所有菌株經(jīng)全自動(dòng)微生物分析儀Vitek 2 鑒定和藥敏測試。根據(jù)CLSI M100-S31 指南，CRE 對(duì)厄他培南、亞胺培南或美羅培南任一藥物耐藥。質(zhì)控菌株選用大腸埃希菌ATCC 25922。所有菌株用25% 甘油-LB 肉湯保種，-80 ℃凍存，實(shí)驗(yàn)前用血平板復(fù)蘇備用。

1.2 試劑 血平板、MH 平板（廣州迪景微生物科技有限公司），PCR 擴(kuò)增試劑、DNA Marker DL 2000（日本TakaRa公司），PCR 引物、乙二胺四乙酸（EDTA）、NaOH 結(jié)晶（生工生物工程上海股份有限公司），Glodview 熒光染料（廣州東盛/民賽生物科技有限公司），免疫膠體金試劑盒（北京金山川科技發(fā)展有限公司），美羅培南藥敏紙片10 μg/ml、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（英國Oxoid公司）。

1.3 儀器 Veriti PCR 擴(kuò)增儀（美國ABI 公司），DIYY-6C 型水平電泳儀（北京六一儀器廠），Vilber Lourmat凝膠成像系統(tǒng)（法國Vilber Lourmat公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌株的復(fù)蘇 用接種環(huán)挑取一環(huán)菌液，分區(qū)劃線接種于血平板，35 ℃培養(yǎng)16～18 h，觀察菌落生長情況，挑單克隆接種于含100 μg/ml 氨芐西林的LB 平板，30 ℃培養(yǎng)16～18 h。

2.2 碳青霉烯酶基因檢測

2.2.1 細(xì)菌DNA的提取 將新鮮細(xì)菌懸浮于100μl滅菌雙蒸水中，充分混勻，100 ℃煮沸10 min；12 000 r/min 離心5 min（離心半徑15 cm），將上清液轉(zhuǎn)移至新的無菌EP管，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 PCR 擴(kuò)增 ⑴PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 40 s，退火 50 s，72 ℃延伸 50 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 檢測碳青霉烯酶基因的引物序列和擴(kuò)增片段長度見表1。⑵電泳：將擴(kuò)增產(chǎn)物加入至1%瓊脂糖凝膠孔中，在150 V電壓下電泳25 min后在凝膠成像系統(tǒng)中拍照，以DNA Marker2000 作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，出現(xiàn)與陽性對(duì)照分子量相同的條帶判為陽性。陽性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生物工程技術(shù)有限公司測序驗(yàn)證，并進(jìn)行Blast 同源序列比對(duì)分析。

表1 碳青霉烯酶基因所用引物序列及擴(kuò)增片段長度和退溫溫度

2.3 mCIM 聯(lián)合 eCIM 采用 mCIM 聯(lián)合 eCIM 檢測88 株CRE 是否產(chǎn)碳青霉烯酶。mCIM 聯(lián)合eCIM 參照第31版M100《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)性能標(biāo)準(zhǔn)》［11］。

2.3.1 mCIM 稱取30 g TSB 干粉溶于1 L 去離子水，121 ℃高壓滅菌15 min 備用。挑取1μl 接種環(huán)的新鮮菌落充分溶于2 ml TSB 肉湯，放入1 張含10μg 美羅培南藥敏紙片，37 ℃孵育4 h。取出紙片并盡量擠去多余水分，貼于已均勻涂布0.5 MCF 大腸埃希菌ATCC 25922 的MH 瓊脂平板，37 ℃5%CO2培養(yǎng)18～24 h后測量抑菌圈直徑。結(jié)果判讀：美羅培南抑菌圈直徑6～15 mm 或16～18 mm 且抑菌圈中有菌落生長判定為產(chǎn)碳青霉烯酶；抑菌圈直徑≥19 mm 判定為不產(chǎn)碳青霉烯酶；抑菌圈直徑16～18 mm 或≥19 mm 且抑菌圈中有菌落生長，則無法判定是否產(chǎn)碳青霉烯酶。

2.3.2 eCIM 取1 μl 接種環(huán)的新鮮菌落充分溶于含20 μl PH8 0.5 M EDTA 的 2 ml TSB 肉湯，放入 1 張含 10 μg美羅培南藥敏紙片，37 ℃孵育4 h。隨后將兩實(shí)驗(yàn)的MEM紙片貼在同一塊均勻涂布0.5 MCF大腸埃希菌ATCC 25922的MH 瓊脂平板，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng) 18～24 h 后測量抑菌圈直徑。結(jié)果判讀：當(dāng)mCIM 結(jié)果為陽性時(shí)，若eCIM 試驗(yàn)紙片與mCIM 試驗(yàn)紙片的抑制圈直徑≥5 mm，則判為產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶陽性菌；若兩者的抑菌圈直徑差≤4 mm，則判為產(chǎn)絲氨酸酶。

2.4 免疫膠體金試劑盒 根據(jù)基因型結(jié)果，應(yīng)用4 種商品化免疫顯色試劑盒檢測碳青霉烯酶。30 株攜帶blaKPC、24 株攜帶blaNDM、9 株攜帶blaIMP-4和 5 株攜帶blaVIM的 CRE 分別用 KPC、NDM、IMP-4 和 VIM 酶試劑盒進(jìn)行檢測；20 株P(guān)CR 陰性的CRE 作為對(duì)照組，同時(shí)用4 種酶試劑盒進(jìn)行檢測。 由于未檢出攜帶blaOXA-48的 CRE，本實(shí)驗(yàn)未對(duì)OXA-48酶試劑盒進(jìn)行檢測。

免疫膠體金試劑盒操作步驟如下：向無菌EP 管中滴入10滴樣本處理液，用一次性接種環(huán)蘸取過夜培養(yǎng)細(xì)菌菌落，插入滴有樣本處理液的無菌EP 管中，充分?jǐn)嚢枋蛊渑c溶液混勻，取50μl 處理后的樣本加至膠體金檢測盒的加樣孔，10 min 后讀取結(jié)果。在檢測卡的檢測區(qū)域中出現(xiàn)2 條紅色條帶，即結(jié)果為陽性。

3 結(jié) 果

3.1 PCR 檢測碳青霉烯酶基因 88 株 CRE 中，共檢出6 種常見的腸桿菌目細(xì)菌，包括43 株肺炎克雷伯菌（48.9%），20 株大腸埃希菌（22.7%），18 株陰溝腸桿菌（20.5%），3 株產(chǎn)氣克雷伯菌（3.4%），3 株弗氏檸檬酸桿菌（3.4%）和1 株粘質(zhì)沙雷菌（1.1%）。88 株CRE 中，68 株碳青霉烯酶基因陽性，包括30 株攜帶blaKPC，24 株攜帶blaNDM，9 株攜帶blaIMP-4以及 5 株攜帶blaVIM，未檢出blaOXA-48基因，見表2。5種碳青霉烯酶基因電泳結(jié)果見圖1。

圖1 5種碳青霉烯酶基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果。A、B、C、D、E分別為blaKPC、blaNDM、blaIMP-4、blaVIM、blaOXA-48陽性菌電泳結(jié)果

表2 88株碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細(xì)菌的菌種鑒定和碳青霉烯酶基因分布（株）

3.2 mCIM 聯(lián)合 eCIM 檢測碳青霉烯酶 88 株 CRE 中，mCIM 陽性 66 株，2 株分別攜帶blaNDM和blaIMP-4的陰溝腸桿菌為假陰性。采用微量肉湯稀釋法驗(yàn)證這2 株菌的耐藥表型，2 株菌對(duì)IPM 的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentrations，MICs）均為8 μg/ml，對(duì)美羅培南的MICs 分別為 8 μg/ml 和 4 μg/ml。20 株 CRE 中，mCIM 陰性，推測這20 株不產(chǎn)碳青霉烯酶CRE 的耐藥機(jī)制與ESBL/AmpC 酶合并膜孔蛋白缺失以及外排泵過表達(dá)相關(guān)。mCIM 靈敏度和特異度分別為97.1%（66/68）和100.0%（20/20）。mCIM 聯(lián)合eCIM 檢出36株產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶和30株產(chǎn)絲氨酸酶。這36 株產(chǎn)金屬 β-內(nèi)酰胺酶的 CRE 中，23 株攜帶blaNDM，8 株攜帶blaIMP-4，5株攜帶blaVIM。mCIM聯(lián)合eCIM能準(zhǔn)確鑒定金屬β-內(nèi)酰胺酶，結(jié)果見表3。部分菌株mCIM 聯(lián)合eCIM 結(jié)果見圖2。

圖2 部分碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細(xì)菌mCIM 聯(lián)合eCIM 結(jié)果。A、B、C 分別為產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶、產(chǎn)絲氨酸酶和不產(chǎn)碳青霉烯酶菌株mCIM聯(lián)合eCIM結(jié)果

表3 88株碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細(xì)菌mCIM聯(lián)合eCIM與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果比較

3.3 免疫膠體金試劑盒檢測碳青霉烯酶 免疫膠體金試劑盒檢測68 株產(chǎn)碳青霉烯酶和20 株不產(chǎn)碳青霉烯酶的CRE。以PCR 為金標(biāo)準(zhǔn)，免疫膠體金試劑盒的總體靈敏度和特異度分別為98.5%（67/68）和100.0%（20/20），陽性預(yù)測值為100.0%（67/67），陰性預(yù)測值為95.2%（20/21），總符合率為98.9%（87/88）。KPC 酶試劑盒的靈敏度和特異度為100.0%（30/30）和100.0%（20/20）；NDM 酶試劑盒的靈敏度和特異度為100.0%（24/24）和100.0%（20/20）；IMP-4酶試劑盒的靈敏度和特異度為88.9%（8/9）和100.0%（20/20）；VIM酶試劑盒的靈敏度和特異度為100.0%（5/5）和100.0%（20/20）。1 株攜帶blaIMP-4的陰溝腸桿菌為假陰性，該菌mCIM 初篩試驗(yàn)也為假陰性，經(jīng)耐藥表型復(fù)核，推測與IMP-4酶低表達(dá)量有關(guān)。然而，增加菌液濃度進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，結(jié)果仍為陰性。免疫膠體金試劑盒與PCR 結(jié)果對(duì)比見表4，部分菌株免疫膠體金試劑盒見圖3。Fisher 精確檢驗(yàn)顯示，免疫膠體金試劑盒和mCIM 聯(lián)合eCIM 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

圖3 部分碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細(xì)菌免疫膠體金試劑盒檢測結(jié)果。A、B、C、D 分別為KPC、NDM、IMP-4、VIM 酶膠體金試劑盒檢測結(jié)果

表4 88株碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細(xì)菌免疫膠體金試劑盒與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果比較

3 討 論

隨著臨床抗菌藥物的廣泛使用，耐碳青霉烯腸桿菌的檢出數(shù)量日益增多［12］，現(xiàn)如今已成為院內(nèi)感染的重要病原菌，而臨床對(duì)于這類細(xì)菌的感染治療可選擇藥物非常有限，并且不同基因型的治療方案也不同。例如，產(chǎn)KPC 的肺炎克雷伯菌對(duì)頭孢他啶/阿維巴坦的敏感性較好，相反，產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的大腸埃希菌和陰溝腸桿菌對(duì)其敏感性較差［13］。因此，對(duì)碳青霉烯酶基因型的鑒定可以早期有效地指導(dǎo)臨床合理用藥。

本研究收集了2 家三甲醫(yī)院臨床分離的88 株CRE，包括6 種常見腸桿菌（肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、大腸埃希菌、弗氏檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷伯菌和粘質(zhì)沙雷菌）。經(jīng)PCR 鑒定，88株CRE 中，共68株攜帶碳青霉烯酶基因，包括30 株攜帶blaKPC，24 株攜帶blaNDM，9 株攜帶blaIMP-4，5 株攜帶blaVIM。88 株CRE 中，有20 株碳青霉烯酶基因陰性，推測這些菌株耐藥機(jī)制可能與罕見/新型碳青霉烯酶、ESBL 和/或AmpC酶合并膜孔蛋白缺失以及外排泵過表達(dá)相關(guān)［14］。

mCIM 靈敏度和特異度分別為97.1%（66/68）和100.0%（20/20），2 株分別攜帶blaNDM和blaIMP-4的陰溝腸桿菌為假陰性。實(shí)驗(yàn)菌株接種于含100 μg/ml 氨芐西林的LB 平板上，可排除質(zhì)粒丟失引起的假陰性。同時(shí)，經(jīng)微量肉湯稀釋法進(jìn)行耐藥表型復(fù)核，2株菌對(duì)IPM的MICs均為8μg/ml，對(duì)美羅培南的 MICs 分別為 8 μg/ml 和 4 μg/ml，故推測 mCIM 假陰性與金屬β-內(nèi)酰胺酶的低活性相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，mCIM聯(lián)合eCIM 能正確鑒別腸桿菌的金屬β-內(nèi)酰胺酶和絲氨酸酶，操作簡便，結(jié)果易于判斷，在臨床檢測產(chǎn)碳青霉烯酶（尤其是KPC酶和NDM酶）CRE具有較高的應(yīng)用價(jià)值［15］。

免疫膠體金試劑盒的總體靈敏度和特異度分別為98.5%（67/68）和100.0%（20/20），陽性預(yù)測值為100.0%（67/67），陰性預(yù)測值為 95.2%（20/21），總符合率為 98.9%（87/88）。KPC、NDM 和VIM 酶試劑盒的靈敏度和特異度均為100.0%。IMP-4 酶試劑盒的靈敏度和特異度分別為88.9%（8/9）和100.0%（20/20）。免疫膠體金試劑盒和mCIM 聯(lián)合eCIM 試驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。與mCIM 聯(lián)合eCIM 試驗(yàn)相比，免疫膠體金試劑盒檢測碳青霉烯酶的靈敏度和特異度高，操作更為簡便，且10 min 內(nèi)即可查看結(jié)果。該方法可用于快速輔助鑒定碳青霉烯酶的基因型，但陽性或陰性的結(jié)果不能否定存在其他耐藥性機(jī)制的可能。不同于NG-Test CARBA 5，本實(shí)驗(yàn)使用的免疫膠體金試劑盒是能檢測單個(gè)類型的碳青霉烯酶試劑盒，對(duì)于高風(fēng)險(xiǎn)耐藥菌（如肺炎克雷伯菌）中特定碳青霉烯酶基因的檢測，其相對(duì)成本大大降低［16］。

免疫膠體金試劑盒利用抗原抗體免疫層析技術(shù)快速檢測腸桿菌中的碳青霉烯酶。受方法學(xué)影響，免疫膠體金試劑盒出現(xiàn)假陽性主要與非特異抗原干擾相關(guān)，而出現(xiàn)假陰性的原因主要包括：⑴細(xì)菌酶產(chǎn)量不多，抗原濃度低；⑵抗原濃度太高引起鉤狀效應(yīng)；⑶后帶反應(yīng)。本研究中1 株攜帶blaIMP-4的陰溝腸桿菌為假陰性，該菌mCIM 初篩試驗(yàn)也為假陰性，經(jīng)耐藥表型復(fù)核鑒定為CRE，推測假陰性與IMP-4 酶低表達(dá)量有關(guān)。然而，增加菌液濃度進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果仍為陰性。

由于不同碳青霉烯酶流行率不同，本研究采用非隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)菌株所攜帶的碳青霉烯酶基因分布存在偏倚。前期采用PCR 廣泛篩選臨床分離CRE 時(shí)發(fā)現(xiàn)，本地區(qū)攜帶blaIMP-4和blaVIM的CRE 數(shù)目有限。因此，本實(shí)驗(yàn)僅納入9株攜帶blaIMP-4和5株攜帶blaVIM的CRE進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這對(duì)檢測結(jié)果造成一定的偏差。由于未檢出攜帶blaOXA-48的CRE，本實(shí)驗(yàn)未對(duì)OXA-48酶試劑盒進(jìn)行檢測。

綜上所述，免疫膠體金試劑盒（尤其是KPC 和NDM 酶試劑盒）在腸桿菌中靈敏度和特異度均很高，快速、有效且經(jīng)濟(jì)，能指導(dǎo)臨床盡早啟動(dòng)有針對(duì)性的抗感染治療方案，有望成為臨床和實(shí)驗(yàn)室快速檢測和診斷CRE的新方法。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。