microRNA-143在膀胱癌患者血清中的表達(dá)及其臨床意義

趙偉 劉希高 史本康 王磊

1山東省滕州市中心人民醫(yī)院泌尿外科 277500；2山東大學(xué)齊魯醫(yī)院泌尿外科，濟(jì)南250012

膀胱癌起源于膀胱上皮組織，是最常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，位列人類(lèi)十大惡性腫瘤之一［1］，發(fā)病率高達(dá)6.61/100 000，在惡性腫瘤發(fā)病率中排名第9［2］。膀胱癌可以發(fā)生在任何年齡階段，其發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而增加，好發(fā)于50～70 歲（男女比例為 3∶1～4∶1）［3］。目前，常規(guī)檢查包括膀胱鏡、CT、B超和膀胱造影等。大約80%的膀胱癌患者可被早期診斷，且通過(guò)手術(shù)治療，但5 年復(fù)發(fā)率仍達(dá)到50%～70%，其中仍有10%～30%的患者進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌［4］。膀胱癌具有較強(qiáng)的侵襲力，患者的預(yù)后差，5 年生存率極低［5］。因此，尋找更可靠的生物標(biāo)志物和更有效治療靶標(biāo)對(duì)于提高膀胱癌診斷率及改善膀胱癌患者的預(yù)后至關(guān)重要。

最新研究發(fā)現(xiàn)，約50%的microRNAs 具有與腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因組定位，在人類(lèi)許多腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)［6-7］。更多研究表明，microRNAs 在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和預(yù)后中起著重要作用［8-13］。這是因?yàn)閙icroRNAs 是一類(lèi)高度保守、非編碼小RNA，在生理和病理過(guò)程中對(duì)基因的表達(dá)、蛋白功能的發(fā)揮具有重要的調(diào)控作用，在細(xì)胞的凋亡、分化和增殖中調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)水平［14］。它們不僅能誘導(dǎo)癌基因表達(dá)促進(jìn)腫瘤形成，還可以抑制癌基因表達(dá)抑制腫瘤的形成［15］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)microRNA-143 在宮頸癌和結(jié)腸癌等多種腫瘤中低表達(dá)［15］。

目前通過(guò)基因芯片最新研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-143 在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達(dá)存在顯著差異性，表明其可能在膀胱癌的發(fā)生進(jìn)展中起重要作用［16］。本試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)膀胱癌患者和正常人血清中microRNA-143的表達(dá)水平，并探討了其臨床意義與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 對(duì)從2013 年6 月至2016 年6 月在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院、滕州市中心人民醫(yī)院就診的68 例膀胱癌患者（觀察組，術(shù)后病理確診）及40 例健康受試者（對(duì)照組，來(lái)自于體檢中心）進(jìn)行回顧性研究，并對(duì)觀察組進(jìn)行持續(xù)48 個(gè)月的隨訪。觀察組男51 例，女17 例，年齡（54.5±6.7）歲；對(duì)照組男32 例，女8 例，年齡（54.8±8.6）歲。膀胱癌TNM 分期參考 UICC 第8 版（2017 年）［18］。兩組均行腹部、泌尿系CT 和超聲檢查。所有患者或其家屬和健康受試者均簽署知情同意書(shū)。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理診斷為膀胱癌的患者，且有完整臨床資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有尿路感染者；肝腎功能?chē)?yán)重受損的患者；接受過(guò)放化療和生物靶向治療者；近期使用過(guò)大量糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑者；合并有其他部位腫瘤或家族遺傳性惡性腫瘤的患者；患有嚴(yán)重腦、心、肺疾病者。

本研究已通過(guò)滕州市中心人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（倫審號(hào)：2020-倫理審查-18），通過(guò)山東齊魯醫(yī)院倫理委員批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器 miRcute miRNA 提取和分離試劑盒、cDNA 第一鏈合成試劑盒及Trizol 試劑（TRI ReagentBD，Molecular Research Center 公司，美國(guó)）；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀（（SYBR Green PCR kit，ABI 7500，American ABI 公司，美國(guó)）；Mir-UV 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（K5600，北京凱奧科技發(fā)展有限公司，中國(guó)）；microRNA-143（正向引物：5'-ACACTCCAGCTGGGTGAGATGAAGCACT-3'，反向引物：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'）與內(nèi)參U6（正向引物：5' -CTCGCTTCGGCAGCACA-3'， 反 向 引 物 ：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3）的引物（上海圣工生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）。

1.3 檢測(cè)方法 觀察組與對(duì)照組血清樣品的收集和儲(chǔ)存：均無(wú)菌采取4 ml新鮮血液，離心后，將血清置于EP 試管中并保存在-70 ℃直至使用。提取血清總RNA：將從冰箱中取出的血清樣本立即在37 ℃水浴中融化2 min，再取300μl 血清根據(jù)miRcute miRNA 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行提取和分離處理。反轉(zhuǎn)錄：根據(jù)miRcute miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行操作。反應(yīng)條件為：16 ℃，30 min→42 ℃，30 min→85 ℃，5 min。RT-PCR：構(gòu)建20 μl 的 cDNA擴(kuò)增反應(yīng)體系：95 ℃，10 min 預(yù)變，95 ℃，10 s 變性，60 ℃，20 s 退火，72 ℃，10 s 延伸，共 40 個(gè)循環(huán)。之后繼續(xù)在 72 ℃延長(zhǎng)5 min。U6作為內(nèi)參。全部試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt表示microRNA-143的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 隨訪 通過(guò)電話或門(mén)診方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪48個(gè)月，分析microRNA-143的相對(duì)表達(dá)水平與患者的預(yù)后指標(biāo)的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0 版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不同臨床病理參數(shù)間的microRNA-143 表達(dá)情況以百分?jǐn)?shù)表示，行χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料比較 兩組研究對(duì)象的性別、年齡、吸煙、飲酒、體質(zhì)量指數(shù)一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組研究對(duì)象一般資料比較

2.2 觀察組與對(duì)照組的血清microRNA-143 表達(dá)水平的比較 觀察組血清microRNA-143 的相對(duì)表達(dá)量為（0.68±0.32），對(duì) 照 組 為（0.87±0.26）。 觀 察 組 血 清microRNA-143 的相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（t=3.186，P=0.002）。

2.3 膀胱癌患者血清microRNA-143 的表達(dá)水平與各臨床參數(shù)的關(guān)系分析 結(jié)果顯示不同性別、年齡的膀胱癌患者血清miR-143 表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；而不同病理分級(jí)、是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同臨床分期的膀胱癌患者血清microRNA-143 表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），如表2所示。

表2 68例膀胱癌患者血清microRNA-143的表達(dá)水平與各臨床參數(shù)的關(guān)系

2.4 膀胱癌患者血清microRNA-143 的表達(dá)水平與其預(yù)后關(guān)系分析 隨訪結(jié)果符合正態(tài)分布：膀胱癌患者血清microRNA-143 的相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)是0.652，以此為界分為高表達(dá)組與低表達(dá)祖，各34 例患者。對(duì)兩組患者進(jìn)行生存時(shí)間隨訪發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)組患者的生存時(shí)間為（37.53±1.85）個(gè)月，顯著低于高表達(dá)組患者的生存時(shí)間（44.97±2.00）個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.73，P=0.008）。

3 討 論

目前為止，手術(shù)仍然是膀胱癌的主要治療方法，可輔助以放療、化療等其他治療方法。然而，仍然面臨著預(yù)后差、術(shù)后復(fù)發(fā)率高、術(shù)后生活質(zhì)量較差等問(wèn)題［18］。據(jù)諸多學(xué)者研究，發(fā)現(xiàn)了部分膀胱癌腫瘤標(biāo)志物有助于膀胱癌的診斷與監(jiān)測(cè)，但仍未全面、完善地應(yīng)用于臨床。其中miRNA 便是可作為腫瘤診治、監(jiān)測(cè)及預(yù)后評(píng)判的潛在標(biāo)志物之一［19］。部分學(xué)者指出大約50%的人類(lèi)腫瘤的發(fā)生進(jìn)展與miRNA的表達(dá)密切相關(guān)［20］。自從2007 年首次發(fā)現(xiàn)膀胱癌與miRNA 的表達(dá)相關(guān)后，研究miRNA 在膀胱癌的發(fā)生進(jìn)展中的作用便成為熱點(diǎn)［21］。已有研究顯示microRNA-143 在子宮肌層、血管平滑肌細(xì)胞、破骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中高表達(dá)，其中microRNA-143能夠抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖，起著保持平滑肌細(xì)胞和血管之間平衡的作用［22-25］。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)microRNA-143在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中也起著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)microRNA-143-3p 通過(guò)在腫瘤的增殖、凋亡和癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等機(jī)制中起作用，對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生及進(jìn)展起到了抑癌基因的作用［26］。

在本研究中，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)血清microRNA-143 的表達(dá)水平，結(jié)果表明，膀胱癌患者血清microRNA-143 表達(dá)水平明顯低于健康受試者。這與許多研究消化系統(tǒng)惡性腫瘤中microRNA-143 表達(dá)情況是一致的，其中包括食道癌［27］、胃癌［29-30］、胰腺癌［30］和結(jié)腸癌［31-32］?；诖?，可以推斷microRNA-143 在膀胱癌的發(fā)生、進(jìn)展中起到了抑制基因的作用。同時(shí)，從本研究結(jié)果可以看出，膀胱癌患者血清microRNA-143 的表達(dá)水平隨著臨床分期的升高而逐漸降低，這提示microRNA-143表達(dá)下調(diào)可能與膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。根據(jù)隨訪結(jié)果和生存分析，膀胱癌患者血清microRNA-143 的表達(dá)水平中位數(shù)是0.652，以此中位數(shù)為界分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，血清microRNA-143 低表達(dá)的膀胱癌患者的生存時(shí)間為（37.53±1.85）個(gè)月，明顯低于高表達(dá)的膀胱癌患者生存時(shí)間（44.97±2.00）個(gè)月，兩者生存率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明血清microRNA-143低表達(dá)膀胱癌患者的預(yù)后較差。

本課題為回顧性研究，在基本情況數(shù)據(jù)、臨床檢查、特殊檢查和其他數(shù)據(jù)的調(diào)查中存在著一定的不完整性。另外，由于樣本量較小，本課題數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析不夠充分，因此仍需進(jìn)一步擴(kuò)大了樣本量、收集相關(guān)數(shù)據(jù)、完善實(shí)驗(yàn)研究與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，以便獲得更精確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

綜上所述，膀胱癌患者血清microRNA-143的表達(dá)水平明顯低于健康受試者，且與臨床分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后有著密切關(guān)系，其中膀胱癌患者血清microRNA-143 高表達(dá)者預(yù)后較好，提示microRNA-143 有望成為診斷膀胱癌診斷和監(jiān)測(cè)的潛在標(biāo)志物。

利益沖突：作者已申明文章無(wú)相關(guān)利益沖突。