microRNA-143在膀胱癌患者血清中的表達及其臨床意義

趙偉 劉希高 史本康 王磊

1山東省滕州市中心人民醫院泌尿外科 277500；2山東大學齊魯醫院泌尿外科，濟南250012

膀胱癌起源于膀胱上皮組織，是最常見的泌尿系統惡性腫瘤，位列人類十大惡性腫瘤之一［1］，發病率高達6.61/100 000，在惡性腫瘤發病率中排名第9［2］。膀胱癌可以發生在任何年齡階段，其發病率隨年齡增長而增加，好發于50～70 歲（男女比例為 3∶1～4∶1）［3］。目前，常規檢查包括膀胱鏡、CT、B超和膀胱造影等。大約80%的膀胱癌患者可被早期診斷，且通過手術治療，但5 年復發率仍達到50%～70%，其中仍有10%～30%的患者進展為肌層浸潤性膀胱癌［4］。膀胱癌具有較強的侵襲力，患者的預后差，5 年生存率極低［5］。因此，尋找更可靠的生物標志物和更有效治療靶標對于提高膀胱癌診斷率及改善膀胱癌患者的預后至關重要。

最新研究發現，約50%的microRNAs 具有與腫瘤發生相關的基因組定位，在人類許多腫瘤細胞中異常表達［6-7］。更多研究表明，microRNAs 在腫瘤的發生、進展和預后中起著重要作用［8-13］。這是因為microRNAs 是一類高度保守、非編碼小RNA，在生理和病理過程中對基因的表達、蛋白功能的發揮具有重要的調控作用，在細胞的凋亡、分化和增殖中調節相關基因的表達水平［14］。它們不僅能誘導癌基因表達促進腫瘤形成，還可以抑制癌基因表達抑制腫瘤的形成［15］。相關研究發現microRNA-143 在宮頸癌和結腸癌等多種腫瘤中低表達［15］。

目前通過基因芯片最新研究發現，microRNA-143 在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達存在顯著差異性，表明其可能在膀胱癌的發生進展中起重要作用［16］。本試驗通過檢測膀胱癌患者和正常人血清中microRNA-143的表達水平，并探討了其臨床意義與患者預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 對從2013 年6 月至2016 年6 月在山東大學齊魯醫院、滕州市中心人民醫院就診的68 例膀胱癌患者（觀察組，術后病理確診）及40 例健康受試者（對照組，來自于體檢中心）進行回顧性研究，并對觀察組進行持續48 個月的隨訪。觀察組男51 例，女17 例，年齡（54.5±6.7）歲；對照組男32 例，女8 例，年齡（54.8±8.6）歲。膀胱癌TNM 分期參考 UICC 第8 版（2017 年）［18］。兩組均行腹部、泌尿系CT 和超聲檢查。所有患者或其家屬和健康受試者均簽署知情同意書。納入標準：經病理診斷為膀胱癌的患者，且有完整臨床資料。排除標準：患有尿路感染者；肝腎功能嚴重受損的患者；接受過放化療和生物靶向治療者；近期使用過大量糖皮質激素或免疫抑制劑者；合并有其他部位腫瘤或家族遺傳性惡性腫瘤的患者；患有嚴重腦、心、肺疾病者。

本研究已通過滕州市中心人民醫院倫理委員會審批（倫審號：2020-倫理審查-18），通過山東齊魯醫院倫理委員批準。

1.2 主要試劑和儀器 miRcute miRNA 提取和分離試劑盒、cDNA 第一鏈合成試劑盒及Trizol 試劑（TRI ReagentBD，Molecular Research Center 公司，美國）；實時熒光定量 PCR 儀（（SYBR Green PCR kit，ABI 7500，American ABI 公司，美國）；Mir-UV 紫外可見分光光度計（K5600，北京凱奧科技發展有限公司，中國）；microRNA-143（正向引物：5'-ACACTCCAGCTGGGTGAGATGAAGCACT-3'，反向引物：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'）與內參U6（正向引物：5' -CTCGCTTCGGCAGCACA-3'， 反 向 引 物 ：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3）的引物（上海圣工生物技術有限公司，中國）。

1.3 檢測方法 觀察組與對照組血清樣品的收集和儲存：均無菌采取4 ml新鮮血液，離心后，將血清置于EP 試管中并保存在-70 ℃直至使用。提取血清總RNA：將從冰箱中取出的血清樣本立即在37 ℃水浴中融化2 min，再取300μl 血清根據miRcute miRNA 試劑盒說明進行提取和分離處理。反轉錄：根據miRcute miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒使用說明進行操作。反應條件為：16 ℃，30 min→42 ℃，30 min→85 ℃，5 min。RT-PCR：構建20 μl 的 cDNA擴增反應體系：95 ℃，10 min 預變，95 ℃，10 s 變性，60 ℃，20 s 退火，72 ℃，10 s 延伸，共 40 個循環。之后繼續在 72 ℃延長5 min。U6作為內參。全部試驗均重復3次，采用2-ΔΔCt表示microRNA-143的相對表達量。

1.4 隨訪 通過電話或門診方式對患者進行隨訪48個月，分析microRNA-143的相對表達水平與患者的預后指標的關系。

1.5 統計學分析 采用SPSS 22.0 版統計學軟件進行數據分析。符合正態分布的計數資料以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，不同臨床病理參數間的microRNA-143 表達情況以百分數表示，行χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組一般資料比較 兩組研究對象的性別、年齡、吸煙、飲酒、體質量指數一般資料比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 兩組研究對象一般資料比較

2.2 觀察組與對照組的血清microRNA-143 表達水平的比較 觀察組血清microRNA-143 的相對表達量為（0.68±0.32），對 照 組 為（0.87±0.26）。 觀 察 組 血 清microRNA-143 的相對表達量顯著低于對照組（t=3.186，P=0.002）。

2.3 膀胱癌患者血清microRNA-143 的表達水平與各臨床參數的關系分析 結果顯示不同性別、年齡的膀胱癌患者血清miR-143 表達水平差異均無統計學意義（均P＞0.05）；而不同病理分級、是否遠處轉移、是否淋巴結轉移、不同臨床分期的膀胱癌患者血清microRNA-143 表達水平差異均有統計學意義（均P＜0.05），如表2所示。

表2 68例膀胱癌患者血清microRNA-143的表達水平與各臨床參數的關系

2.4 膀胱癌患者血清microRNA-143 的表達水平與其預后關系分析 隨訪結果符合正態分布：膀胱癌患者血清microRNA-143 的相對表達量中位數是0.652，以此為界分為高表達組與低表達祖，各34 例患者。對兩組患者進行生存時間隨訪發現，低表達組患者的生存時間為（37.53±1.85）個月，顯著低于高表達組患者的生存時間（44.97±2.00）個月，差異有統計學意義（t=2.73，P=0.008）。

3 討 論

目前為止，手術仍然是膀胱癌的主要治療方法，可輔助以放療、化療等其他治療方法。然而，仍然面臨著預后差、術后復發率高、術后生活質量較差等問題［18］。據諸多學者研究，發現了部分膀胱癌腫瘤標志物有助于膀胱癌的診斷與監測，但仍未全面、完善地應用于臨床。其中miRNA 便是可作為腫瘤診治、監測及預后評判的潛在標志物之一［19］。部分學者指出大約50%的人類腫瘤的發生進展與miRNA的表達密切相關［20］。自從2007 年首次發現膀胱癌與miRNA 的表達相關后，研究miRNA 在膀胱癌的發生進展中的作用便成為熱點［21］。已有研究顯示microRNA-143 在子宮肌層、血管平滑肌細胞、破骨細胞和脂肪細胞中高表達，其中microRNA-143能夠抑制血管平滑肌細胞的增殖，起著保持平滑肌細胞和血管之間平衡的作用［22-25］。近年來，研究發現microRNA-143在腫瘤的發生、發展中也起著重要作用。有研究發現microRNA-143-3p 通過在腫瘤的增殖、凋亡和癌細胞的上皮-間質轉化等機制中起作用，對口腔鱗狀細胞癌的發生及進展起到了抑癌基因的作用［26］。

在本研究中，應用實時熒光定量PCR 檢測血清microRNA-143 的表達水平，結果表明，膀胱癌患者血清microRNA-143 表達水平明顯低于健康受試者。這與許多研究消化系統惡性腫瘤中microRNA-143 表達情況是一致的，其中包括食道癌［27］、胃癌［29-30］、胰腺癌［30］和結腸癌［31-32］。基于此，可以推斷microRNA-143 在膀胱癌的發生、進展中起到了抑制基因的作用。同時，從本研究結果可以看出，膀胱癌患者血清microRNA-143 的表達水平隨著臨床分期的升高而逐漸降低，這提示microRNA-143表達下調可能與膀胱癌的發生和發展密切相關。根據隨訪結果和生存分析，膀胱癌患者血清microRNA-143 的表達水平中位數是0.652，以此中位數為界分為高表達組與低表達組，血清microRNA-143 低表達的膀胱癌患者的生存時間為（37.53±1.85）個月，明顯低于高表達的膀胱癌患者生存時間（44.97±2.00）個月，兩者生存率比較差異有統計學意義（P＜0.05），表明血清microRNA-143低表達膀胱癌患者的預后較差。

本課題為回顧性研究，在基本情況數據、臨床檢查、特殊檢查和其他數據的調查中存在著一定的不完整性。另外，由于樣本量較小，本課題數據統計分析不夠充分，因此仍需進一步擴大了樣本量、收集相關數據、完善實驗研究與統計學方法，以便獲得更精確的實驗結果。

綜上所述，膀胱癌患者血清microRNA-143的表達水平明顯低于健康受試者，且與臨床分期、病理分級、淋巴結轉移、遠處轉移和預后有著密切關系，其中膀胱癌患者血清microRNA-143 高表達者預后較好，提示microRNA-143 有望成為診斷膀胱癌診斷和監測的潛在標志物。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。