具有MELF浸潤的低級別子宮內膜樣癌的臨床病理特征及分子分型相關蛋白表達

馮曉敏 湯永峰 徐娟 李惠 可飛 韓梅

1南京醫科大學附屬婦產醫院南京市婦幼保健院病理科，江蘇 210029；2南京中醫藥大學附屬醫院江蘇省中醫院病理科 210029

子宮內膜癌是發生在子宮內膜的一組惡性上皮性腫瘤，是僅次于宮頸癌的第2 常見婦科惡性腫瘤。子宮內膜樣癌作為Ⅰ型子宮內膜癌的一種，預后好，5 年生存率約90%［1］，然而，患者生存率的高低除了與組織學分級相關之外，還與子宮深肌層浸潤（＞1/2）、淋巴結轉移、脈管癌栓及宮頸間質浸潤有關［2-3］。Murray等［4］在2003年第1次描述了低級別子宮內膜樣癌一種特別的肌層浸潤模式：微囊性、拉長及碎片狀（MELF）的浸潤模式，鏡下可見到微囊狀、拉長及碎片狀的腺體，表面被覆嗜酸性胞漿、扁平的細胞，局部可見到腫瘤細胞簇狀及單個胞漿淡染的細胞；周圍可見疏松的、黏液樣的間質。相關研究發現，MELF 浸潤多發生在低級別子宮內膜樣癌中，與子宮深肌層浸潤、脈管癌栓及淋巴結轉移等預后不良因素有關［5-7］。本研究回顧性研究183 例低級別子宮內膜樣癌患者，對比分析具有MELF 浸潤與無MELF 浸潤的低級別子宮內膜樣癌的臨床病理學特征及相關分子表達，并對患者進行隨訪，希望對具有MELF 浸潤模式的低級別子宮內膜樣癌的臨床處理及預后評估提供更多證據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2016 年4 月至2020 年12 月于江蘇省中醫院及南京市婦幼保健院進行全子宮切除、雙側附件切除和盆腔（或加腹主動脈旁）淋巴結清掃手術的183 例低級別子宮內膜樣癌病例，通過具有MELF 浸潤與無MELF浸潤篩選出研究組和對照組，對比分析其臨床病理學特征及相關分子特征。

1.2 方法及試劑 將低級別子宮內膜樣癌標本常規4%中性甲醛固定，上機、脫水、浸蠟、包埋，切片之后進行HE 染色。 使用羅氏全自動免疫組織化學儀（VentanaBenchMark XT）進行免疫組化標記。細胞角蛋白（CK）抗體自福州邁新生物技術開發有限公司購買，D2-40、CD34、抗體則來自北京中杉金橋生物技術有限公司，p53 蛋和MMR 蛋白（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）抗體購自福州邁新公司。每個抗體均設有陽性對照，為已確定表達陽性的組織，陰性對照用PBS 代替一抗進行染色。CK 以細胞內出現棕黃色顆粒為陽性，陽性表達定位于細胞膜或細胞質，D2-40 和 CD34 陽性可顯示脈管，p53 和 MMR 蛋白表達定位于細胞核，p53 判讀陽性標準為細胞核中出現棕褐色顆粒。p53 彌漫強陽性（＞70%）或全部陰性時，判為p53 突變型，反之判為p53 野生型，MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 蛋白細胞核均呈棕褐色為表達正常，如果有1 種及以上MMR 蛋白核無著色為表達缺失。

1.3 統計學分析 數據采用SPSS 23.0軟件進行分析，符合正態分布的計量資料以（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料以例（%）表示分類變量，比較采用Pearson 卡方及Fisher 精確概率檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 臨床病理學特征 患者年齡為（57.6±6.2）歲（48～69 歲）。按照2014 版國際婦產科聯盟（FIGO）分期標準，Ⅰ期+Ⅱ期患者170例，Ⅲ期+Ⅳ期患者13例。術后同時進行放化療者有79 例，只行化療者有104 例。統計結果顯示，伴MELF 浸潤的研究組與無MELF 浸潤的對照組相比，浸潤子宮肌層深度、淋巴結轉移、脈管癌栓方面的差異均有統計學意義（均P＜0.01），見表1。

2.2 病理學檢查

2.2.1 巨檢 183 例低級別子宮內膜樣癌標本中，134 例表現為宮腔內腫物，49 例表現為內膜輕度不規則增厚。研究組24 例標本中，18 例宮腔內可見大小不等的質脆腫物，易碎伴/不伴出血壞死，切面呈灰白灰黃色，腫瘤侵及肌層，腫物最大徑1.5～12.0 cm；6 例腫塊不明顯，僅表現為內膜輕度不規則增厚。研究組與對照組的低級別子宮內膜樣癌標本巨檢情況差異無統計學意義。

2.2.2 鏡下 經典型低級別子宮內膜樣癌肌層內可見腺泡狀或乳頭狀生長的腫瘤性腺體，可伴有少量實性成分。MELF 浸潤模式除了上述組織學特征之外，還可見微囊性、拉長的裂隙樣及碎片狀腺體，上皮細胞呈立方或扁平狀，細胞漿呈淡染、嗜酸性（圖1A、B、D）。MELF 浸潤模式一般出現在腫瘤浸潤的前沿部分；MELF浸潤腺體周圍可出現疏松的黏液樣、水腫的纖維間質（圖1B）；部分病例可見到單個細胞或嗜酸性的腫瘤細胞簇，這些細胞與泡沫樣組織細胞相似，在細胞內及細胞間可見到淋巴細胞及中性粒細胞的浸潤（圖1A、B）。部分病例可見脈管內癌栓（圖1C、E、F）；部分病例可見淋巴結轉移，大多數轉移淋巴結中可見被膜下竇內單個細胞、嗜酸性腫瘤細胞簇或微囊性、拉長型腺體（圖2）；而無MELF 浸潤的低級別子宮內膜樣癌淋巴結轉移灶癌細胞多呈巢團狀分布，少見單個細胞轉移。

圖1 具有微囊性、拉長及碎片狀（MELF）肌層浸潤特征的低級別子宮內膜樣癌的鏡下情況。A、B 為疏松的黏液及炎細胞背景中可見到微囊性、拉長（A）及碎片狀（B）的腺體，被覆上皮呈立方、扁平狀（HE ×200），C 為脈管內可見到嗜酸性的腫瘤細胞及腫瘤細胞簇（HE ×200），D 為CK 顯示MELF 腺體及細胞陽性（EnVision法 ×200），E為CD34標記脈管（EnVision法 ×200），F為CK標記脈管內癌栓（EnVision法 ×200）

圖2 淋巴結轉移表現。A、B 為淋巴結被膜下竇內可見細胞漿呈嗜酸性的單個腫瘤細胞及腫瘤細胞簇，黑色箭頭所指（HE ×200），C、D為細胞角蛋白顯示被膜下陽性的腫瘤細胞及腺體（EnVision法 ×200）

2.3 免疫組織化學結果 CK 免疫標記可顯示不易分辨的MELF 型腺體、單個細胞及淋巴結轉移灶。CK、D2-40、CD34 同時陽性可顯示脈管內癌栓。研究組24 例低級別子宮內膜樣癌中，21 例可見脈管癌栓，15 例可見淋巴結轉移，其中6 例可見腹主動脈旁淋巴結轉移。對照組159 例低級別子宮內膜樣癌中，39 例可見脈管癌栓，4 例可見淋巴結轉移，其中2 例可見腹主動脈旁淋巴結轉移。研究組和對照組的突變型p53 表達率分別為16.7%（4/24）和6.3%（10/159）。研究組和對照組的MSH2-MSH6 缺失率分別為8.3%（2/24）和1.3%（2/159），MLH1-PMS2 缺失率分別為 4.2%（1/24）和 7.5%（12/159），PMS2 缺失率分別為 0 和9.4%（15/159），MSH6 缺失率分別為 4.2%（1/24）和 3.1%（5/159）。見表1。

2.4 隨訪結果 183例患者隨訪時間為（32.2±6.5）個月（7～56個月）。隨訪期間內，研究組有2例復發，1例失訪。對照組有1例復發，3例失訪，其余未見進展。去掉失訪病例和無進展病例，兩組對比差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組低級別子宮內膜樣癌的臨床病理特征及分子分型相關蛋白表達[例（%）]

3 討 論

具有MELF 浸潤模式的子宮內膜樣癌是一類比較特殊的子宮內膜樣癌，由 Murray 等［4］在 2003 年首次提出。此類腫瘤主要表現為子宮肌層內可見MELF 的腺體及單個腫瘤細胞，周圍可見纖維水腫的黏液樣間質以及大量的炎細胞。研究表明，MELF浸潤模式通常發生在低級別子宮內膜樣癌中，且脈管癌栓及淋巴結轉移較常出現。Hertel 等［8］也發現，MELF 型肌層浸潤的存在與淋巴結轉移呈正相關，但是大多數形態學不典型，低倍鏡很難識別。國外關于MELF浸潤模式的子宮內膜樣癌的發生率在10%～20%之間［8］，國內相關報道較少，我們觀察了2 家三甲醫院的近5 年MELF型子宮內膜樣癌的病理報告檢出率均小于5%。本文回顧性分析低級別子宮內膜樣癌183例，檢出24例伴MELF浸潤的低級別子宮內膜樣癌（發生率為13.1%）。

本研究中，研究組患者臨床表現多為陰道不規則出血、月經紊亂或絕經后出血，巨檢有18 例子宮內膜可見大小不一的腫物，6 例表現為子宮內膜不同程度的增厚。其中3 例合并子宮腺肌癥，5 例合并子宮平滑肌瘤，以上臨床特征與對照組比較，差異均無統計學意義。其他相關研究也證實，單純子宮內膜樣癌患者與同時合并子宮腺肌癥的子宮內膜癌患者的無病生存率和總生存率差異均無統計學意義［9］。

鏡下可見MELF 浸潤模式大多數發生在低級別子宮內膜樣癌中，多位于腫瘤浸潤的最前面，以微囊性、裂隙樣腺體及碎片狀、單個腫瘤細胞在肌層中浸潤為特征，腺體被漿呈淡染、嗜酸性；最具有特征的是其周圍間質呈疏松黏液、水腫樣，并見到不同種類的炎性細胞浸潤。具有MELF 結構的低級別子宮內膜樣癌常伴有淋巴結轉移，鏡下多表現為淋巴結被膜下竇內單個腫瘤細胞、腫瘤細胞簇或微囊性腺體，胞漿豐富且呈嗜酸性。CK、D2-40、CD34 共同表達可顯示脈管癌栓和淋巴結內的轉移灶。目前尚無識別MELF 結構的特異性指標，主要依靠形態學診斷，上述形態學特征和腫瘤的間質背景可以幫助識別MELF 形態。越來越多的研究表明，與普通型低級別子宮內膜樣癌相比，MELF形態特征的腫瘤細胞周圍間質炎細胞中T 淋巴細胞和CD68 陽性的巨噬細胞較少，而間質富于T 淋巴細胞才是預后良好的指標［10］，腫瘤周圍浸潤灶中巨噬細胞的減少也通常與預后不良有關［11］。

有文獻統計，在464 例子宮內膜樣癌中，其中伴MELF浸潤的子宮內膜樣癌60 例（60/464，12.9%），對比有與無MELF 浸潤的子宮內膜樣癌時，發現有MELF 浸潤者更易發生淋巴結轉移（18.3%比1.2%）［6］。也有研究證實淋巴結轉移是子宮內膜癌的獨立危險因素［12］，合并腹主動脈旁淋巴結轉移的患者比盆腔淋巴結轉移的患者預后更差［13］。本研究183 例低級別子宮內膜樣癌中，研究組患者在深肌層浸潤發生率、脈管癌栓陽性率、淋巴結轉移率方面明顯高于對照組（分別為 91.6% 比 17.6%、87.5% 比 3.1%、62.5% 比2.5%），與Joehlin 等［6］的研究結果相似。本研究同時發現，研究組的腹主動脈旁淋巴結轉移率亦明顯高于對照組（25.0%比1.3%）。有研究發現，合并盆腔淋巴結或腹主動脈旁淋巴結轉移的子宮內膜癌患者的5 年生存為44%～52%［14］，而具有MELF浸潤的子宮內膜樣癌通常伴有更高的淋巴結轉移率。Mariani等［15-16］研究認為出現深肌層浸潤是患者發生肺、肝等遠處轉移的主要預測指標，也是低級別子宮內膜癌患者出現復發和死亡的重要因素，建議臨床醫生對深肌層浸潤患者進行積極的術后輔助治療。

2020 年第5 版世界衛生組織分類依據子宮內膜樣癌的分子特征將其分為4 型：POLE（polymerase epsilon）-超突變型、MMR（mismatch repair）-缺失型、p53 突變型和無特異性分子特征型。近年來，對于具有MELF 浸潤模式的子宮內膜樣癌的分子研究也取得了一定的進展。

眾所周知，子宮內膜癌是遺傳性非息肉病性大腸癌（hereditary nonpolyposis colortal cancer，HNPCC）家族中最常見的腸外腫瘤之一，HNPCC 是一種由錯配修復基因MMR突變引起的常染色體顯性遺傳病，又稱林奇綜合征。MMR蛋白主要有4 種（MLH1、MSH2、MSH6 和PMS2），林奇綜合征中最常見的突變基因為MLH1 和MSH2，4 個蛋白質只有兩兩配對（MLH1-PMS2 和MSH2-MSH6）后才可以有效的發揮生物學功能，MSH2 突變可導致MSH2-MSH6 的表達缺失，MSH6突變一般只導致MSH6表達缺失；MLH1突變可導致 MLH1-PMS2 表達缺失，PMS2 突變一般只導致PMS2 表達缺失［17］。有研究對4 種MMR 蛋白進行免疫組化檢測發現，具有MELF 浸潤模式的腫瘤中MSH2-MSH6缺失發生率比無MELF 浸潤的子宮內膜癌更高（MELF 型為7.14%，無MELF型為3.96%），而無MELF浸潤模式的腫瘤中更容易發生 MLH1-PMS2 表達缺失（無 MELF 型為 32.67%，MELF 型為21.43%），表明它們可能具有不同的分子特征，會有不同的臨床處理［18］。本研究中，研究組MSH2-MSH6 缺失率和MSH6 單獨缺失率均高于對照組，而研究組的MLH1-PMS2缺失率及PMS2單獨缺失率均低于對照組，與上述研究結果有相似的傾向性，同時也發現研究組中由MSH2 突變導致的MSH2-MSH6 缺失發生率較高。有研究表明，MSH2 突變導致女性患癌的風險最高［19］。但本研究中，研究組與對照組中的MSH2-MSH6 的缺失發生率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），而MMR 基因突變是否會影響預后及個體化的臨床治療，還有待于更大樣本量的研究進一步證實。

p53為腫瘤抑制基因，是人類惡性腫瘤中最容易發生改變的基因，目前在子宮內膜癌中被廣泛研究，p53 突變約占所有低級別子宮內膜樣癌的10%，多見于高級別子宮內膜樣癌，約50%的高級別子宮內膜樣癌可發生p53 突變，而低級別子宮內膜樣癌突變比率較少。本研究對象均為低級別子宮內膜樣癌，發現研究組比對照組更容易發生p53 突變，突變型 p53 表達率分別為 16.7%（4/24）和 6.3%（10/159）。突變型p53 屬于轉錄因子，它能調節細胞周期，促進細胞的增殖和惡化。p53 突變是子宮內膜癌患者預后不良的重要因素之一，也和子宮內膜癌患者生存期的長短有著直接關系［20］。

子宮內膜癌是目前已知POLE 基因突變比例最高的惡性腫瘤［21］。許多研究表明POLE 突變型子宮內膜癌可能會有更好的預后，但并不是所有的研究都證明這種情況的存在［22-24］。He 等［25］的研究表明 POLE 突變型腫瘤并不總是有良好的預后，特別是當POLE 突變型與MELF 浸潤模式同時存在時，MELF 型浸潤增加了15.1 倍的腫瘤進展風險，而這種現象在POLE 野生型亞組中并不存在。因此推測MELF浸潤模式可能是POLE 突變型腫瘤復發或進展風險的一個可能的預測因子，但是連接MELF 和POLE 突變的生物學機制仍然是未知的。本研究POLE 基因的相關實驗正在進行中，結果尚不完整，后續結果我們會進一步報道。

總之，子宮內膜樣癌的分子分型對于確定患者治療方案、評估預后及篩查林奇綜合征有著很重要的意義，掌握MELF型子宮內膜樣癌特殊的分子學特征，有望為患者的個體化治療及預后評估提供新思路。

本研究對183 例低級別子宮內膜樣癌患者進行了隨訪，隨訪時間為（32.2±6.5）個月（7～56 個月），隨訪期間內，研究組中有2例復發，對照組中有1例復發，兩組對比，差異有統計學意義（P＜0.05）。研究組中2 例患者分別在術后36 個月和39 個月復發，對照組中1 例患者在術后54 個月復發，也有研究發現MELF 浸潤型子宮內膜樣癌患者的復發間隔時間較短［26］。另外本研究中，研究組與對照組的深肌層浸潤、淋巴結轉移、脈管癌栓及隨訪結果方面，差異均有統計學意義（均P＜0.05），提示MELF 浸潤模式可能為低級別子宮內膜樣癌的不良預后因子。MELF 浸潤模式是否能夠成為子宮內膜樣癌的獨立預后因素尚有爭議。Hertel等［8］研究證實，MELF 浸潤模式是子宮內膜樣癌的獨立預后因素，更容易出現術后復發，但MELF 浸潤對子宮內膜樣癌患者總體生存率無影響。與之相反，也有部分研究表明MELF 浸潤模式并不能成為子宮內膜樣癌低生存率的獨立相關因素［5］。

綜上所述，MELF浸潤模式作為子宮內膜樣癌一種特殊的浸潤方式，其發生可能與多種基因協作機制有關。病理醫師應熟練掌握其特殊的形態學特征，當發現MELF 浸潤時，應仔細評估肌層浸潤深度、脈管癌栓及淋巴結轉移情況，必要時行免疫組化檢測輔助診斷，同時建議將其臨床病理學特征與分子分型相結合，共同用于子宮內膜癌的風險評估中，以更有效的明確對預后的影響，也有望為臨床提供更精確和個體化的治療方案，因本研究病例數和隨訪時間有限，MELF 浸潤對患者總體生存率是否有影響，還需大樣本量的研究及長期隨訪。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。