非小細胞肺癌組織DSG3與Ki-67表達相關性及預后意義

趙甜甜 滕圣敏 滿其榮 王祥閣 張新東

1濟寧醫學院附屬滕州市中心人民醫院病理科，山東 277500；2濟寧醫學院附屬滕州市中心人民醫院腫瘤科，山東 277500

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌總數的75%～80%，是肺癌最主要的病理類型，其5年總生存率低于15%，肺癌患者生存率低的原因包括肺癌確診較晚，并且有些難以有明確的病理診斷導致錯過最佳治療時機，腫瘤出現轉移，缺少明確判斷預后和監測治療反應的標志物等［1］。Ki-67 表達于增殖細胞中，是與腫瘤細胞增殖相關的核蛋白，可用于判斷腫瘤的增殖性和侵襲性［2］。細胞橋粒芯蛋白（desmoglein，DSG）3 是構成復層上皮橋粒的重要跨膜蛋白，橋粒是上皮細胞間的細胞連接結構，如果上皮細胞中的DSG3 表達異常，將會影響橋粒連接的形成，根據其自身的結構和功能特點，DSG3在腫瘤細胞中的異常表達必然與腫瘤轉移和患者預后相關。臨床上DSG3 在腫瘤中應用較多的是作為鱗癌標志物應用于鑒別診斷鱗癌與其他類型腫瘤，最新研究顯示DSG3 在一些上皮性腫瘤如食管癌、直腸癌或頭頸部腫瘤等有異常表達，并且其表達量的減少或增多與腫瘤的致癌或抑癌過程明顯相關［3-4］。本研究使用免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）方法檢測DSG3 在肺鱗狀細胞癌和肺腺癌等NSCLC 組織中的表達，分析其與腫瘤增殖標志物Ki-67 及與預后相關的臨床病理指標的相關性，探討DSG3的表達狀態對NSCLC患者預后的影響。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 收集滕州市中心人民醫院在2015 年7 月至2019 年12 月期間經外科手術切除的NSCLC標本72 例，包括肺鱗狀細胞癌30 例，肺腺癌42 例。其中男51 例，女 21 例。年齡范圍 46～80 歲，中位年齡 65 歲。所有標本經術后常規組織病理確診為肺鱗狀細胞癌或肺腺癌。本研究使用NSCLC患者手術切除的石蠟組織標本做相關檢測，所有檢測符合滕州市中心人民醫院醫學倫理委員會的相關要求。

1.1.2 實驗儀器和試劑 全自動免疫組織化學染色機（型號Leica BOND-MAX）購自德國徠卡公司；一抗DSG3（鼠抗人單克隆抗體，克隆號：5G11）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Ki-67（鼠抗人單克隆抗體，克隆號：MIB-1）購自福州邁新生物技術公司；二抗免疫顯色試劑購自上海徠卡生物系統公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測方法和結果判讀 所有標本使用10%中性甲醛緩沖液固定12～24 h，經全自動脫水機固定、脫水、透明后，石蠟包埋，做連續切片，切片厚度為4～5μm，裱貼于黏附載玻片（已經APES 處理）上，于65 ℃烤片30 min，全自動免疫組織化學染色機染色，染色程序結束后，脫水透明，中性樹膠封片。更換不同批次的抗體時均設陽性對照和陰性對照。免疫組化結果判讀由兩位高年資主治醫師共同閱片。DSG3陽性表達結果為細胞膜有棕褐色顆粒沉著，當陽性細胞數多于腫瘤細胞總數的10%或灶性區域出現強陽性表達時即可定義為DSG3 表達陽性；Ki-67 陽性表達結果為位于細胞核的棕褐色顆粒，表達值是陽性細胞數占腫瘤細胞總數的比值，需至少計數500個腫瘤細胞。

1.2.2 隨訪 采用電話、門診和住院的方式隨訪患者的總生存期。隨訪截止時間是2019 年12 月。隨訪時間13～52 個月，中位隨訪時間是28 個月。總生存期是從確診腫瘤開始，至因任何原因引起死亡或隨訪截止日期的時間。

1.2.3 統計學方法 使用Graph pad6.0 軟件對所有數據做統計學檢驗并作圖。各計量資料均符合正態分布。各組 Ki-67 表達值以（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；使用χ2檢驗計算分析DSG3 表達相關影響因素；使用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并通過Log-rank檢驗比較兩組生存曲線之間的差異。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 NSCLC 組織DSG3 和Ki-67 的表達水平 使用免疫組化方法檢測72 例NSCLC 標本中DSG3 和Ki-67 的表達，包括肺鱗狀細胞癌30 例，肺腺癌42 例。結果顯示DSG3 表達陽性29 例，陰性 43 例，陽性表達率40.28%；肺鱗狀細胞癌組與肺腺癌組Ki-67表達分別為（35.00±14.02）%、（28.81±13.83）%，兩組比較差異無統計學意義（P=0.067）；DSG3 陽性組與 DSG3 陰性組 Ki-67 表達分別為（27.07±12.21）%、（34.30±14.74）%，兩組比較差異有統計學意義（P=0.032），DSG3 陽性組的 Ki-67 表達值明顯低于 DSG3 陰性組。

2.2 NSCLC 組織DSG3表達相關影響因素分析 72例NSCLC 標本中，DSG3 表達陽性29 例，陽性表達率40.28%。DSG3表達狀態與腫瘤的病理類型明顯相關，肺鱗狀細胞癌組DSG3 陽性表達率明顯高于肺腺癌組（P＜0.001）；DSG3 表達陽性與腫瘤分化程度相關（P=0.033），腫瘤分化越差，DSG3 陽性表達率越低；DSG3 表達陽性與淋巴結是否出現轉移相關（P=0.016），淋巴結轉移組的DSG3 陽性表達率明顯低于無轉移組；DSG3表達狀態與其余臨床病理特征均無明顯相關性（均P＞0.05）。見表1。

表1 NSCLC組織中DSG3表達相關影響因素分析

2.3 DSG3 表達與NSCLC 患者預后的關系 使用Kaplan-Meier法對72例NSCLC患者進行生存分析，DSG3表達陽性組患者中位生存時間26 個月，DSG3 表達陰性組患者中位生存時間30 個月；患者的總生存期在DSG3 陽性表達組與DSG3陰性表達組無明顯差異（P=0.204）。見圖1。

圖1 NSCLC患者DSG3陽性組（29例）與DSG3陰性組（43例）的生存曲線

3 討 論

目前發現 DSG 有 4 種亞型，為 DSG1、DSG2、DSG3、DSG4，它與橋粒膠蛋白（desmocollin，DSC）組成鈣黏素超家族，并與橋粒斑蛋白（desmoplakin，DP）共同組成細胞黏附結構橋粒或半橋粒［5］，橋粒連接通過影響細胞之間的信號傳導參與調節上皮細胞的形成、增殖和分化過程。一些臨床研究和體外實驗已經明確證實DSG3 的表達水平與腫瘤的臨床分期和轉移有關［6-7］。DSG3 也是鱗狀上皮細胞比較敏感、特異的標志物，有文獻報道，DSG3在肺鱗狀細胞癌組織中有大量表達［8］。之前的研究發現，在NSCLC 組織中，應用免疫組織化學方法檢測DSG3 的表達可有效區分肺鱗狀細胞癌和肺腺癌，尤其是在低分化肺癌標本，可提高肺癌診斷準確率，更好地指導臨床治療［9］。

Ki-67是存在于細胞核基質的增殖抗原，它表達于細胞分裂周期除靜止期（G0 期）以外的各個時期，一旦增生期結束，細胞內表達的Ki-67就會迅速降解。所以Ki-67表達水平的高低反映腫瘤細胞的增殖速度，常被臨床應用為評估肺癌預后的指標［10］。本研究統計結果顯示，Ki-67表達在肺鱗狀細胞癌組與肺腺癌組中差異無統計學意義。既往有研究，DP 表達的缺失與乳腺癌轉移相關，DP 的表達與Ki-67 表達呈負相關趨勢［11］，但迄今暫未查詢到 DSG3 與Ki-67 表達關系的研究。本研究發現，DSG3 陽性組Ki-67 表達低于DSG3 陰性組，與上述研究結果大體相一致，這提示DSG3 表達陽性的NSCLC 患者預后較陰性組好。但值得注意的是，Ki-67 并不是影響NSCLC 患者預后的獨立因素，由于其本身和腫瘤的病理類型、臨床分期和組織學分級等與腫瘤預后因素有一定的相關性［12］。

DSG3 廣泛分布在皮膚、食管、直腸、肺等器官，它是自身免疫性疾病天皰瘡的自身抗原，天皰瘡患者體內含有針對DSG3的抗體，由于DSG3是上皮細胞間連接的重要結構，DSG3表達的缺失可導致角質形成細胞橋粒間隙增加，因此出現上皮棘層細胞松解和水皰形成［13］。由于其自身結構和功能特點，DSG3在腫瘤細胞中的異常表達必然與腫瘤轉移和患者預后相關，但DSG3 的作用是致癌還是抑癌，眾多研究結果并不一致［14］。本研究用免疫組織化學方法檢測DSG3 在肺鱗狀細胞癌和肺腺癌組織中的表達，結果發現DSG3 陽性表達率在鱗癌組明顯高于腺癌組，這可能與DSG3 是鱗癌組織特異性標志物有關。本研究選取了與腫瘤預后相關的一些指標包括年腫瘤大小、分化程度和是否有淋巴結轉移等，分析其是否與DSG3 的表達有相關性，結果顯示DSG3的表達與腫瘤分化程度有關，腫瘤的分化程度越差，DSG3 的陽性表達率越低，這與一些研究結果相同［15-16］。Xin 等［17］在研究口腔鱗癌 DSG3 的異常表達時，發現DSG3表達減少與腫瘤分化差、淋巴結轉移率高等腫瘤惡性行為相關。本研究結果還顯示，無淋巴結轉移時DSG3陽性表達率顯著高于有淋巴結轉移。根據以上統計結果提示DSG3表達陽性預示腫瘤分化程度較好，出現淋巴結轉移的概率低，預后好于DSG3陰性表達者。

為進一步明確DSG3的預后意義，我們就患者的總生存期進行了回訪，統計結果顯示NSCLC 患者的總生存期在DSG3 陽性組和DSG3 陰性組差異無統計學意義。分析原因：一是癌癥的發生發展是由多因素共同參與，雖然DSG3的表達影響腫瘤的分化和進展，但在患者的預后方面它可能不起決定性作用，因此DSG3的表達狀態對患者的總生存期沒有影響；二是近年來的分子靶向治療主要針對肺腺癌患者，如EGFR 陽性突變患者其在應用靶向藥物后生存期較使用普通化療方案患者生存期可延長3～4 倍［18］，而DSG3 表達陽性率，肺鱗狀細胞癌高于肺腺癌，并且靶向治療在肺鱗狀細胞癌患者中研究應用少，所以分子靶向治療方案的應用延長了肺腺癌患者的總生存期，從這一點上不能明確說明DSG3是否影響患者的預后。

綜上所述，本研究從臨床病理特征和與Ki-67 相關性表達兩個方面上說明DSG3 的表達狀態對NSCLC 患者的預后有一定影響，但也有研究顯示不同的結果，認為NSCLC患者DSG3 表達陽性預示不良的預后［19］。NSCLC 患者生存率較低的原因是肺癌確診較晚，有些難以有明確的病理診斷導致錯過最佳治療時機，缺少明確判斷預后和監測治療反應的標志物，DSG3既可以輔助病理醫生明確診斷肺癌的病理類型，又可以輔助臨床醫生判斷患者預后，從而指導治療，所以DSG3不失為一個重要的腫瘤標志物。在下一步的工作中我們需要做進一步的相關研究，在研究對象的選擇上入組標準更加統一化，并且擴大樣本量，以得出明確結論。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。