恩諾沙星對(duì)球等鞭金藻生長(zhǎng)及脂肪酸的影響

許燕茹 林崗

摘?要：以球等鞭金藻Isochrysis galbana為研究對(duì)象，分析不同濃度恩諾沙星（ENR）處理下，球等鞭金藻的生長(zhǎng)和脂肪酸組成變化。通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)法和分光光度法測(cè)定球等鞭金藻的生長(zhǎng)變化，采用氣相色譜法測(cè)定球等鞭金藻的脂肪酸組成和含量。結(jié)果表明：恩諾沙星對(duì)球等鞭金藻的生長(zhǎng)表現(xiàn)出低促高抑的作用，當(dāng)恩諾沙星處理濃度≤0.625 mg·L-1??時(shí)表現(xiàn)出促進(jìn)作用，恩諾沙星處理濃度≥5 mg·L-1??時(shí)表現(xiàn)出抑制作用，但未體現(xiàn)濃度-效應(yīng)關(guān)系。在恩諾沙星的脅迫下，球等鞭金藻脂肪酸組成和含量均發(fā)生變化;隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，球等鞭金藻脂肪酸總含量呈降低趨勢(shì)，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為24、96 h時(shí)，各濃度組不飽和脂肪酸含量均低于對(duì)照組（ENR濃度為0 mg·L-1??），DHA含量與對(duì)照組差異不顯著;當(dāng)恩諾沙星處理濃度≥5 mg·L-1??，培養(yǎng)時(shí)間為240 h時(shí)，球等鞭金藻不飽和脂肪酸含量極顯著高于對(duì)照組，DHA含量顯著高于對(duì)照組。因此，在恩諾沙星脅迫下，球等鞭金藻中的不飽和脂肪酸占比得以提高。

關(guān)鍵詞：球等鞭金藻;恩諾沙星;脂肪酸;脅迫

中圖分類(lèi)號(hào)：S 917.3?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號(hào)：0253-2301（2021）09-0008-07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.09.002

Effects of Enrofloxacin on the Growth and Fatty Acids of Isochrysis Galbana

XU Yan?ru?1， LIN Gang

（1. College of Life Sciences， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350117， China; 2. Fujian Key Laboratory

of Sustainable Utilization of Featured Marine Biological Resources， Fuzhou， Fujian 350117， China）

Abstract： In this study， by taking Isochrysis galbana as the research object， the growth and the changes of fatty acid composition of Isochrysis galbana were analyzed under the treatments of different concentrations of enrofloxacin. The growth changes of Isochrysis galbana were measured by using the cell counting method and spectrophotometric method， and the composition and content of fatty acid in Isochrysis galbana were measured by using the gas chromatographic method. The results showed that enrofloxacin exhibited a low?promoting and high?inhibiting effect on the growth of Isochrysis galbana， namely， showing a promoting effect when the concentration of enrofloxacin was ≤0.625??mg·L-1??， and showing an inhibiting effect when the concentration of enrofloxacin was ≥5 mg·L-1??， but there was no concentration?effect relationship. Under the stress of enrofloxacin， the composition and content of fatty acid in Isochrysis galbana changed. With the increase of incubation time， the total content of fatty acid in Isochrysis galbana decreased， and when the incubation time was 24 h and 96 h， the content of unsaturated fatty acid in each concentration group was lower than that in the control group （the concentration of enrofloxacin was 0

mg·L-1??）， and the content of DHA was not significantly different from that in the control group. When the concentration of enrofloxacin was ≥5 mg·L-1?and the incubation time was 240 h， the contents of unsaturated fatty acid and DHA in Isochrysis galbana were significantly higher than those in the control group. Therefore， the proportion of unsaturated fatty acids in Isochrysis galbana was increased under the stress of enrofloxacin.

Key words： Isochrysis galbana; Enrofloxacin; Fatty acids; Stress

金藻門(mén)的球等鞭金藻Isochrysis galbana是單細(xì)胞微藻，無(wú)細(xì)胞壁，有兩條等長(zhǎng)的鞭毛，富含色素、蛋白質(zhì)、脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有個(gè)體大小適中，易被貝類(lèi)幼蟲(chóng)捕捉、吞噬、消化吸收，代謝產(chǎn)物對(duì)貝類(lèi)幼蟲(chóng)無(wú)毒等餌料藻類(lèi)所需條件，可作為水產(chǎn)養(yǎng)殖的活體餌料[1] 。球等鞭金藻富含不飽和脂肪酸，能提高水生生物幼體時(shí)期的孵化率、存活率和生長(zhǎng)率[2] ，是廣泛使用的海產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物幼體的理想基礎(chǔ)餌料。

恩諾沙星（Enrofloxacin， ENR）是第三代喹諾酮類(lèi)抗菌藥物，是第一個(gè)動(dòng)物專(zhuān)用的抗生素[3] ，也是我國(guó)目前水產(chǎn)養(yǎng)殖允許使用的抗生素藥物之一[4] 。ENR可以通過(guò)抑制酶的切割和連接作用，從而阻礙細(xì)菌DNA的復(fù)制，達(dá)到抗菌的目的，其具有抗菌廣譜性、抗菌活性強(qiáng)等特點(diǎn)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中得以廣泛應(yīng)用[5] 。抗生素對(duì)藻類(lèi)具有抑制作用和毒性，同種抗生素對(duì)不同藻類(lèi)的影響不同[6-7] ，有研究表明ENR對(duì)斜生柵藻、銅綠微囊藻、小球藻等具有一定的毒性作用，對(duì)這3種微藻均存在生長(zhǎng)抑制作用，且表現(xiàn)出濃度-效應(yīng)關(guān)系[8-10] 。不同抗生素對(duì)金藻的影響亦有報(bào)道，張鶯臍等[11] 認(rèn)為氟苯尼考對(duì)球等鞭金藻的生長(zhǎng)呈“低促高抑”的作用，且引起細(xì)胞內(nèi)總脂肪酸含量顯著降低;恩諾沙星和鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)球等鞭金藻的毒理危害等級(jí)分別為高毒和中毒，恩諾沙星的劑量、抑制效應(yīng)關(guān)系表現(xiàn)良好[12] ;土霉素和氯霉素均減小了湛江等鞭金藻增長(zhǎng)期的增幅，加快衰退[13] 。

低濃度的抗生素使環(huán)境中易產(chǎn)生耐抗生素菌和抗性基因，存在潛在的生態(tài)毒理效應(yīng)[14] 。因此，為探究球等鞭金藻對(duì)ENR脅迫的響應(yīng)，本研究擬在低于致死濃度的ENR處理下，研究球等鞭金藻的生物量、脂肪酸含量及組成的變化，以初步了解恩諾沙星脅迫對(duì)球等鞭金藻的生長(zhǎng)和脂肪酸合成積累的影響。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

球等鞭金藻OA3011（GYH15 Isochrysis galbana OA3011）來(lái)自福建省微藻種質(zhì)改良工程技術(shù)研究中心保種，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)培至一定濃度時(shí)得到試驗(yàn)材料。恩諾沙星（ENR）注射液（合肥中龍神力動(dòng)物藥業(yè)有限公司，獸藥字120151295，規(guī)格10 mL∶0.25 g）。試驗(yàn)過(guò)程中所用器具均經(jīng)121℃滅菌鍋中高溫滅菌。

1.2 ?藻類(lèi)培養(yǎng)

選用F/2培養(yǎng)基，按照1∶2接種量接種藻液，海水鹽度為（29±1）‰，pH為（8.00±0.10），培養(yǎng)體積為1 L，錐形瓶瓶口使用無(wú)菌透氣封口膜封口以防污染，培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，培養(yǎng)光照為4000??lx，光暗比為12L∶12D，每天定期搖藻3次，培養(yǎng)周期10 d。試驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組（ENR濃度為0 mg· L-1??）、低濃度組（ENR濃度為0.3125、0.625 mg· L-1??）、中濃度組（ENR濃度為1.25、2.5 mg· L-1??）、高濃度組（ENR濃度為5、10 mg· L-1??），每個(gè)濃度組各設(shè)3個(gè)平行。

1.3 ??生物量測(cè)定

1.3.1?細(xì)胞密度測(cè)定?取1 L原藻液稀釋成5個(gè)不同濃度梯度，通過(guò)酶標(biāo)儀（INFINITE 200 PRO，TECAN）測(cè)定其在波長(zhǎng)680 nm處的OD值，并用血球計(jì)數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞密度的測(cè)定，建立OD-細(xì)胞密度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（y=17.399x-1.672，R?2= 0.998）;通過(guò)離心得到5個(gè)不同濃度梯度的藻泥后置于真空冷凍干燥機(jī)（LGJ12，松源華興）冷凍干燥至恒重，建立細(xì)胞密

度細(xì)?胞干重標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（y=0.021x+0.005，R?2=0.997），OD值與細(xì)胞密度、細(xì)胞密度與細(xì)胞干重之間均具有良好的相關(guān)性。

培養(yǎng)期間，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)680 nm處檢測(cè)對(duì)照組和各試驗(yàn)組藻液的OD值，再根據(jù)OD值細(xì)?胞密度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到細(xì)胞密度。

1.3.2?對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的比生長(zhǎng)速率?球等鞭金藻的比生長(zhǎng)速率的計(jì)算公式[15] 如下：

μ=lnxt-lnx0t

式中：Xt、X0（×10?6個(gè)·mL-1?）為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期初期和末期的細(xì)胞密度;t為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期持續(xù)的時(shí)間，本試驗(yàn)中t為 4 d。

1.4?脂肪酸提取及測(cè)定

1.4.1?脂肪酸的提取?在第0、24、96、168、240 h，收集不同濃度的恩諾沙星處理的藻液100 mL，12000??r·min-1??離心10 min獲得藻團(tuán)細(xì)胞，用蒸餾水洗滌3次，放-80℃冰箱備用，將藻團(tuán)轉(zhuǎn)至冷凍干燥機(jī)冷凍干燥48 h[16] 。先對(duì)樣品進(jìn)行甲酯化，再用1 mL正己烷對(duì)獲取的脂肪酸甲酯進(jìn)行萃取[17] ，充分混勻，用一次性注射器吸取上層溶液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，裝于棕色進(jìn)樣瓶，準(zhǔn)備氣相檢測(cè)。

1.4.2?脂肪酸成分的測(cè)定?氣相色譜分析：使用氣相色譜儀（7890A GC System，Agilent Technologies，USA）對(duì)藻細(xì)胞內(nèi)脂肪酸含量進(jìn)行檢測(cè)。色譜柱：SP2560 100M×0.2 um，色譜條件：前檢測(cè)器溫度為250℃，色譜柱加熱溫度：初始溫度為140℃，維持5 min，再以4℃·min-1?的加熱溫度加熱到250℃，再維持12.5 min，進(jìn)樣量為1 uL。標(biāo)品為SIGMA公司的Fatty Acid Methyl Ester，

C8～?C22，外加DHA，內(nèi)標(biāo)為十九酸甲酯。各主要脂肪酸含量計(jì)算，采用面積歸一化法[18] 。

1.5?數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 8.0.1軟件作圖，運(yùn)用Excel 2013軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)T檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為具有顯著相關(guān)性，當(dāng)P<0.01時(shí)認(rèn)為具有極顯著相關(guān)性，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）表示。

2?結(jié)果與分析

2.1?恩諾沙星對(duì)球等鞭金藻生長(zhǎng)的影響

2.1.1?恩諾沙星對(duì)球等鞭金藻細(xì)胞密度的影響?不同濃度ENR對(duì)球等鞭金藻生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖1。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為24 h時(shí)，中濃度處理組藻細(xì)胞密度在（2.51～2.78）×10?6 個(gè)·mL-1??，與對(duì)照組相比顯著增加，低、高濃度處理組與對(duì)照組差異不顯著;當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為96 h時(shí)，低濃度處理組藻細(xì)胞密度極顯著高于對(duì)照組（P<0.01），其藻細(xì)胞密度在（6.52～6.81）×10?6個(gè)·mL-1??，中、高濃度處理組與對(duì)照組差異不顯著;當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為168 h，處理濃度為0.3125??mg· L-1??時(shí)，其藻細(xì)胞密度為6.72×10?6個(gè)·mL-1??極顯著高于對(duì)照組（P<0.01），高濃度處理組藻細(xì)胞密度分別在（4.60～4.74）×10?6個(gè)·mL-1??顯著低于對(duì)照組（P<0.05）;當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為240 h時(shí)，處理濃度為0.3125??mg· L-1??時(shí)，其藻細(xì)胞密度為9.83×10?6個(gè)·mL-1??極顯著高于對(duì)照組（P<0.01），高濃度處理組藻細(xì)胞密度在（6.43～6.70）×10?6個(gè)·mL-1??顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。因此，低濃度的ENR脅迫促進(jìn)了球等鞭金藻的生長(zhǎng)，而高濃度的ENR會(huì)抑制球等鞭金藻的生長(zhǎng)。

2.1.2?恩諾沙星對(duì)球等鞭金藻比生長(zhǎng)速率的影響?不同濃度ENR處理后，球等鞭金藻比生長(zhǎng)速率見(jiàn)圖2，低濃度處理組球等鞭金藻的比生長(zhǎng)速率高于對(duì)照組，分別為0.323和0.312;中、高濃度處理組球等鞭金藻的比生長(zhǎng)速率在0.246～0.257，低于對(duì)照組的0.262?。當(dāng)ENR處理濃度≥1.25?mg·L-1??時(shí)，其比生長(zhǎng)速率并未表現(xiàn)出濃度-效應(yīng)關(guān)系。

2.2?恩諾沙星對(duì)球等鞭金藻細(xì)胞脂肪酸的影響

2.2.1?恩諾沙星對(duì)球等鞭金藻脂肪酸總含量的影響??20種常見(jiàn)混合脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)品溶液氣相色譜圖見(jiàn)圖3，球等鞭金藻提取的脂肪酸氣相色譜圖見(jiàn)圖4，不同濃度ENR對(duì)球等鞭金藻脂肪酸總含量影響見(jiàn)圖5。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為24 h時(shí)，高濃度組球等鞭金藻脂肪酸總含量顯著高于對(duì)照組（P<0.05），其中處理濃度為 5 mg· L-1??達(dá)到最大值（22.80±0.98）%，低、中濃度處理組與對(duì)照組相比差異不顯著;當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為96 h時(shí)，各濃度處理組的脂肪酸含量與對(duì)照組相比差異不顯著;當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為168 h，處理濃度為 5 mg·L-1??時(shí)球等鞭金藻脂肪酸含量為（8.93±?0.27）%，顯著低于對(duì)照組（10.54±0.70）%（P<0.05）;當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為240 h時(shí)，各濃度處理組的脂肪酸含量與對(duì)照組相比差異不顯著。

2.2.2?恩諾沙星對(duì)球等鞭金藻脂肪酸組成成分的影響?不同濃度ENR對(duì)球等鞭金藻各脂肪酸組成和含量的影響見(jiàn)圖6和表1。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為24、96 h時(shí)，各濃度處理組飽和脂肪酸（SFA）含量均大于對(duì)照組，總不飽和脂肪酸含量均小于對(duì)照組，其中單不飽和脂肪酸（MUFAs）和多不飽和脂肪酸（PUFAs）含量均低于對(duì)照組，高濃度組不飽和脂肪酸含量分別在14.12%～15.89%和22.30%～24.55%，顯著低于對(duì)照組26.63%和27.50%（P

表1為培養(yǎng)時(shí)間240 h時(shí)，不同濃度ENR處理下，球等鞭金藻各脂肪酸占所檢測(cè)出總脂肪酸的百分比。試驗(yàn)組培養(yǎng)的球等鞭金藻中富含C14∶0?、C16?系列、C18?系列、C20∶1?、C22∶1?、C22∶6?（DHA）等脂肪酸，其中以C16∶0??居多。隨著處理濃度的增加，飽和脂肪酸中的C16∶0?、C18∶0?呈下降趨勢(shì)，不飽和脂肪酸中的C18∶1?、C20∶1?呈上升趨勢(shì)，各試驗(yàn)濃度組中C18∶1?含量顯著高于對(duì)照組，高濃度處理組除C18∶2?外，其他不飽和脂肪酸含量均顯著高于對(duì)照組;當(dāng)處理濃度為5 mg· L-1??時(shí)DHA含量為（7.37±0.08）%極顯著高于對(duì)照組（6.67±0.08）%（P<0.01），處理濃度為10 mg·L-1??時(shí)DHA含量為（7.38±0.34）%顯著高于對(duì)照組（6.67±0.08）%（P<0.05）;高濃度處理組飽和脂肪酸含量分別為（63.48±0.37）%、（62.12±1.05）%，極顯著低于對(duì)照組（68.37±0.42）%（P<0.01），但單不飽和脂肪酸與之相反，高濃度處理組單不飽和脂肪酸含量分別為（22.27±0.35）%、（23.14±1.00）%，極顯著高于對(duì)照組（18.49±0.38 ）%（P<0.01），多不飽和脂肪酸含量分別為（14.25±0.09）%、（14.74±0.35）%，極顯著高于對(duì)照組（13.15±0.04）%（P<0.01）;總不飽和脂肪酸在處理濃度為10 mg· L-1??時(shí)達(dá)到最大值，為（37.88±1.05）%。試驗(yàn)組中ENR脅迫對(duì)球等鞭金藻脂肪酸組成及含量具有明顯影響。

3?討論與結(jié)論

微藻在受脅迫時(shí)，能表現(xiàn)出毒物效應(yīng)，即在低濃度下某些有毒化合物可以在一定的程度上促進(jìn)細(xì)胞的某些生理活動(dòng)[19] 。有研究表明，在一定范圍內(nèi)乙酸乙酯粗提物對(duì)球等鞭金藻細(xì)胞生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用[20] ;氨芐青霉素、鏈霉素在較低濃度時(shí)可以促進(jìn)藻體生長(zhǎng)，高于一定質(zhì)量濃度則表現(xiàn)出抑制作用，且不同藻類(lèi)響應(yīng)程度及閾值存在較大差異[21] 。本研究中，低濃度處理組球等鞭金藻的細(xì)胞密度和比生長(zhǎng)速率均大于對(duì)照組，但中濃度處理組球等鞭金藻的細(xì)胞密度和比生長(zhǎng)速率與對(duì)照組差異不顯著，未表現(xiàn)出濃度依賴(lài)特征。四環(huán)素、土霉素、恩諾沙星對(duì)球等鞭金藻、三角褐指藻的活性氧（ROS）含量均具有促進(jìn)作用，且隨濃度的增加，促進(jìn)作用越明顯[22] 。當(dāng)受到脅迫時(shí)，藻體細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧并急劇積累，膜系統(tǒng)受到損失，能引起體內(nèi)氧化脅迫，甚至引起細(xì)胞代謝紊亂，最終抑制藻體的生長(zhǎng)發(fā)育[23] 。本研究中高濃度處理組在168 h后對(duì)球等鞭金藻的生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的抑制作用，與上述研究結(jié)果類(lèi)似。

球等鞭金藻中的不飽和脂肪酸具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，特別是DHA，在許多水生動(dòng)物幼體的生長(zhǎng)過(guò)程中是必不可少的。有研究表明，在蝦、海水魚(yú)、軟體動(dòng)物等水生動(dòng)物幼體時(shí)期投喂球等鞭金藻可提高其生長(zhǎng)和存活率[24] 。經(jīng)紫外誘變的突變?cè)逯甑牟伙柡椭舅岷扛哂谠荚逯辏珼HA含量也高于原始藻株[25] ;低溫誘導(dǎo)可以提高球等鞭金藻DHA的產(chǎn)量，當(dāng)球等鞭金藻受到脅迫時(shí)，其DHA作為非酶促小分子抗氧化物質(zhì)，與抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)共同作用，清除低溫誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS[26] 。ENR脅迫也使球等鞭金藻的DHA含量得到明顯提高，與上述結(jié)果類(lèi)似。

微藻在不同的環(huán)境中，其各類(lèi)脂肪酸的比例會(huì)發(fā)生改變，脂肪酸的組成也會(huì)因此產(chǎn)生變化[27] 。在受脅迫環(huán)境條件下，生物本身為保持其正常生理功能，通過(guò)升高其自身的不飽和度，以增加細(xì)胞膜的流動(dòng)性[28] ，因此脂肪酸去飽和在受脅迫時(shí)起到重要作用[29] 。ENR脅迫下，高濃度處理組中球等鞭金藻的不飽和脂肪酸呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，可能原因是高濃度處理組的去飽和酶的活性提高，增強(qiáng)了去飽和作用，使得不飽和脂肪酸的占比得以提高。因此，抗生素脅迫也許可作為篩選高不飽和脂肪酸含量藻株的一種途徑。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）