小檗胺通過(guò)OTUB1和MDM2-p53通路調(diào)控肺癌A549細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移*

劉麗麗，徐志英，嚴(yán)佳棟，許曉東，張忠偉，余彬彬，曹 鶯

（蘇州大學(xué)附屬?gòu)埣腋坩t(yī)院，江蘇 蘇州 215600）

肺癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]。目前，肺癌發(fā)病率在男性中居第一位，在女性中居第二位[2]。非小細(xì)胞肺癌（nonsmall-cell lung carcinoma，NSCLC）在所有肺癌類型中占85%[3]。很多患者在確診時(shí)已是晚期，失去了手術(shù)的機(jī)會(huì)。傳統(tǒng)的放化療對(duì)已經(jīng)進(jìn)展的非小細(xì)胞肺癌患者效果甚微，毒副作用大，患者生存質(zhì)量低[4]，而且經(jīng)常伴有復(fù)發(fā)。因此，迫切需要尋找療效更好的藥物來(lái)治療非小細(xì)胞肺癌。

小檗胺是從小檗科植物小檗等中草藥中提取的化合物。在亞洲國(guó)家，小檗胺片用于治療各種原因引起的白細(xì)胞減少癥，而且無(wú)明顯不良反應(yīng)[5]。小檗胺有抗腫瘤的作用[6-7]，它能夠明顯抑制前列腺癌細(xì)胞侵襲[8]，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[9]。但是小檗胺對(duì)NSCLC的研究較少。去泛素化酶（DeUbiquitinating Enzymes，DUB）隸屬于蛋白酶體超家族，它通過(guò)對(duì)蛋白降解反向調(diào)節(jié)，從而影響細(xì)胞的分化、增殖。卵巢腫瘤相關(guān)蛋白酶B1（OTU domain-containing ubiquitin aldehyde-binding protein Bl，OTUB1）是DUB家族的一員，它廣泛表達(dá)于人類的肝、腎、腦等組織中。OTUB1在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)上調(diào)[10]，能夠抑制抗凋亡蛋白p53的表達(dá)[11]。鼠雙微體2基因（Murine double minute 2，MDM2）是用小鼠的MDM2 cDNA探針，從人類基因庫(kù)中篩選的一個(gè)同源基因。MDM2是p53的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子，能與p53形成自調(diào)節(jié)反饋環(huán)[12]。MDM2-p53信號(hào)通路與膠質(zhì)瘤等腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)[13]。本研究擬探討OTUB1與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及凋亡的關(guān)系，以及小檗胺與MDM2-p53信號(hào)通路的關(guān)系。

1 材 料

1.1 細(xì)胞株 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試劑 小檗胺（純度＞98%，貨號(hào)：B860680，麥克林生化科技有限公司）；阿霉素鹽酸鹽（純度＞98%，貨號(hào)：D1515，Sigma公司）；胎牛血清（FBS，批號(hào)：1624016，Gibco公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基（批號(hào)：2141287，Corning公司）；基質(zhì)膠（貨號(hào)：356234，BD生物公司）；抗體p53（批號(hào)：GR136120-36）、MDM2（批號(hào)：GR3210619-1）（Abcam公司）；OTUB1（批號(hào)：A1618）、Caspase-3（貨號(hào)：sc-7272）、β-actin（貨號(hào)：sc-8432）（Santa Cruz Biotechnology）；二抗（貨號(hào)：A00098，金斯瑞）；臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞存活率檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：C0011）、裂解液（貨號(hào)：P0013K）、蛋白酶抑制劑（PMSF，貨號(hào)：ST506）、電泳液（貨號(hào)：P1004D）、轉(zhuǎn)膜液（貨號(hào)：P0021B）、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（貨號(hào)：P1009SF）（碧云天公司）。

1.3 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱（貨號(hào)：SHELLAB 3517/21，美國(guó)Thermo公司）；超凈工作臺(tái)（貨號(hào)：Airtech SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣公司）；徠卡正置熒光顯微鏡（序列號(hào)：SN409，德國(guó)徠卡公司）；Thermo全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（序列號(hào)：3001-2228，美國(guó)Thermo公司）；Bio-RadECL發(fā)光儀（序列號(hào)：7218R11306，美國(guó)Bio-Rad公司）；Bio-Rad MP4電泳儀、Bio-Rad MP4轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；細(xì)胞培養(yǎng)板（96孔：貨號(hào)：3559；24孔板：貨號(hào)：3524；6孔板：貨號(hào)：3516）（Costar公司）；凍存管（貨號(hào)：430659）、15 mL離心管（貨號(hào)：430791）（Corning公司）。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)A549細(xì)胞置于RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%FBS，100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）中，于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d傳代換液1次，選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)期的A549細(xì)胞，接種于96孔板中（1×104個(gè)/孔）過(guò)夜，第2天，將培養(yǎng)液輕輕吸去，加入含不同濃度小檗胺（1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L）的培養(yǎng)液180 μL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行孔，將細(xì)胞置于37℃培養(yǎng)箱中，檢測(cè)小檗胺作用于A549細(xì)胞24、48、72 h后，對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響。在加入小檗胺24、48、72h時(shí)，每孔加入20μL MTT溶液（5mg/mL），37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，去上清，加入150 μL DMSO，用酶標(biāo)儀在560 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值。

2.3 EdU實(shí)驗(yàn)EdU是胸腺嘧啶核苷類似物，可以取代胸腺嘧啶并插入到細(xì)胞周期中復(fù)制的DNA分子中。EdU被Alexa Fluor 647所標(biāo)記，因此能夠簡(jiǎn)單、快速、高靈敏地檢測(cè)細(xì)胞增殖。將A549細(xì)胞分為溶劑對(duì)照組，阿霉素組（2 μmol/L）和小檗胺10、20、40 μmol/L組，每組設(shè)置3個(gè)平行孔。將A549細(xì)胞（8×103個(gè)/孔）接種于96孔板中，每孔加入200 μL含不同濃度小檗胺的培養(yǎng)液，置于37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜。第2天，按照試劑盒使用說(shuō)明，每孔100 μL EdU（50 μmol/L），然后將細(xì)胞置于37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，將培養(yǎng)液棄去，細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min，再用2 mg/mL的甘氨酸脫色，然后按照試劑盒說(shuō)明，配置1×Apollo染色反應(yīng)液，避光、室溫?fù)u床孵育30 min。接下來(lái)DNA用Hoechst 33342染色30 min，最后用熒光顯微鏡拍照，記錄細(xì)胞染色情況。用EdU與Hoechst 33342共染的細(xì)胞率（EdU%=某個(gè)視野下EDU與Hoechst 33342共染細(xì)胞數(shù)/此視野下Hoechst 33342陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)）代表細(xì)胞的增殖能力，EdU%越高，說(shuō)明細(xì)胞的增殖能力越強(qiáng)。

2.4 劃痕試驗(yàn) 在細(xì)胞板背后畫平行的直線，將A549細(xì)胞（1×105個(gè)/孔）接種于6孔板中。當(dāng)細(xì)胞鋪滿孔板約80%時(shí)，垂直于細(xì)胞板背后的直線，用200 μL的槍頭在單層細(xì)胞上劃一條直線，用PBS輕輕地將漂浮的細(xì)胞洗去，加入含阿霉素（2μmol/L）和不同濃度小檗胺（10、20、40 μmol/L）的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行孔。在劃線后的0 h和24 h，用倒置顯微鏡拍照。用NIH Image J軟件計(jì)算細(xì)胞遷移的面積。劃痕愈合率=（0 h劃痕-24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積。為了排除細(xì)胞增殖對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，在加入小檗胺時(shí)每孔細(xì)胞加入絲裂霉素（1.0 μg/mL）。

2.5 Transwell試驗(yàn) 用Transwell試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)小檗胺對(duì)A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。將細(xì)胞（1×104個(gè)/孔）分別用100 μL含對(duì)照溶劑、阿霉素（2 μmol/L）或不同濃度小檗胺（10、20、40 μmol/L）的無(wú)血清培養(yǎng)基中混勻，每組設(shè)置3個(gè)平行孔，置于上室中，下室中加入600 μL的完全培養(yǎng)基（含10%FBS），置于37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中24 h，將24孔板取出，將小室用PBS清洗3次，再用4%多聚甲醛固定30 min，用結(jié)晶紫染色20 min，然后用流水輕輕地沖洗小室，用棉簽輕輕擦去上室細(xì)胞，將小室倒置，于顯微鏡下觀察拍照（×100）。評(píng)價(jià)小檗胺對(duì)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響用不加基質(zhì)膠的小室；評(píng)價(jià)小檗胺對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響用加基質(zhì)膠的小室，即在細(xì)胞混懸液加入到上室之前，將小室用50 μL Matrigel基質(zhì)膠稀釋液（1∶8）鋪滿，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，使基質(zhì)膠凝固。為了排除細(xì)胞增殖對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，在每組細(xì)胞混懸液中加入絲裂霉素（1.0 μg/mL）。

2.6 臺(tái)盼藍(lán)試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)期的A549細(xì)胞接種于6孔板中（1×105個(gè)/孔）過(guò)夜。第2天，將培養(yǎng)液吸去，分別加入含溶劑對(duì)照、阿霉素（2 μmol/L）或不同濃度小檗胺（10、20、40 μmol/L）的培養(yǎng)液，每組設(shè)置3個(gè)平行孔。48 h后，按照臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞存活率檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書收集細(xì)胞，用離心機(jī)1 000 g離心1 min，棄去上清，加入100 μL細(xì)胞重懸液，再加入100 μL臺(tái)盼藍(lán)染色液（2×），輕輕混勻，染色3 min。吸取少量經(jīng)過(guò)染色的細(xì)胞，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

2.7 ELISA試驗(yàn)Cell Death ELISA Kit的實(shí)驗(yàn)原理是基于針對(duì)組蛋白和DNA的抗體的定量免疫分析。因此，檢測(cè)細(xì)胞裂解液中單核小體和低核小體可以間接代表細(xì)胞的凋亡。將A549細(xì)胞接種于6孔板中，加入含溶劑對(duì)照、阿霉素（2 μmol/L）或不同濃度小檗胺（10、20、40 μmol/L）的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，然后用冷的PBS洗滌細(xì)胞。加入RIPA裂解緩沖液（含1 mmol/L PMSF），收集裂解后的細(xì)胞液，離心，取上清。按照試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，最后用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值來(lái)反映單核和低核小體片段DNA含量。

2.8 Western blotting試驗(yàn) 將細(xì)胞用溶劑對(duì)照或含不同濃度的小檗胺（10、20、40 μmol/L）的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)液棄去，用PBS清洗兩次，再用裂解液（含1 mmol/L PMSF）在4℃裂解30 min，收集裂解后的細(xì)胞液，離心，取上清。用BCA試劑盒檢測(cè)收集到的蛋白濃度。將提取的蛋白（20 μg）在10%的SDS-PAGE膠上進(jìn)行分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將PVDF膜用含5%脫脂牛奶的TBST溶液浸泡，振搖，室溫封閉2 h。然后孵一抗OTUB1（1∶1 000稀釋）、MDM2（1∶500稀釋），p53（1∶1 000稀釋）、Caspase-3（1∶1 000稀釋）和β-actin（1∶2 000稀釋）4℃過(guò)夜，用TBST洗滌3次，室溫條件下孵二抗（1∶10 000稀釋）2 h，再用TBST洗滌3次，用ECL發(fā)光試劑盒檢測(cè)顯影，Bio-RadECL發(fā)光儀采集圖像，用NIH Image J軟件計(jì)算灰度值。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有的統(tǒng)計(jì)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 小檗胺對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響MTT試驗(yàn)的結(jié)果表明，小檗胺以濃度依賴和時(shí)間依賴的方式下調(diào)A549細(xì)胞的增殖率。用小檗胺處理A549細(xì)胞24、48和72 h后，使A549細(xì)胞的增殖率明顯下調(diào)的最低濃度分別為10、5和2.5 μmol/L，同一小檗胺濃度處理A549細(xì)胞的時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)A549細(xì)胞增殖抑的制越明顯。小檗胺處理A549細(xì)胞72 h時(shí)，抑制細(xì)胞增殖的IC50為（22.7±2.3）μmol/L。因此，我們用10、20、40 μmol/L的小檗胺進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（見(jiàn)圖1）

圖1 小檗胺對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響（±s，n=3）

3.2 小檗胺抑制A549細(xì)胞的增殖EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，2 μmol/L的阿霉素和10、20、40 μmol/L的小檗胺均能使EdU%明顯下降。EdU與Hoechst 33342共染的細(xì)胞率代表增殖能力，結(jié)果均表明小檗胺能夠抑制A549細(xì)胞增殖。（見(jiàn)圖2）3.3小檗胺抑制A549細(xì)胞的遷移 與溶劑對(duì)照組比較，阿霉素能夠明顯降低A549細(xì)胞的劃痕愈合率，10、20、40 μmol/L小檗胺組的劃痕愈合率明顯低于溶劑對(duì)照組，表明小檗胺能夠抑制A549細(xì)胞的遷移。（見(jiàn)圖3）

圖2 EdU實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小檗胺對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響

圖3 劃痕試驗(yàn)評(píng)價(jià)小檗胺對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響

3.4 小檗胺抑制A549細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移 在轉(zhuǎn)移試驗(yàn)中，與溶劑對(duì)照組比較，阿霉素使A549細(xì)胞的細(xì)胞轉(zhuǎn)移率明顯下降，10、20和40 μmol/L的小檗胺明顯抑制A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。侵襲試驗(yàn)的結(jié)果表明：與溶劑對(duì)照組比較，阿霉素使A549細(xì)胞的細(xì)胞侵襲率明顯下降，10、20和40μmol/L的小檗胺能夠明顯抑制A549細(xì)胞的侵襲能力。（見(jiàn)圖4）

圖4 Transwell試驗(yàn)評(píng)價(jià)小檗胺對(duì)A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響

3.5 小檗胺誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡 與溶劑對(duì)照組比較，阿霉素能夠明顯增加臺(tái)盼藍(lán)染色陽(yáng)性細(xì)胞的比例，10、20和40 μmol/L的小檗胺也能顯著增加臺(tái)盼藍(lán)染色陽(yáng)性細(xì)胞的比例，而且臺(tái)盼藍(lán)染色陽(yáng)性的比例隨小檗胺濃度的升高而增大，說(shuō)明小檗胺能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。（見(jiàn)圖5）

圖5 臺(tái)盼藍(lán)試驗(yàn)檢測(cè)小檗胺對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

3.6 小檗胺誘導(dǎo)A549細(xì)胞死亡 與溶劑對(duì)照組比較，阿霉素能夠明顯增加細(xì)胞提取液的OD值，10、20和40 μmol/L的小檗胺也能明顯增加細(xì)胞提取液的OD值，表明小檗胺能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞死亡。（見(jiàn)圖6）

圖6 ELISA試驗(yàn)檢測(cè)小檗胺對(duì)A549細(xì)胞死亡的影響（±s，n=3）

3.7 小檗胺對(duì)A549細(xì)胞中MDM2-p53信號(hào)通路及OTUB1蛋白表達(dá)的影響 與溶劑對(duì)照組比較，10、20、40μmol/L的小檗胺能夠明顯下調(diào)MDM2的表達(dá)，20、40μmol/L的小檗胺能夠明顯下調(diào)OTUB1的表達(dá)。與溶劑對(duì)照組比較，10、20、40μmol/L的小檗胺能夠上調(diào)p53的表達(dá)。40 μmol/L的小檗胺能夠明顯增加cleaved-Caspase-3/Caspase-3的表達(dá)。（見(jiàn)圖7）

圖7 Western blotting檢測(cè)小檗胺對(duì)A549細(xì)胞OTUB1和MDM2-p53信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

4 討 論

肺癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）約占所有肺癌類型的85%[14]，通常患者被診斷出來(lái)時(shí)已是晚期，且常伴有轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。因此，闡明非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制可能會(huì)為非小細(xì)胞肺癌提供新的治療方法。

MDM2在許多癌癥中表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致p53依賴的細(xì)胞活性喪失，如細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯。研究顯示，MDM2表達(dá)降低，會(huì)導(dǎo)致胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞的凋亡率上升[15]。MDM2-p53信號(hào)通路與胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，抑制MDM2的活性，可使胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯下降[16-17]。本研究結(jié)果顯示小檗胺能夠顯著抑制A549細(xì)胞的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡，并且小檗胺能夠劑量依賴性的抑制MDM2的表達(dá)，這與以上研究的結(jié)果相符，說(shuō)明小檗胺可能是通過(guò)MDM2-p53的信號(hào)通路來(lái)抑制A549細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡。CHEN S R等[13]研究顯示MDM2能夠負(fù)調(diào)控p53的表達(dá)，而p53是抑癌基因，在維持細(xì)胞完整性和防止細(xì)胞癌變中起到重要作用。本研究結(jié)果表明小檗胺能夠劑量依賴性地上調(diào)p53的表達(dá)，說(shuō)明小檗胺能抑制A549細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，小檗胺誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的作用可能是通過(guò)抑制MDM2的表達(dá)，進(jìn)一步上調(diào)p53的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。轉(zhuǎn)錄因子OTUB1是去泛素化酶家族中一員，在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAM）中高表達(dá)。研究顯示OTUB1在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)[18]，當(dāng)骨髓瘤細(xì)胞的凋亡增加時(shí)，OTUB1的表達(dá)下調(diào)[19]。而且，OTUB1能夠調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。此外，OTUB1能夠穩(wěn)定MDM2的表達(dá)，進(jìn)一步抑制p53的活性發(fā)揮抗凋亡作用[20]。本研究結(jié)果顯示小檗胺處理A549細(xì)胞后，細(xì)胞的凋亡數(shù)明顯增加，細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯下降，Western blotting試驗(yàn)結(jié)果顯示OTUB1和MDM2的表達(dá)明顯下調(diào)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似，說(shuō)明小檗胺抑制A549細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的作用可能是通過(guò)調(diào)控OTUB1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。綜上，小檗胺可能是通過(guò)抑制OTUB1的表達(dá)，進(jìn)一步抑制MDM2-p53信號(hào)通路來(lái)抑制A549細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。