益氣滋陰湯治療慢傳輸型便秘大鼠的實(shí) 驗(yàn) 研 究*

詹 敏，尹園緣，李 逵，賓東華，王珊蘋

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

慢傳輸型便秘（slow transit constipation，STC）是一種頑固性的慢性疾病，表現(xiàn)為排便次數(shù)減少、排便困難和便意減少或消失[1]。近年來慢傳輸型便秘呈高發(fā)趨勢，我國的發(fā)病率為7.0%～20.3%[2]，其中老年人占了絕大多數(shù)。便秘通常分為原發(fā)性便秘和繼發(fā)性便秘，慢傳輸型便秘屬于原發(fā)性便秘[3]。雖然便秘癥狀尚不威脅生命，但它帶來的疾病負(fù)擔(dān)卻不容忽視。長期便秘會加重原有的消化道癥狀，使消化功能進(jìn)一步紊亂，用力排便甚至?xí)T發(fā)心腦血管疾病。便秘患者的反復(fù)就醫(yī)和情緒低落，也會出現(xiàn)一些心理情緒障礙，對患者的生活質(zhì)量、工作效率及醫(yī)療資源消耗都有一定的影響，給家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)[4]。中醫(yī)藥從整體觀出發(fā)，在治療慢傳輸型便秘方面有著非常理想的效果，但是具體治療機(jī)制尚不明確，因此探討STC的治療機(jī)制對指導(dǎo)臨床治療具有重要的意義。本研究采用中西醫(yī)不同的方法治療慢傳輸型便秘模型大鼠，探究兩者的療效和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物20周齡健康的SD大鼠（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供），60只，體質(zhì)量（180±15）g，動物許可證號：SCXK(湘)2013-0004，動物合格證號：43004700020983。本實(shí)驗(yàn)已通過本院實(shí)驗(yàn)動物倫理審查（ZYFY20160301-4）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 益氣滋陰湯藥物組成：太子參30 g，白術(shù)30 g，肉蓯蓉30 g，枳殼10 g，火麻仁20 g，制何首烏20 g，黃芪15 g，杏仁15 g，玄參15 g，檳榔10 g，甘草6 g（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室制備）；枸櫞酸莫沙必利片（江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號：20160105）。

1.1.3 主要試劑與儀器 電泳儀（北京六一儀器廠，型號：DYY-6C），紫外可見分光光度計(jì)（上海spectrum公司，型號：SP-752），超微量分光光度計(jì)（美國Nanodrop，型號：One C），臺式高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo，型號：micro21R），實(shí)時定量PCR儀（美國Bio-Rad，型號：CTX96），RIPA蛋白裂解液（江蘇碧云天，貨號：P007B），Bradford蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天，貨號：P0006），超敏化學(xué)放光顯色試劑盒（江蘇碧云天，貨號：PA003 WB），Gold View核酸染料（北京索萊寶，貨號28596580）。

1.2 方法

1.2.1 造模 參考文獻(xiàn)[5]方法，用生大黃粉開水沖泡制成的混懸液灌胃，1次/d，首次給藥劑量為150 mg/（kg·d），此后按150 mg/（kg·d）的劑量每日遞增，至大鼠夜間12 h糞便含水比達(dá)70%以上時，維持劑量用藥至大鼠夜間12 h糞便含水比降至50%以下，此為一個循環(huán)，再按150 mg/（kg·d）的劑量遞增，如此進(jìn)行3個循環(huán)，共計(jì)60 d，首次致瀉劑量為1 950 mg/（kg·d），最終劑量為2 700 mg/（kg·d）。大鼠夜間12 h糞便含水比保持在50%以下為造模成功。

1.2.2 動物分組與給藥方法60只SD大鼠隨機(jī)取15只為空白組，其余45只造模成功后隨機(jī)分為益氣滋陰湯組、莫沙必利對照組、模型組，每組15只。

按照大鼠與人體表面積及體質(zhì)量進(jìn)行換算，益氣滋陰湯組使用益氣滋陰湯中藥煎劑灌胃，2.5 mg（生藥）/kg，1次/d，2周為1個療程。莫沙必利對照組予莫沙必利片藥液灌胃，1.5 mg/kg，1次/d，2周為1個療程。模型組與對照組灌胃等量生理鹽水，1次/d，2周為1個療程。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 糞便數(shù)量及糞含水比 造模前后檢測大鼠糞便數(shù)量及糞便含水比，糞便數(shù)量（粒）：將各組分為造模前、造模后及治療后3個時期，每個時期均為14 d，收集每日糞便，計(jì)算總和。糞便含水比（%）為濕、干糞質(zhì)量之差與濕糞質(zhì)量的比值，濕糞質(zhì)量為收集不同時期大鼠的濕糞進(jìn)行稱量，干糞質(zhì)量為收集的濕糞置于恒溫箱烘烤（90℃烘烤3 h）后稱量。

1.3.2 大鼠結(jié)腸組織c-kit mRNA表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠禁食24 h，用烏拉坦淺麻醉后，打開腹腔，取距肛側(cè)5 cm結(jié)腸全層，截取1 cm長，截取后3 s內(nèi)放入液氮中以備實(shí)時定量熒光PCR檢測使用。取各組大鼠結(jié)腸組織樣本于勻漿器中，加入Trizol試劑提取總RNA，1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA純度，并測定其濃度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94℃，4min；94℃，40 s；60℃，30 s；循環(huán)40次。從NCBI中下載基因序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列。相關(guān)引物序列：c-kit，F(xiàn) 5'-ATCATGGAG GATGACGATT-3'，R 5'-GCCATCCACTTCCAGGTAG-3'。采用2-ΔΔCt法計(jì)算結(jié)腸組織中c-kit mRNA表達(dá)水平。

1.3.3 大鼠結(jié)腸組織VIP、AQP3蛋白表達(dá) 取大鼠結(jié)腸組織，提取組織總蛋白質(zhì)，應(yīng)用BCA法測定蛋白含量，取50 μg總蛋白上樣。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后，封閉處理1 h，加入一抗VIP、AQP3兔抗鼠多克隆抗體，孵育過夜，洗膜后加二抗，室溫孵育1 h，暗室加ECL化學(xué)發(fā)光劑壓片，顯影、定影后掃描X-膠片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理使用SPSS 24.0軟件，計(jì)量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠糞便數(shù)量及糞便含水比比較 模型組、益氣滋陰湯組和莫沙必利對照組大鼠造模后糞便數(shù)量和糞便含水比均較造模前明顯降低（P＜0.05）；益氣滋陰湯組和莫沙必利對照組大鼠治療后糞便數(shù)量和糞便含水比明顯高于造模后（P＜0.05），與空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型組大鼠造模后、治療后糞便數(shù)量和糞便含水比均明顯低于空白組（P＜0.05）。益氣滋陰湯組和莫沙必利對照組大鼠治療后糞便數(shù)量和糞便含水比均高于模型組（P＜0.05）。（見表1～2）

表1 各組大鼠不同時期的糞便數(shù)量比較（±s，粒）

表1 各組大鼠不同時期的糞便數(shù)量比較（±s，粒）

注：益氣滋陰湯組為生藥劑量；與空白組比較，aP＜0.05；與造模前比較，bP＜0.05；與模型組比較，cP＜0.05；與造模后比較，dP＜0.05

組別 動物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg) 造模前 造模后 治療后空白組 15 - 275.19±0.51 274.21±9.81 275.09±6.21模型組 15 - 272.42±5.37 175.13±3.17ab175.23±1.27a益氣滋陰湯組 15 2.5 272.76±4.56 177.64±6.16b 270.77±5.32cd莫沙必利對照組15 1.5 271.82±5.68 174.93±4.77b 272.24±1.56d F 1.606 865.118 2 017.323 P 0.198 0.000 0.000

表2 各組大鼠不同時期的糞便含水比比較（±s，%）

表2 各組大鼠不同時期的糞便含水比比較（±s，%）

注：益氣滋陰湯組為生藥劑量；與空白組比較，aP＜0.05；與造模前比較，bP＜0.05；與模型組比較，cP＜0.05

組別 動物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg) 造模前 造模后 治療后空白組 15 - 74.3±6.1 66.1±4.2 65.1±5.5模型組 15 - 62.1±10.7 53.2±3.4ab 53.4±3.6a益氣滋陰湯組 15 2.5 75.8±0.7 55.4±2.5b 68.1±3.5bc莫沙必利對照組 15 1.5 69.8±4.4 55.7±2.4b 66.4±4.8bc F 10.323 48.561 34.112 P 0.000 0.000 0.000

2.2 各組大鼠結(jié)腸組織c-kit mRNA表達(dá)水平比較 模型組大鼠結(jié)腸組織c-kit mRNA表達(dá)低于空白組（P＜0.01）；益氣滋陰湯組和莫沙必利對照組大鼠結(jié)腸組織c-kit mRNA表達(dá)高于模型組（P＜0.05）。（見表3、圖1）

表3 各組大鼠結(jié)腸組織c-kit mRNA表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組大鼠結(jié)腸組織c-kit mRNA表達(dá)水平比較（±s）

注：益氣滋陰湯組為生藥劑量；與空白組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05

組別 動物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg)c-kit mRNA(RQ值)空白組 15 - 1.32±0.50模型組 15 - 0.05±0.01a益氣滋陰湯組 15 2.5 0.25±0.14b莫沙必利對照組15 1.5 0.23±0.10b F 71.840 P 0.000

圖1 c-kit mRNA表達(dá)擴(kuò)增曲線與溶解曲線

2.3 各組大鼠結(jié)腸組織VIP、AQP3蛋白表達(dá)比較 模型組大鼠結(jié)腸組織中VIP、AQP3蛋白含量均高于空白組（P＜0.05）；益氣滋陰湯組和莫沙必利對照組大鼠結(jié)腸組織中VIP、AQP3蛋白含量均低于模型組（P＜0.01）。（見圖2、表4）

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織VIP、AQP3蛋白表達(dá)情況

表4 各組大鼠結(jié)腸組織VIP、AQP3蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 各組大鼠結(jié)腸組織VIP、AQP3蛋白表達(dá)比較（±s）

注：益氣滋陰湯組為生藥劑量；與空白組比較，aP＜0.01，bP＜0.05；與模型組比較，cP＜0.01

組別 動物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg)VIP/βactin AQP3/βactin空白組 15 - 0.24±0.07 0.19±0.18模型組 15 - 0.58±0.09a 0.53±0.08a益氣滋陰湯組 15 2.5 0.38±0.17b c 0.27±0.07b c莫沙必利對照組 15 1.5 0.39±0.08b c 0.28±0.08b c F 24.213 25.978 P 0.000 0.000

3 討 論

慢傳輸型便秘目前已成為嚴(yán)重影響人類身心健康的重要疾病之一，其病理機(jī)制與Cajal間質(zhì)細(xì)胞（ICC）功能、水通道蛋白表達(dá)、腸神經(jīng)系統(tǒng)、腸神經(jīng)遞質(zhì)、胃腸激素分泌等密切相關(guān)[6]，但具體發(fā)病機(jī)制尚未明確。臨床上治療方法眾多，目前主要使用大黃蒽醌類瀉劑治療，如大黃、番瀉葉、蘆薈等。西醫(yī)治療慢傳輸型便秘多使用增加動力型藥物（如莫沙必利）[7]、高滲性導(dǎo)瀉藥（如福松）、刺激性泄劑（如酚酞、脫氧膽酸）及微生態(tài)制劑等[8]。上述治療近期有效，遠(yuǎn)期療效不明顯，容易形成大腸黑變病。長期使用會使腸道的敏感性降低，造成腸壁內(nèi)神經(jīng)元不可逆的損害[9]。

目前普遍認(rèn)為，水通道蛋白3（AQP3）的異常表達(dá)能引起結(jié)腸對水分的過度吸收，從而導(dǎo)致腸道水液代謝紊亂，導(dǎo)致便秘的發(fā)生[10]。胃腸慢波始動細(xì)胞Cajal間質(zhì)細(xì)胞的作用也受到重視，其細(xì)胞表達(dá)受酪氨酸激酶受體c-kit及其配體干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）調(diào)控，現(xiàn)有研究已證實(shí)SCF／c-kit信號途徑在ICC前體分化、發(fā)育及存活中具有重要作用[11-12]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為便秘病位在大腸，基本病機(jī)為大腸傳導(dǎo)失司，與脾、肺、肝等臟腑的功能失調(diào)也有關(guān)，與自身氣血、經(jīng)絡(luò)、五臟六腑也有一定關(guān)系[13-15]。既往一些醫(yī)家常用大黃、芒硝、番瀉葉等苦寒之品，易傷及脾胃，使“后天之本”失固，導(dǎo)致癥狀反復(fù)發(fā)作[16]。張西平[17]認(rèn)為慢傳輸型便秘可以從“氣虛”“陰虛”兩方面論治。耿彬[18]、李超男等[19]研究表明治療慢傳輸型便秘常用的健脾益氣藥有生白術(shù)、黃芪，常用的補(bǔ)陰藥有沙參、麥冬。本次研究選擇的益氣滋陰湯化裁自《幼科直言》卷五中益氣滋陰湯，前期的臨床研究已經(jīng)證實(shí)益氣滋陰湯治療老年慢傳輸型便秘具有顯著的療效[20]。益氣滋陰湯中黃芪、太子參、白術(shù)，性甘溫，可補(bǔ)肺脾之氣，杏仁、火麻仁可潤腸通便,玄參、制何首烏具有滋陰養(yǎng)血功效，檳榔、枳殼能夠行氣導(dǎo)滯，肉蓯蓉則可補(bǔ)腎助陽，兼具潤腸通便功效，甘草可調(diào)和諸藥。諸藥配伍共奏益氣滋陰之功效，使得患者脾肺之氣得生，補(bǔ)益精血，滋潤大腸津虧，進(jìn)而推動腸內(nèi)糟粕下行，便結(jié)易解，緩解患者便秘。現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示：黃芪有增強(qiáng)細(xì)胞免疫、體液免疫的功能，白術(shù)可提高機(jī)體免疫力[21]，肉蓯蓉具有抗衰老、緩解疲勞、潤腸通便的功效[22]。

本次研究結(jié)果顯示，模型組、益氣滋陰湯組、莫沙必利對照組大鼠糞便數(shù)量、糞便含水比、結(jié)腸組織c-kit mRNA表達(dá)水平均低于空白組，結(jié)腸組織VIP、AQP3蛋白表達(dá)水平均高于空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；益氣滋陰湯組、莫沙必利對照組大鼠糞便數(shù)量、糞便含水比、結(jié)腸組織c-kit mRNA表達(dá)水平均高于模型組，結(jié)腸組織VIP、AQP3蛋白表達(dá)水平均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。益氣滋陰湯組大鼠糞便數(shù)量，糞便含水比，結(jié)腸組織VIP、AQP3蛋白水平及結(jié)腸組織c-kit mRNA表達(dá)與莫沙必利對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。此次實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)益氣滋陰湯能增加慢傳輸型便秘模型大鼠糞便量及糞便含水比，顯著降低其結(jié)腸組織中VIP、AQP3蛋白的表達(dá)，提高大鼠結(jié)腸組織c-kit mRNA表達(dá)水平，其療效與莫沙必利基本相當(dāng)。

綜上所述，益氣滋陰湯可明顯改善慢傳輸型便秘大鼠的腸道功能和糞便癥狀，作用機(jī)制可能與減少神經(jīng)遞質(zhì)VIP蛋白和水通道蛋白AQP3的表達(dá)，以及增加SCF/c-kit信號通路的表達(dá)有關(guān)。此次實(shí)驗(yàn)為益氣滋陰湯的臨床使用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有助于益氣滋陰湯的臨床推廣，也為進(jìn)一步探究此方的其他作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。