溫郁金法呢基焦磷酸合酶（CwFPPS）基因的克隆、亞細胞定位及表達分析

丁賢華，張麗萍，費 璇,朱 強，張金華，任仙櫻，吳志剛*，姜程曦*

? 藥材與資源?

溫郁金法呢基焦磷酸合酶（CwFPPS）基因的克隆、亞細胞定位及表達分析

丁賢華1, 2，張麗萍1#，費 璇1,朱 強3，張金華4，任仙櫻5，吳志剛1*，姜程曦1*

1.溫州醫科大學藥學院，浙江 溫州 325035 2.安徽江南生物技術研究中心，安徽 池州 247100 3.安徽濟人藥業有限公司，安徽 亳州 236800 4.大理藥業股份有限公司，云南 大理 671000 5.溫州莪金醫藥有限公司，浙江 樂清 325600

克隆溫郁金萜類生物合成中的限速酶法呢基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophosphate synthase，FPPS）的全長cDNA序列。根據溫郁金轉錄組數據設計特異引物，PCR擴增FPPS全長cDNA序列并對其進行生物信息分析；構建“基因-GFP”融合表達載體，利用農桿菌介導煙草葉片進行亞細胞定位分析；實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測基因在植物組織中的特異性表達。溫郁金基因全長1196 bp，包含1個長為1071 bp的開放閱讀框，編碼356個氨基酸，GenBank登入號為MT489462；編碼蛋白屬于類異戊二烯生物合成酶超級家族（C1）成員，包含5個保守的功能域，其中2個是富含天冬氨酸（DDXXD）的活性中心；亞細胞定位顯示該蛋白位于泡質、細胞膜或細胞核上。qRT-PCR分析表明，基因在根莖中特異表達，相對表達水平是葉片中的13.7倍。克隆獲得的溫郁金基因全長及其特異表達信息，可為后續進行基因功能鑒定及倍半萜成分的代謝工程研究提供依據。

溫郁金；法呢基焦磷酸合酶；克隆；亞細胞定位；表達分析

溫郁金Y.H.Chen et C.Ling 為姜科姜黃屬多年生草本植物，是我國傳統道地藥材，其根莖、塊根采用不同炮制方法可制成臨床上常用的“溫莪術”“片姜黃”和“溫郁金”3味中藥，具行氣化瘀、清心解郁、利膽退黃等功效[1]。研究表明，溫郁金主要成分為倍半萜，其中蓬莪術二烯、莪術醇、郁金二醇、莪術烯、δ-欖香烯、β-欖香烯等活性成分具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、鎮痛等藥理作用，開發應用前景廣闊，如β-欖香烯已被開發成年產值達40億元的抗腫瘤產品[2-3]。然而，植物體內重要活性成分含量十分有限，且溫郁金受連作障礙、種質退化、成分穩定性低、生產成本高等因素限制，依靠傳統“種植-提取”藥源的方法面臨挑戰，愈發難以滿足生產需求。

隨著合成生物學的發展，以大腸桿菌、酵母工程菌或模式植物為底盤的代謝工程技術已成為近年來發掘開發新藥源的熱點領域。此過程中，克隆及表達合成途徑的限速酶是最為關鍵的。C15型的法呢基二磷酸（farnesyl diphosphate，FPP）是合成倍半萜的前體物質，是由2分子異戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）和1分子二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP）在法呢基二磷酸合成酶（farnesyl pyrophosphate synthase，FPPS）催化下縮合而成[4]。當前，小麥、白木香、黃花蒿等多個植物基因被克隆[5-8]，甚至被應用代謝產物調控工程設計中，而溫郁金基因尚未見相關報道。

項目組前期在構建溫郁金花、葉、根莖及塊根全長轉錄組中發現，1條長為1343 bp的轉錄本（i1_HQ_W_c88364/f29p10/1344）在溫郁金根莖中特異表達。鑒于此，本研究依據此轉錄本序列設計特異引物，實時熒光定量PCR（qRT-PCR）從溫郁金根莖中克隆基因cDNA全長序列并進行生物信息學分析，利用煙草葉片瞬時轉化體系驗證亞細胞定位，qRT-PCR檢測基因各組織表達模式，為今后溫郁金重要活性成分的生物合成調控途徑及代謝工程研究提供依據。

1 材料與試劑

1.1 藥材樣品

樣品采自溫州瑞安陶山鎮種植基地（E120°51′，N27°83′），由溫州醫科大學吳志剛副研究員鑒定為溫郁金Y.H.Chen & C.Ling。根據溫郁金發育規律[9]，花、葉、根莖等組織分別于花期、葉叢期、根莖始發期和塊根形成期進行收集，每個部位收集3份。材料經洗凈、切碎，液氮下研成粉末并于?80 ℃保存備用。本氏煙草Domin種子（本實驗室保存）播種于直徑7 cm的營養缽中（腐殖質∶蛭石1∶1），25 ℃下每日12 h的光照培養30 d，用于亞細胞定位分析。

1.2 菌株與載體

TOP10菌株為本實驗室保存，根癌農桿菌GV3101購自上海唯地生物技術有限公司，pCAMBIA 1302表達載體購自南京鐘鼎生物技術有限公司。

1.3 工具酶與主要試劑

pfu DNA聚合酶、Taq酶，T4 DNA連接酶及限制性內切酶、SYBRR Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒及RNA純化試劑盒均購自TaKaRa Bio公司（大連），CV1401-Zero Background pTOPO-TA cloning kit購自北京艾德萊生物有限公司，cDNA反轉錄試劑盒購自美國Applied Biosystems?公司，DNA回收純化試劑盒、質粒小提試劑盒購自美國AXYGEN公司。PCR Buffer緩沖液、ddH2O、瓊脂糖等均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。引物合成及測序由南京鐘鼎生物技術有限公司完成。

2 方法

2.1 RNA提取與純化

參照CTAB法[10]提取樣品總RNA并按RNA純化試劑盒說明純化，1%的瓊脂糖電泳檢測RNA完整性、濃度和純度。依據反轉錄試劑盒的說明反轉錄成cDNA。

2.2 CwFPPS基因克隆與測序

利用Primer Premier 5.0軟件設計基因全長擴增引物（FPPS-F: 5’-GTGCCATTCTTCGAGTGT-3’，FPPS-R: 5’-TATTAGAAAATTGATCGTAAG-3’）。以溫郁金根莖cDNA為模板，配制反應體系：5 μL 10×PCR Buffer（含Mg2+），5 μL dNTP，1 μL酶，1 μL模板，各1 μL的上下游引物（10 μmol/L），36 μL ddH2O。于96孔梯度PCR儀上進行擴增，反應程序：94 ℃預變性5 min，1個循環；然后94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、1.5 min，進行35個循環；循環結束后72 ℃延伸反應7 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，PCR產物切膠純化回收，連接TOPO-TA克隆載體，轉化大腸桿菌TOP10菌株，挑取陽性菌株提取質粒并進行測序。

2.3 CwFPPS基因的生物信息分析

ORF finder在線軟件編譯基因開放閱讀框（open reading frame，ORF）及翻譯蛋白，NCBI在線CDD Tools（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi）搜索蛋白保守結構域，在線BlastP程序（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi）搜索并下載相似性氨基酸序列（identity＞75%）ClustalX2.0進行氨基酸多序列比對，并利用MEGA7.0軟件中的極大似然法進行系統進化樹分析，Bootstrap值設為1000。ExPASy在線服務器ProtParam工具分析蛋白等電點、氨基酸分布、親水性等情況；SignalP-5.0 Server和TMHMM Server v.2.0在線預測蛋白信號肽及跨膜結構；WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）預測亞細胞定位情況。SOPMA分析蛋白二級結構，采用SWISS-MODEL在線工具進行三維同源建模。

2.4 CwFPPS蛋白亞細胞定位

根據基因開放閱讀框（ORF）序列，在Ⅰ和Ⅰ酶切位點間設計全長拼接引物（F：5’- AGAACACGGGGGACTCTTGACATG-GCGGAGGCGACGGCGAACG-3’；R：5’-GTGAA- AAGTTCTTCTCCTTTCTTCTGCCTTTT-GTAGATCTT-3’；劃線部分為酶切位點），通過同源重組方法連接至pCAMBIA 1302載體的I和I位點間，獲得pCAMBIA 1302-CwFPPS重組質粒并轉至TOP10克隆菌株，陽性克隆子測序驗證。連接反應體系：引物各0.5 μL，模板0.3 μL，5×Buffer溶液10 μL，pfu DNA聚合酶0.5 μL，dNTP（10 μmol/L）1 μL，ddH2O加至50 μL。上述測序正確的質粒進行酶切鑒定，反應體系為：質粒3 μL，內切酶Ⅰ、Ⅰ各0.25 μL，10×Buffer 1.0 μL，ddH2O 5.5 μL。

將上述鑒定正確的重組質粒電轉化法轉入根癌農桿菌GV3101中，固體培養2 d后，YEB液體擴大培養1 h，離心棄清液；沉淀菌體用10 μmol/L MgCl2（含120 μmol/L乙酰丁香酮）進行懸浮重懸，稀釋液600 nm吸光度（）為0.6左右。以空載為對照，取生長良好的煙草植株，從葉片下表皮進行注射，弱光培養2 d，激光共聚焦顯微鏡（Nikon C2-ER）下觀察綠色熒光蛋白和融合蛋白表達情況。

2.5 qRT-PCR分析

使用熒光定量PCR儀（ABI7500，USA）分析CwFPPS基因在溫郁金不同組織中的表達模式。依據序列設計qRT-PCR特異引物（F：5’-TGGA- TTGCTTCGGTCATC-3’；R：5’-ATCTTCAGTTGG- CTCTCATT-3’），產物200 bp，以18 S為內參基因（F：5’-GTAGTTGGGCTTTGGGTTG-3’；R：5’-AG- GTAGGCTTGCTTTGAG-3’）為內參基因。配制反應體系如下：SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems，美國）10 μL，正反引物各0.5 μL（10 μmol/L），cDNA模板2 μL，ddH2O 8 μL，并以2 μL的ddH2O代替模板作為陰性對照。反應程序：95 ℃、30 s，1個循環；95 ℃、10 s，60 ℃、15 s，72 ℃、30 s，進行40個循環。每樣品3次技術性和生物學重復，采用2?ΔΔCt法[11]統計基因相對表達水平。

3 結果與分析

3.1 CwFPPS基因克隆與序列全長

根據溫郁金轉錄組中1條在根莖中特異表達的FPPS轉錄本設計特異引物，以根莖cDNA為模板，RT-PCR擴增并經瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現在1200 bp處出現的特異條帶（圖1），與預期的片段大小基本一致。PCR產物連接T載體，克隆測序發現溫郁金FPPS基因全長為1196 bp。ORF Finder預測該基因序列含有1個完整的ORF，長為1071 bp，編碼356個氨基酸殘基，ORF與原轉錄本一致。BlastP比對顯示該基因序列與其它物種的法呢基焦磷酸合酶高度相似，命名為，序列提交至GeneBank（登入號MT489462）。

3.2 CwFPPS序列生物信息分析

3.2.1 序列分析 Conserved domain預測發現，基因編碼蛋白屬于類異戊二烯生物合成酶超級家族（C1）成員，是植物催化形成FPP的關鍵酶。結構域分析表明，編碼氨基酸序列具有2個天冬氨酸富集的保守結構域Motitf2和Motif5，富含DDXXD（圖2），是結合Mg2+、保證酶活性的重要功能域[11]。除Motif2、Motif5以外，CwFPPS蛋白還含有與底物結合的G60K61L62N63R64（Motfi1）、G174Q175X176X177D178（Motif3）保守區，以及促進酶活性K204T205（Motfi4）位點（圖2）。此外，ProParam Tool在線分析顯示，CwFPPS蛋白相對分子質量為40 630，推測分子式為C1850H2876N472O532S12，理論等電點（pI）5.93；氨基酸組成以亮氨酸比例最高，達到12.4%；不穩定系數為28.14，脂肪系數為96.69，親水性系數為?0.205，暗示該蛋白為穩定的親水性蛋白。TMHMM預測CwFPPS蛋白不含跨膜區，SignalP 5.0進一步預測表明此蛋白不具備信號肽位點。

圖1 CwFPPS基因的PCR產物凝膠電泳

3.2.2 序列相似性比對和進化分析 BlastP顯示CwFPPS蛋白與多個單子葉植物FPPS序列具有高度的相似性，其中與同科植物紅姜花Buch.-Ham.的FPPS氨基酸序列（AER12202.1）一致性（identity）達93.5%。選取19條一致性較高（＞75%）的氨基酸序列進行多重比對發現，這些序列均存在上述5個保守結構功能域，暗示該基因功能性的保守。利用MEGA7.0軟件中的最大似然方法構建系統進化樹，見圖3。結果表明，溫郁金與姜科的紅姜花、芭蕉科的小果野蕉Colla植物親緣關系最近，聚為一類，而與鐵皮石斛Kimura & Migo、霍山石斛C.Z.Tang & S.J.Cheng、春蘭(Rchb.f.) Rchb.F.、蝴蝶蘭(Rchb.f.) Kocyan & Schuit等蘭科植物距離較遠。

圖2 CwFPPS蛋白與其他植物FPPS保守區序列的多重比對

圖3 CwFPPS蛋白與同源氨基酸序列的進化樹分析及保守結構域

3.2.3 蛋白二級結構及同源建模 二級結構預測顯示CwFPPS蛋白是由62.9%的α螺旋（整條序列含有16個α螺旋區），7.3%的延伸鏈，4.5%的β折疊和25.3%的無規則卷曲構成。SWISS-MODEL建模顯示，CwFPPS蛋白與PDB數據庫中的法尼基二磷酸合成酶1嵌合體（模板號：4kk2.1.A）序列一致性達到70.96%，序列的相似度為0.52，覆蓋度為0.94；依據該模板建模顯示CwFPPS蛋白是由α螺旋形成的同源雙聚體寡核苷酸構成，空間結構含有與底物結合的“口袋”（圖4）。

圖4 CwFPPS蛋白三級結構預測

3.3 CwFPPS亞細胞定位

利用WoLFPSORT工具預測CwFPPS亞細胞定位，此蛋白最大可能是定位于細胞質中。為驗證該蛋白亞細胞定位，構建pCambia 1302-CwFPPS載體，并通過根癌農桿菌介導的煙草葉片的瞬時轉化體系，激光共聚焦顯微鏡下觀察發現CwFPPS::GFP融合蛋白在細胞質與細胞膜上具有明顯信號（圖5）。

GFP-綠色熒光信號 Chlorophyll-葉綠素熒光 Bright-field-明場 Merged-綠色和紅色熒光信號疊加

3.4 CwFPPS組織特異表達分析

為明確基因在溫郁金不同組織表達情況，qRT-PCR檢測顯示該基因在溫郁金藥用部位根莖、塊根中具有較高表達，反之在花、葉中表達較低（圖6），這可能與藥用部位積累更高的萜類成分有關。其中，根莖相對表達量是葉中的13.7倍。

4 討論

本研究從溫郁金根莖中成功克隆獲得類異戊二烯生物合成酶超級家族（C1）成員之一的基因，該基因編碼356個氨基酸，含有2個聚戊烯基合酶家族特有并高度保守的DDXXD的結構域（Motif2、Motif5）。此2個功能區被認為是FPPS酶與底物結合的重要位點，其富含天冬氨酸的殘基決定產物鏈長度和FPPS酶的活性，天冬氨酸突變或替代物能著降低FPPS酶活性[12-13]。多序列比對發現（圖2），CwFPPS蛋白與其他植物FPPS氨基酸序列一樣均具有上述2個功能域，暗示這些氨基酸殘基在發揮酶與底物結合、催化中功能性保守。類似其它植物，CwFPPS蛋白也包含Motif1（GKXXR）、Motif3（GQXXD）、Motif4（KT）等保守區，這種序列保守性也可用來研究植物間的進化關系[14]。CwFPPS氨基酸序列與蘭科、百合科、鳳梨科、姜科、芭蕉科等單子葉植物的FPPS序列具有70%以上的一致性，系統進化進一步表明溫郁金與同科植物紅姜花、芭蕉科的小果野蕉聚為一類（圖3），說明它們間親緣關系較近，預示CwFPPS對于研究溫郁金系統進化地位具有一定應用價值。

圖6 CwFPPS基因組織特異性表達

由于亞細胞區室化作用，植物體內倍半萜一般是在細胞質中通過甲羥戊酸（mevalonate pathway，MVA）途徑合成[15]。CwFPPS蛋白沒有跨膜螺旋區且不存在信號肽，推測此蛋白在細胞質起始合成并直接在細胞質中酶促反應。通過在CwFPPS蛋白C端融合GFP，融合蛋白在煙草表皮細胞的細胞質和細胞核上具有明顯GFP信號，與預測和其它植物FPPS亞細胞定位研究結果基本一致[16-17]。因而，初步認定CwFPPS定位于細胞質和細胞核上。

植物萜類合成常發生于特殊的組織或特殊發育階段，合成途徑中關鍵基因的表達具有組織特異性或顯示時空特異性[18]。研究發現，參與建澤瀉23-乙酰澤瀉醇B合成的基因在葉片中表達最高，且與成分變化成正相關，白木香在根中表達量最高，廣藿香基因成熟期葉片中表達最高[5, 19-20]。qRT-PCR檢測發現，基因在根莖中具有特異表達，其相對表達水平是葉片中的13.7倍，暗示其在根莖中發揮重要的生物學功能。而根莖是溫郁金最重要的藥用部位，是提取莪術油的唯一原料，相比其它組織部位倍半萜成分在該部位是最高的[21]。這種潛在正關聯性，暗示CwFPPS對促進溫郁金倍半萜合成可能起著關鍵作用，但“基因-成分”關聯性需要下一步進行基因功能學的驗證。

FPPS作為植物萜類合成途徑的關鍵酶之一，利用“基因-代謝”工程手段獲得萜類成分高產株系是近年來研究的重要手段。青蒿超表達的株系相比野生型植株倍半萜青蒿素增加了高2～3倍[20]。在煙草葉片腺毛上異源表達西紅柿和萜類合成酶，產生了多種倍半萜化合物[23]。研究也報道，人參基因過表達的毛狀根株系（F17）中人參皂苷含量是野生型的2.4倍[24]。本研究成功克隆獲得了溫郁金基因，該基因具有異戊二烯生物合成酶家族保守的活性功能域，并在根莖中具有特異表達。研究結果為后續利用代謝工程手段調控溫郁金萜類成分提供了重要靶標基因，有益于溫郁金重要價值萜類成分的開發利用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Cloning, subcellular localization and expression analysis of farnesyl pyrophosphate synthase in(CwFPPS)

DING Xian-hua1, 2, ZHANG Li-ping1, FEI Xuan1, ZHU Qiang3, ZHAN Jin-hua4, REN Xian-ying5, WU Zhi-gang1, JIANG Cheng-xi1

1.School of Pharmacy, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China 2.Anhui Jiangnan Biotechnology Research Center, Chizhou 247100, China 3.Anhui Jiren Pharmaceutical Co., Ltd., Bozhou 236800, China 4.Dali Pharmaceutical Co.,Ltd., Dali 671000, China 5.Wenzhou Ejin Pharmaceutical Co., Ltd., Leqing 325600, China

To clone the full-length cDNA sequence encoding farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS) that is one of the important rate-limiting enzymes involved in terpenoid biosynthesis.Based ontranscriptome database, specific primers were designed to amplify the full-length cDNA sequence of FPPS; the bioinformatics of the obtained sequence was further analyzed; GFP-fused constructs were prepared by cloning the full-length coding sequences ofand transformed intoGV3101 strain by electroporation systems; the subcellular localization ofprotein was observed by injecting the mixture of agrobacteria containing the::GFP fusion vector intoleaves.The real-time quantitative PCR (qRT-PCR) was used to detect the gene expression profiles in different tissues.Sanger sequencing showed that the full-lengthis 1196 bp (GenBank accession number: MT489462), which contains an open reading frame of 1071 bp, encoding 356 amino acids.Theencoding protein belongs to the member of the isoprenoid biosynthetic enzyme superfamily (C1) and contains 5 conserved functional domains, 2 of which are rich in aspartic acid (DDXXD) as active zones of FPPS enzyme.Subcellular localization indicated that the protein is located in the cytoplasm, as well as the cell membrane.Thewas specifically expressed in rhizome and its relative expression level was 13.7-fold compared to that in leaves.gene inwas successfully cloned and its expression pattern in tissues were obtained, which provides a basis for further gene functional identification and metabolic engineering of high-value sesquiterpenoids.

Y.H.Chen et C.Ling; FPPS; cloning; subcellular localization; expression analysis

R282.12

A

0253 - 2670(2021)22 - 6968 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.22.023

2021-05-06

溫州醫科大學人才項目（89220027）；浙江省重點實驗室項目（2021E10013）；大理藥業股份有限公司橫向課題（KJHX1603）；合肥未來藥物開發有限公司橫向課題（KJHX2008）；安徽濟人藥業橫向課題（KJHX2009）

丁賢華（1983—），女，安徽石臺人，碩士，研究實習員，研究方向為中藥生物技術。Tel: (0577)86699891

通信作者：姜程曦（1971—），男，安徽青陽人，教授，研究方向為中藥生物技術研究。Tel: 18969715696 E-mail: jiangchengxi@126.com

吳志剛（1979—），副研究員，主要從事藥用植物次生代謝產物研究。E-mail: wuzhigang177@126.Com

#并列第一作者：張麗萍（1996—），女，河北唐山人，碩士研究生，研究方向為中藥學。Tel: (0577)86591685

[責任編輯 時圣明]