血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平與急性缺血性腦卒中患者腦側支循環分級的相關性

段毅，王坤，王軍英，楊歡歡，趙平平

腦側支循環的形成，特別是三級腦側支循環，是一個血管新生的過程，對急性缺血性腦卒中患者病情有一定影響。近年來，微小RNA(microRNA，miRNA)在各種生理、病理過程中的作用受到廣泛關注[1-2]。其中不穩定的頸動脈斑塊中微小RNA-330-5p(miR-330-5p)過表達，可通過靶向踝蛋白-1參與有癥狀的頸動脈狹窄的發生[3]。研究發現，miR-34a-5p表達上調與急性缺血性腦卒中的發生有關[4]；血管性癡呆(vascular dementia，VD)患者血清miR-34a與血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)水平存在關系，而VEGF是血管再生過程中的關鍵活性因子[5]。因此，本研究通過檢測急性缺血性腦卒中患者血清miR-330-5p、miR-34a-5p及VEGF水平，分析其與腦側支循環分級的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年7月—2021年1月石家莊市第三醫院神經內科住院治療且建立腦側支循環的急性缺血性腦卒中患者104例為研究組，根據數字減影血管造影(DSA)檢測腦側支循環的開放層次分組，一級側支循環亞組36例(一級亞組，主要由Willis環血管構成)，二級側支循環亞組51例(二級亞組，眼動脈、軟腦膜及其他相對較小的側支、側支吻合支)，三級側支循環亞組17例(三級亞組，通過血管生成等產生的新生供血血管)。各亞組間性別、年齡、高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙史、心房顫動史、抗血小板治療及他汀治療比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。同期納入與急性缺血性腦卒中患者性別、年齡相匹配的健康體檢者40例為健康對照組，男24例，女16例，年齡41～72(57.82±8.64)歲。研究組與健康對照組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得醫院倫理委員會批準(審批號：2019051002)，全部研究對象或家屬均知情同意并簽署知情同意書。

表1 急性缺血性腦卒中患者不同亞組間臨床資料比較 [例

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①均符合“中國急性缺血性腦卒中診治指南2018”[6]中的相關診斷流程及標準，且經顱腦CT、MR或DSA證實；②納入對象從發病至行DSA時間≤7 d；③臨床資料完整。(2)排除標準：①合并嚴重肝、腎功能不全者；②合并腫瘤、血液系統疾病或免疫功能障礙者；③合并冠心病、心力衰竭、心律失常等患者；④同時存在病灶對側大腦中動脈或頸內動脈嚴重狹窄或閉塞者；⑤存在CT、MR或DSA禁忌證者；⑥精神狀態、意識功能障礙，無法完成本研究者。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血清miR-330-5p、miR-34a-5p水平檢測：研究組患者于入院24 h內、健康體檢者于體檢當日禁食8～12 h后，采集空腹肘靜脈血5 ml，離心取上層清液于干凈EP管，置于-70℃條件下保存檢測。采用熒光定量PCR技術檢測血清miR-330-5p、miR-34a-5p水平。首先利用Trizol試劑盒(無錫百泰克生物技術有限公司)提取血清總RNA，使用逆轉錄試劑盒(廣州東盛生物科技有限公司)得到cDNA，以cDNA為模板進行miR-330-5p、miR-34a-5p擴增。反應條件：95℃變性15 min，94℃ 15 s，退火及延伸60℃ 34 s，共40個循環。miR-330-5p、miR-34a-5p均以U6為內參。引物由無錫百泰克生物技術有限公司合成，引物序列見表2。用2-△△Ct法計算血清miR-330-5p、miR-34a-5p相對表達量。

表2 miR-330-5p、miR-34a-5p及U6引物序列

1.3.2 血清VEGF水平檢測：上述血清，利用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法檢測血清VEGF水平，人VEGF試劑盒購自武漢益普生物科技有限公司，嚴格按照試劑盒說明書步驟操作。

2 結 果

2.1 2組血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平比較 研究組血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平均顯著高于健康對照組(P<0.01)，見表3。

表3 健康對照組與研究組血清miR-330-5p、miR-34a-5p及VEGF水平比較

2.2 急性缺血性腦卒中患者亞組間血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平比較 一級亞組、二級亞組、三級亞組血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平依次升高，差異有統計學意義(P均<0.01)，見表4。

表4 急性缺血性腦卒中患者不同亞組間血清miR-330-5p、miR-34a-5p及VEGF水平比較

2.3 血清miR-330-5p、miR-34a-5p與VEGF水平的相關性 Pearson分析結果顯示，急性缺血性腦卒中患者血清miR-330-5p、miR-34a-5p與VEGF水平均呈正相關(r=0.674、0.624，P均=0.000)。

2.4 血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平對急性缺血性腦卒中患者三級腦側支循環建立的預測價值 以急性缺血性腦卒中一級、二級腦側支循環患者血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平為對照，評估血清指標對三級腦側支循環患者的預測價值，ROC結果顯示，血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平及三者聯合預測急性缺血性腦卒中患者三級腦側支循環建立的曲線下面積(AUC)分別為0.874、0.903、0.870、0.951，三者聯合優于單獨預測(Z=3.080、2.049、3.240，P=0.002、0.041、0.001)，見圖1、表5。

圖1 血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平對急性缺血性腦卒中患者三級腦側支循環建立的ROC曲線

表5 血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平對急性缺血性腦卒中患者三級腦側支循環建立的預測價值

3 討 論

急性缺血性腦卒中是人類第二大常見死亡原因，其發病率隨年齡的增長而逐漸增加，是導致長期身體殘疾的重要原因，給患者帶來極大的經濟和精神負擔[7-9]。大腦血管網絡的存在或缺失越來越被認為是腦卒中的重要預后原因，而傳統上的研究多集中于血管再通的各個方面，很少關注腦側支循環的作用[10-12]。腦側支循環是指當腦部供血動脈嚴重狹窄或閉塞時，血液可通過側支或新形成的血管吻合到達缺血區，使缺血區域得到不同程度的灌注代償[13-15]。既往研究發現[16-17]，多種基因和蛋白參與急性缺血性腦卒中的發生發展，其對腦側支循環的作用目前知之甚少。

miRNA主要在轉錄后通過miRNA的互補序列識別并靶向mRNA的3’-非翻譯區(3’-UTR)參與調控基因表達[18-19]。腦內主要側支通路是Willis環的后、前交通(側支)動脈，前、中、后大腦動脈樹冠間的pial小動脈吻合及小腦后動脈與小腦上動脈、小腦遠端動脈之間的穹窿吻合，有助于減輕缺血癥狀，保護神經元功能[20]。有報道稱，miR-330-5p在神經系統中靶向細胞分裂周期蛋白42(CDC42)表達，參與阿爾茨海默病發病過程中神經元對抗突觸缺失的代償作用[21]。腦側支循環的形成，尤其是三級腦側支循環，實際上是血管新生的結果。已有研究證實，血管內皮生長因子A(VEGFA)可促進冠狀動脈側支循環的形成，減輕冠狀動脈慢性全閉塞患者遠端血管的缺血和心絞痛癥狀，保留患者心室功能[22-23]。本結果顯示，急性缺血性腦卒中患者血清miR-330-5p、VEGF水平較健康體檢者高，隨著患者腦側支循環分級增加，血清miR-330-5p、VEGF水平逐漸升高，且二者表達呈正相關，提示血清miR-330-5p水平可能參與急性缺血性腦卒中患者腦側支循環的形成過程，可能與血管內皮細胞增殖分化有關，具體作用機制尚不清楚。

內皮細胞衰老被認為是血腦屏障完整性受損的主要原因，衰老機制包括內皮細胞功能障礙、動脈硬化和內皮細胞微囊釋放[24]。miRNA在細胞衰老、血管內皮損傷中的作用越來越受到關注[25-26]。國內學者報道稱，VD患者血清miR-34a表達升高，VEGF水平降低，二者水平呈負相關，可能導致VD患者病情加重[5]，與本研究結果不同。本研究結果顯示，急性缺血性腦卒中患者血清miR-34a-5p水平較健康對照組高，隨著患者腦側支循環分級增加，血清miR-34a-5p水平呈逐漸上升趨勢，且與VEGF水平呈正相關，與王御林等[5]研究相似，表明miR-34a-5p可能通過協同VEGF，參與急性缺血性腦卒中腦側支循環形成過程。推測可能的原因是VEGF是一種多向性血管生長因子，可促進急性缺血性腦卒中新生血管生成[27]，腦側支循環的形成即新毛細血管的形成，刺激血管內皮細胞分泌大量VEGF參與內皮功能調節，加上患者血腦屏障功能受損，VEGF進入血液可被檢測到。而VD患者由于病情較為嚴重，血管修復功能降低，VEGF分泌減少，可作為反映腦血管疾病嚴重程度的一種生物指標。同時發現血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平均對急性缺血性腦卒中患者三級腦側支循環的建立有一定的診斷價值，且三者聯合診斷效能更高，可能作為預測急性缺血性腦卒中患者腦側支循環分級的潛在生物標志物。

綜上所述，血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平隨急性缺血性腦卒中患者腦側支循環分級增加而呈上升趨勢，miR-330-5p、miR-34a-5p均與VEGF水平呈正相關，推測血清miR-330-5p、miR-34a-5p可能參與腦血管內皮細胞增殖分化，有利于血管新生，具體作用機制尚待更深入研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

段毅：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；王坤：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；王軍英：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；楊歡歡：進行統計學分析；趙平平：課題設計，論文撰寫