活動期肺結核患者血漿miR-29家族及血清、外周血單個核細胞中γ干擾素的表達及意義

張國棟，丁雷，朱英斌，吳海良

肺結核是一種由結核分枝桿菌引起的慢性呼吸道傳染病，肺結核嚴重威脅患者健康，目前仍是導致人類死亡的十大原因之一[1]。2019年全球范圍內估計有1 000萬人罹患結核病[2]，我國結核病數量占全球第三，每年新增病例100萬例。目前肺結核的診斷以病原學和病理學為基礎結合臨床輔助診斷技術進行綜合判斷[3]。病原學分析培養周期長，可長達2～8周，電子支氣管鏡檢測假陰性較高，臨床上痰涂片法敏感度較低[4]。因此，開發肺結核檢測新型指標具有重要意義。肺結核感染分為潛伏期肺結核和活動期肺結核，潛伏期肺結核患者無臨床癥狀，但是病原菌檢測為陽性，當機體免疫力下降時，可逐步發展為活動期肺結核[5]。miRNA為一類短序列非編碼的小RNA，參與調控干細胞分化、胚胎造血、細胞增殖等生物學過程[6]。目前已有研究顯示，miRNA與肺結核的活動性相關[7]。本研究比較了miR-29家族在不同人群中的表達差異，分析了miR-29a和靶基因γ干擾素(IFN-γ)與活動期肺結核臨床癥狀的關系，報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2018年1月—2020年1月濟南市人民醫院、山東省胸科醫院收治的肺結核患者104例，男53例，女51例，年齡30～75(42.31±16.72)歲。患者按有無臨床癥狀分為活動性肺結核組和潛伏結核感染組，活動性肺結核組患者52例，男26例，女26例，年齡(38.72±16.13)歲；潛伏結核感染組患者52例，男27例，女25例，年齡(43.21±17.24)歲。另選同期醫院體檢健康者45例作為健康對照組，男23例，女22例，年齡(40.31±20.22)歲。3組受試者性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準(批準文號：2018JN-16)，入選者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 活動期肺結核診斷標準符合《中華人民共和國衛生行業標準(WS288-2008) 肺結核診斷標準》[8]。潛伏期肺結核診斷標準：無臨床癥狀，胸部X線正常，γ-干擾素或結核菌素陽性。納入標準：(1)單一肺結核感染；(2)年齡20～70歲；(3)肺結核初治；(4)肝腎功能正常。排除標準：(1)合并肝炎或HIV感染；(2)合并腎炎；(3)免疫性疾病；(4)合并惡性腫瘤。

1.3 觀察指標與方法 (1)收集受試者臨床資料，包括性別、年齡、白細胞計數(WBC)、紅細胞沉降率(ESR)、C反應蛋白(CRP)、淋巴細胞計數、單核細胞計數、臨床癥狀等資料。(2)檢測血清IFN-γ蛋白：取受試者清晨靜脈血，3 000 r/min、4℃離心10 min，取上層血清應用ELISA法測定血清IFN-γ。(3)單個核細胞IFN-γ mRNA和血漿miR-29a、miR-29b和miR-29c表達檢測：采集受試者清晨空腹肘靜脈血3 ml于EDTA抗凝管中,4 h內以相對離心力2 000 g 離心20 min,棄上清,用淋巴細胞分離液按常規操作提取單個核細胞儲存于-80℃冰箱備檢，并將外周血分離血漿。血漿和單個核細胞提取mRNA,TRIzol裂解細胞,酚氯仿抽提總RNA，分光光度計測定RNA質量，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性,反轉錄為cDNA。反轉錄體系：RNA 1 μg，PolyA聚合酶2 μl，RTase Mix 2 μl，5×緩沖液10 μl，ddH2O至50 μl。37℃ 60 min，85℃ 5 min滅活。所得cDNA進行RT-PCR，反應體系：2×SYBR Green qPCR Mix 10 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、cDNA 1 μl、ddH2O 7 μl。RT-PCR程序：95℃預變性30 s，95℃ 10 s，58℃退火延伸30 s， 35個循環。以U6作為內參基因，各引物序列見表1，以2-ΔΔCt法計算各樣本中基因的表達量。

表1 研究采用引物序列

2 結 果

2.1 3組受試者血液學相關指標比較 3組受試者WBC、單核細胞比較，差異無統計學意義(P>0.05)。ESR、CRP、淋巴細胞數比較，活動性肺結核組>潛伏結核感染組>健康對照組，差異均具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 3組受試者血液學相關指標比較

2.2 3組受試者血漿miR-29a、miR-29b和miR-29c比較 血漿miR-29a表達比較，活動性肺結核組>潛伏結核感染組>健康對照組(P<0.05)；3組血漿miR-29b和miR-29c比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 3組受試者血漿miR-29a、miR-29b和miR-29c比較

2.3 3組受試者單個核細胞IFN-γ mRNA和血清IFN-γ比較 單個核細胞IFN-γ mRNA和血清IFN-γ水平比較，活動性肺結核組<潛伏結核感染組<健康對照組，差異具有統計學意義(P<0.01)，見表4。

表4 3組受試者單個核細胞IFN-γ mRNA和血清IFN-γ比較

2.4 血清IFN-γ、血漿miR-29a水平與活動性肺結核臨床癥狀的關系 活動性肺結核組患者依據是否有咳嗽、 胸痛、呼吸困難進行分組，組間血清IFN-γ、血漿miR-29a水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)。活動性肺結核組內有發熱、咯血癥狀患者的血清IFN-γ水平低于無發熱、咯血癥狀的患者；有發熱、咯血癥狀患者血漿miR-29a水平高于無發熱、咯血癥狀的患者(P<0.01)，見表5。

表5 血清IFN-γ、血漿miR-29a與活動性肺結核臨床癥狀的關系

2.5 血清IFN-γ、血漿miR-29a水平對活動性肺結核的臨床診斷價值 ROC曲線顯示，血清IFN-γ、miR-29a診斷活動性肺結核的臨界值為257.31 pg/ml、1.13, 曲線下面積(AUC)為0.614、0.753，敏感度為0.573、0.682，特異度為0.801、0.802；二者聯合診斷活動性肺結核的AUC為0.784，敏感度為0.710，特異度為0.850，見表6、圖1。

表6 血清IFN-γ和血漿miR-29a對活動性肺結核的臨床診斷價值

圖1 血清IFN-γ、血漿miR-29a及二者聯合診斷活動性肺結核的ROC曲線

3 討 論

我國是肺結核高發國家之一，給居民健康和社會發展帶來巨大危害。目前肺結核診斷仍然缺乏特異度高且快速的檢測方法，尋找快速準確的臨床檢測指標具有重要意義。miRNA是一種源自內源性染色體的非編碼單鏈RNA，miRNA參與機體的諸多生理功能，如細菌感染、細胞凋亡、胚胎發育等過程[9-10]。miRNA具有檢測簡單、樣品保存時間長等優點，是一種潛在的肺結核檢測指標。

目前研究顯示，已有多個miRNA與肺結核的發生、發展存在關聯。樹突狀細胞被結核分枝桿菌感染后，miRNA-155可下調ATG3水平，從而引發細胞的自噬[11]。miRNA-144與活動性肺結核相關，可通過下調TNF-α和IFN-γ的水平抑制機體保護性免疫過程，影響肺結核的發生、發展[12]。體內和體外研究中均證實miR-let-7與肺結核相關，結核分枝桿菌感染后巨噬細胞miR-let-7的表達下調，降低NF-κB通路的活性[13]。

此外，miR-21、miR-223等miRNA也被認為與肺結核的發生發展有關[14]。

miR-29家族主要分為miR-29a、miR-29b和miR-29c。目前的研究顯示，miR-29家族參與抑制細胞外基質蛋白的合成，與肝纖維化、腎纖維化、肺纖維化、心肌纖維化均存在關聯[15-16]。miR-29家族通過下調抗凋亡蛋白水平、誘導胰島β細胞凋亡，參與1型糖尿病的發生[17]。miR-29家族還參與了腫瘤的發生、發展，在不同的腫瘤中分別起抑癌作用和促癌作用[18]。

目前有研究表明，miR-29家族可通過調控T細胞分化，發揮機體抗感染免疫反應作用[19]，而在結核病發病過程中，其在T細胞介導的細胞免疫中發揮了重要作用，因此本研究比較了健康對照組、活動性肺結核組和潛伏結核感染組患者miR-29a、miR-29b和miR-29c差異，結果顯示，活動性肺結核組miR-29a表達上調，而miR-29b和miR-29c表達未出現十分明顯的數據變化。該結果提示，在人體感染結核分枝桿菌之后，miR-29a有可能負向調控人體對于病原體的免疫應答情況，抑制機體對病原體抵抗能力，導致結核分枝桿菌的活動性增高。同時miR-29a可能通過調控p85等蛋白的表達,使p53激活,從而誘導細胞凋亡，促使肺結核的病情加重。本研究結果中miR-29b和miR-29c在3組受試者中未見明顯的變化，推測這可能與受試者人群數量較少有關，同時miR-29b和miR-29c在肺結核中的作用尚不明確，這也成為今后研究的一個方向。

目前的主流研究認為，miR-29a能通過調節靶基因IFN-γ的表達而降低機體對胞內病原體的免疫應答水平[20]。本研究結果顯示，活動性肺結核患者單個核細胞IFN-γ mRNA和血清IFN-γ水平顯著下降，因此可以推測miR-29a主要參與了肺結核的發展。結核分枝桿菌感染機體后，導致miR-29a水平上調，miR-29a可促進IFN-γ mRNA與Ago2形成沉默復合物，抑制IFN-γ的表達，從而降低機體對結核分枝桿菌的免疫應答[21]。IFN-γ是抗結核感染免疫反應中的關鍵細胞因子，miR-29 可通過上調靶向作用于細胞凋亡相關蛋白參與調節免疫細胞凋亡通路及促進IFN-γ mRNA 降解，降低IFN-γ的產生和促進針對結核分枝桿菌的免疫細胞凋亡，從而使其得以逃避宿主免疫應答。

此外本研究還初步分析了IFN-γ mRNA和miR-29a水平與肺結核患者多項典型臨床癥狀之間的關系，結果表明，IFN-γ mRNA和miR-29a水平與肺結核病變程度之間具有一定的相關性。為了進一步評估IFN-γ和miR-29a在活動性肺結核中的臨床價值，構建了ROC曲線，確定了IFN-γ和miR-29a在活動性肺結核中的臨界值，表明臨床可通過檢測IFN-γ和miR-29a水平用于活動性肺結核的診斷。然而，僅依靠IFN-γ mRNA和miR-29a水平對活動性肺結核進行診斷具有很大的誤差可能，因此在實際工作中，推薦利用多種指標進行綜合推斷。而本研究中所關注的這2個指標，也同時需要進行更加深入的分析，以期待具有更為客觀及實用的結果出現。

綜上所述，miR-29a可通過調節IFN-γ的表達參與結核病的發病，臨床研究可進一步將miR-29a發展為結核病的檢測、評價指標。本研究中miR-29b和miR-29c的作用不明，有待進一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

張國棟：設計研究方案，實施研究過程，起草論文；丁雷：數據收集，分析整理；朱英斌：進行文獻調研與整理，修改論文；吳海良：提出研究方向，研究選題，論文終審