瑞舒伐他汀對晚期糖基化終產物修飾的低密度脂蛋白誘導肥大細胞活化的影響及其機制

趙馨娜，劉學波，吳宗貴

糖尿病是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的獨立危險因素，具有極強的致血管病變作用。糖尿病患者不僅冠心病的發病率是非糖尿病患者的數倍，且其冠狀動脈病變常累及多支、全壁，病變血管狹窄程度重，病變處斑塊極不穩定，容易破裂，可導致急性冠狀動脈綜合征,甚至猝死，具有較高的致死率、致殘率。因此，研究糖尿病中誘發動脈粥樣硬化斑塊破裂的因素對糖尿病合并冠心病的防治具有重大意義。

近年來，糖尿病導致動脈粥樣硬化的相關分子機制研究取得了重大進展，其中，LDL經糖基化修飾后所形成的晚期糖基化修飾低密度脂蛋白(advanced glycation end product modified low density lipoprotein， AGE-LDL)，對動脈粥樣硬化的發生和發展起到了非常關鍵的作用。研究表明，糖尿病患者體內的AGE-LDL水平遠高于非糖尿病患者，且其水平與心血管疾病的罹患風險呈正相關[1]。而大量定植于血管周圍及外膜的肥大細胞在誘發動脈粥樣硬化斑塊失穩定致突發破裂中亦扮演重要角色，其功能的發揮主要通過活化及脫顆粒來實現。肥大細胞活化及脫顆粒產物包括組胺、蛋白酶及多種炎性因子如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、IL-8和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)等，可誘發血管痙攣，降解基質削弱纖維帽、促進內皮細胞凋亡、誘導血管新生增加斑塊內出血及調節巨噬細胞膽固醇逆轉運等[2]，增加斑塊不穩定性。他汀類藥物是3羥基-3甲基-戊二酰—輔酶 A (HMG-CoA) 還原酶抑制劑，除降脂外，更具有直接的免疫調節和抗炎作用[3]，從而成為臨床動脈粥樣硬化治療中的常用藥物。近期研究表明，他汀類藥物能夠介導肥大細胞凋亡[4]。瑞舒伐他汀是目前指南推薦的高強度他汀類藥物之一，其對肥大細胞活性影響尚未見報道。本研究主要觀察瑞舒伐他汀對AGE-LDL激活肥大細胞的影響，并探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：6～8周齡的雄性C57/BL6小鼠，購于中國人民解放軍海軍軍醫大學動物實驗中心，合格證號：SYXK(滬)2017-0004。

1.1.2 實驗試劑：RPMI1640培養基(美國Hyclone公司)，FBS(美國GIBCO公司)，小鼠 IL-6、TNF-α、MMP-9ELISA檢測試劑盒(北京達科為有限公司)，雙抗(青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml，美國MP公司)，重組小鼠IL-3(rmIL-3)和重組小鼠干細胞因子(SCF，PeproTech公司)，PBS、FITC標記的抗小鼠 CD117(c-Kit)單克隆抗體和PE標記的抗小鼠FcεRIα單克隆抗體 (Biolegend公司)，流式緩沖液 (Miltenyi Biotec公司)，BCA蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司)，瑞舒伐他汀藥物原粉(阿斯利康公司)，PrimeScriptRRT Master Mix試劑盒、SYBRRPremix Ex TaqTM試劑盒[Takara，寶生物工程(大連)有限公司]。抗β-Actin兔多克隆抗體(北京康為世紀生物科技有限公司)，磷酸化p65(p-p65)、絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK)磷酸化p38(p-p38)、 MAPK磷酸化細胞外調節蛋白激酶(ERK)1/2(p-ERK1/2)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)兔單克隆抗體(Signaling Tecnology公司)，抗GAPDH鼠單克隆抗體(上海康成生物工程有限公司)。ECL化學發光液、Western預染蛋白 Marker、蛋白酶及磷酸酶抑制劑 Cocktail(Thermo公司)。RIPA(蛋白提取液)及PMSF(上海申能博彩生物技術有限公司)，Western抗體稀釋液(天恩澤生物技術有限公司)。

1.2 實驗方法 2019年6月—2020年12月于海軍軍醫大學中心實驗室進行。

1.2.1 小鼠骨髓來源肥大細胞(mBMMCs)的分離、培養：將6～8周齡的雄性C57/BL6小鼠處死，無菌條件下沖洗小鼠長骨骨髓腔。收集沖得的骨髓細胞，調整細胞密度為(0.5～1.0)×106/ml，加入RPMI 1640培養基(含50 μmol/L β-巰基乙醇、20 ng/ml rmIL-3，40 ng/ml rmSCF，10%FBS和雙抗)，置于37℃孵箱中培養。每3 d將懸浮細胞轉移至新的培養體系中繼續培養。培養4～6周后收集懸浮細胞，對形態和功能進行鑒定[5]。鑒定mBMMCs表面標記CD117和FcεRIα雙陽性表達率為95%以上。

1.2.2 AGE-LDL的制備：參照參考文獻[6]方法，用含EDTA和蔗糖的高糖反應液在37℃下與LDL共同孵育2周，以不含糖的反應液在相同條件下孵育LDL(n-LDL)作為對照。2周后在4℃下用無菌PBS充分透析，熒光檢測LDL糖化程度。經0.22 μm無菌濾器在超凈臺內過濾后加入保存液，分裝后于-80℃長期保存備用。

1.2.3 mBMMCs分泌功能實驗及分組：mBMMCs同步化后，以5×105/ml濃度種于6孔板中，分別加入PBS(Control組)、不同濃度的AGE-LDL(0.5 μg/ml、5 μg/ml、50 μg/ml,AGE-LDL組)、n-LDL 50 μg/ml(n-LDL組，陰性對照組)、LPS 100 ng/ml(LPS組,陽性對照組)、不同濃度的瑞舒伐他汀(1 mmol/L、10 mmol/L、50 mmol/L)預孵24 h后+AGE-LDL 50 μg/ml(瑞舒伐他汀+AGE-LDL組)，干預刺激6 h后收集細胞，留待抽提RNA，24 h后收集上清留待ELISA檢測TNF-α、IL-6和MMP-9含量。相同實驗方案重復4次，每個樣品設3個復孔，取其平均值。

1.2.4 Real-time PCR(RT-PCR)檢測炎性因子基因表達：用Trizol試劑抽提總RNA，參照TakaraPrimeScriptRRT Master Mix試劑說明制備cDNA。依照Takara SYBRRPremix Ex TaqTM試劑盒說明書進行RT-PCR反應，反應體系為25 μl，所用引物如下：TNF-α上游：5'- CTCCAGCTGGAAGACTCCTCCCAG-3',下游：5'- CCCGACTACGTGCTCCTCACC-3'；IL-6上游: 5'- TGGAGTCACAGAAGGAGTGGCTAAG-3'，下游: 5'- TCTGACCCACAGTGAGGAATGTCCAC-3'；MMP-9上游：5'-TCTTCCCCAAAGACCTGAAAA-3'，下游：5'-TTTGGAATCGACCCACGTCT-3’；內參基因β-actin上游：5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3'，下游：5'- CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3。反應條件為95℃ 30 s,95℃ 5 s、60℃ 30 s、72℃ 15 s重復40個循環，最后95℃ 15 s,60℃ 15 s,95℃ 15 s。每個反應重復4次。以2-△△CT相對定量法計算目的基因表達。

1.2.5 ELISA檢測上清內TNF-α、IL-6、MMP-9蛋白水平：嚴格按照相應ELISA試劑盒說明書操作步驟進行。

1.2.6 Western-blot檢測MAPK、NF-κB信號通路表達及分組：mBMMCs同步化后，以5×105/ml濃度種于6孔板中，分別加入PBS(Control組)、AGE-LDL 50 μg/ml (AGE-LDL組)、n-LDL 50 μg/ml(n-LDL組)、瑞舒伐他汀10 mmol/L + AGE-LDL 50 μg/ml(瑞舒伐他汀+AGE-LDL組)，干預刺激30 min后收集細胞。同步化后的mBMMCs再分別與MAPK p38、ERK1/2及NF-κB抑制劑SB203580(10 mmol/L)、PD98059(20 mmol/L)及PDTC(20 mmol/L)預孵2 h，加入 AGE-LDL(50 μg/ml)，作用1 h后收集細胞。用冷PBS洗滌細胞2次，使用200 μl含抑制劑的預冷RIPA裂解液冰上裂解細胞30 min，4 ℃ 16 000 g離心30 min后收集上清。用SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉至PVDF膜上。按說明書推薦濃度稀釋一抗和二抗，先后孵育。使用超敏ECL發光液依照其說明書步驟進行檢測。以上試驗至少重復3次。

2 結 果

2.1 AGE-LDL及瑞舒伐他汀對mBMMCs合成和分泌炎性因子TNF-α、IL-6、MMP-9的影響 mBMMCs經AGE-LDL刺激作用6 h后，RT-PCR檢測顯示,與Control組比較，AGE-LDL(5.0 μg/ml、50.0 μg/ml)組、LPS組TNF-α、IL-6 及MMP-9 mRNA表達明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)，其中AGE-LDL 50 μg/ml亞組表達量最高；n-LDL組與Control組比較，TNF-α、IL-6和MMP-9 mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05),見表1。瑞舒伐他汀則可下調AGE-LDL誘導的TNF-α、IL-6和MMP-9 mRNA表達，差異有統計學意義(P<0.05)，但進一步調高瑞舒伐他汀濃度至50 mmol/L效果未再見增強，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。AGE-LDL刺激24 h后,細胞培養上清的ELISA檢測結果與上述炎性指標mRNA表達結果一致，見表3。

表1 不同濃度的AGE-LDL對mBMMCs TNF-α、IL-6及MMP-9 mRNA表達影響

表2 不同濃度的瑞舒伐他汀對AGE-LDL促mBMMCs炎性因子TNF-α、IL-6及MMP-9 mRNA表達的影響

表3 瑞舒伐他汀對AGE-LDL促mBMMCs炎性因子TNF-α、IL-6及MMP-9分泌的影響

3 討 論

肥大細胞來源于骨髓造血干細胞，經外周循環后在相關細胞因子的作用下分化成熟，并經外界刺激后能夠活化釋放其胞內多種活性物質，參與介導過敏反應和免疫炎性反應。相關研究表明，動脈粥樣硬化病變的血管外膜及斑塊內均聚集有大量肥大細胞，激活后釋放胞內生物活性物質，介導巨噬細胞吞噬，損傷內皮功能，調節脂質轉運，促進血管平滑肌增殖及向泡沫細胞轉化，促使炎性細胞遷移，誘導黏附分子表達，調節免疫反應，從而參與AS的發生與發展[7-8]。而激活的肥大細胞所釋放的炎性因子TNF-α、IL-6、MMP-9與動脈粥樣硬化密切相關[9]。

圖1 AGE-LDL及瑞舒伐他汀對mBMMCs MAPK和NF-κB信號通路激活的影響

表4 AGE-LDL及瑞舒伐他汀對mBMMCs MAPK和NF-κB信號通路激活的影響

表5 p38-MAPK、ERK1/2、NF-κB抑制劑對AGE-LDL促TNF-α、IL-6及MMP-9分泌的影響

AGE-LDL作為一種不可逆的非酶糖基化產物，由機體內的低密度脂蛋白在長期高糖環境下作用生成。與正常人相比，糖尿病患者體內的AGE-LDL水平明顯升高，且其升高的水平與動脈粥樣硬化和冠心病的罹患風險呈正相關[10]。AGE-LDL通過增加血小板聚集，誘導細胞凋亡，降低血管活性物質NO的合成，增加氧化應激，調節血管內皮黏附分子(VCAM-1)及巨噬細胞清道夫受體表達，降低LDL的轉運，誘發血管損傷等一系列機制，促進AS的發生和發展[11]，是糖尿病致動脈粥樣硬化的重要病因。以往研究發現，經AGE-LDL免疫過的糖尿病apoE和LDLR(-/-)小鼠的AS進程可得到有效抑制[12]。目前，AGE-LDL針對血管內皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞產生作用及其機制的研究均有相關文獻報道[13]，而其對肥大細胞作用如何尚無相關報道。Sick等[14]的研究顯示，晚期糖基化終產物(AGEs)在短時間內(10 min內)即可激活肥大細胞，促使肥大細胞釋放組胺。由此筆者推測，同樣具有促炎效應的AGE-LDL亦極有可能對肥大細胞具有類似激活效應，使其分泌大量炎性介質，促使糖尿病動脈粥樣硬化易損斑塊形成，發生急性血栓事件。

本實驗發現,AGE-LDL能夠促進mBMMCs分泌炎性介質TNF-α、IL-6、MMP-9。AGE-LDL誘導肥大細胞活化的作用可能是糖尿病患者易患動脈粥樣硬化及冠心病的病因之一。

他汀類藥物除能強效降低血總膽固醇及LDL-C水平，還具有改善血管內皮功能、抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移、抗氧化、抗炎、抑制血小板聚集等作用，防止動脈粥樣硬化的形成，穩定和縮小動脈粥樣硬化斑塊，從而顯著降低AS高危患者主要心血管事件的發生率和病死率。目前指南推薦，對糖尿病伴心血管疾病者，無論其基線LDL-C水平如何，均建議采用他汀類藥物治療。現有多項研究表明，阿托伐他汀、辛伐他汀和氟伐他汀等臨床常用的他汀類藥物均可抑制肥大細胞分泌活性炎性介質，穩定肥大細胞[15]。本研究發現，作為目前血脂管理中優選的他汀類藥物，瑞舒伐他汀能夠抑制AGE-LDL誘導mBMMCs活化、分泌促炎性因子，具有穩定肥大細胞的作用。

促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)信號通路作為真核生物信號傳遞網絡中的重要途徑之一，參與介導基因表達調控及細胞質功能活動。大多數細胞內存在MAPKs信號轉導通路，在細胞外被刺激激活后，形成不同轉導通路將信號轉導至胞內及核內，參與調節細胞增殖、分化、轉化及凋亡等過程。

NF-κB是細胞內重要的核轉錄因子，在調節炎性反應的免疫應答中起關鍵作用，其過度激活與細胞凋亡、損傷應激密切相關[16]。現有文獻報道，AGEs能夠通過激活NF-κB信號通路誘導泡沫細胞形成，而肥大細胞激活后生成的多種炎性因子如TNF-α、IL-6等均又與NF-κB信號通路的激活相關[17-18]。

本研究發現,AGE-LDL能夠激活p38 MAPK、ERK1/2和NF-κB信號通路，促進磷酸化p38 MAPK、ERK1/2和NF-κB的表達，對JNK信號通路則無激活作用。瑞舒伐他汀能夠抑制AGE-LDL所誘導的p38 MAPK、ERK1/2和NF-κB激活。ERK1/2抑制劑PD98059、NF-κB抑制劑PDTC和瑞舒伐他汀均能夠抑制AGE-LDL誘導mBMMCs合成和分泌促炎性介質。而P38抑制劑SB203580則無該作用。上述結果表明，AGE-LDL主要是通過激活ERK1/2和NF-κB信號通路激活mBMMCs，促進其合成和分泌TNF-α、IL-6等炎性因子。該激活效應能夠被瑞舒伐他汀所抑制，其作用可能通過其對ERK1/2和NF-κB信號通路的抑制得以實現。

總之，本實驗初步明確了AGE-LDL對肥大細胞活化的影響及其相關的分子機制，并且發現瑞舒伐他汀具有穩定肥大細胞的作用，為糖尿病合并AS的防治提供了新的理論基礎。必須指出的是，AS在人體內的發生發展過程相當復雜，本研究作為體外單一因素研究，難免存在一定局限性。隨著肥大細胞與AS研究的不斷深入，本研究將會為糖尿病合并AS的形成機制和防治提供新視角和新靶點。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

趙馨娜：設計研究方案，實施研究過程，統計分析，論文撰寫；劉學波：提出研究思路，論文修改和審核;吳宗貴：課題設計，論文審閱和修改