膀胱癌患者血清miR-143、miR-144和miR-145水平變化及臨床意義

楊新選，任航

咸陽市第一人民醫院泌尿外科，陜西 咸陽 712000

膀胱癌是泌尿系統三大常見惡性腫瘤之一。2020年全球膀胱癌新發病例573 278例，死亡病例212 536例，分別占癌癥發病和死亡病例的3.0%、2.1%[1]。膀胱癌發病具有隱匿性，患者多因肉眼血尿就診，已失去最佳治療時間。膀胱鏡雖然是診斷膀胱癌的金標準，但屬有創操作，痛苦較大，因此尋找有效、可靠、便捷的生物學標志物很有必要。微小RNAs(microRNAs，miRs)是一類長度為21～25個核苷酸的非編碼RNAs，研究表明，膀胱癌患者體內存在多種miRs異常表達，與腫瘤發生和發展密切相關[2]。miR-143、miR-145均位于人類5號染色體，miR-144位于人類7號染色體，在多種腫瘤中呈低表達，具有抗癌基因作用，如乳腺癌中，miR-143可通過降低細胞外信號調節激酶5抑制腫瘤細胞生長[3]；miR-144可通過抑制中心體相關蛋白55抑制腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移[4]；miR-145可通過靶向雌激素受體-α抑制腫瘤細胞的侵略性等[5]。本研究分析膀胱癌患者血清miR-143、miR-144和miR-145水平變化，并探討三者與膀胱癌臨床病理特征的關系及其對膀胱癌臨床診斷的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取咸陽市第一人民醫院泌尿外科2016年1月至2017年1月收治的83例膀胱癌患者為膀胱癌組，其中男性49例，女性34例；年齡47～83歲，平均(62.58±8.74)歲；腫瘤直徑1.2～5.6 cm，平均(3.21±0.87)cm；TNM分期：Ta期12例，T1期19例，T2期17例，T3期31例，T4期4例；分化程度：未分化6例，低分化35例，中分化19例，高分化23例；淋巴結轉移者36例，淋巴結未轉移者47例。納入標準：(1)符合《歐洲腫瘤醫學協會膀胱癌診斷、治療和隨訪實踐指南》[6]診斷標準；(2)患者及家屬均知情同意；(3)臨床資料完整；(4)可接受隨訪者；(5)意識清楚。排除標準：(1)血液系統疾病者；(2)全身免疫性疾病者；(3)重要臟器功能損害者；(4)合并其他惡性腫瘤者；(5)近1個月內接受激素和免疫制劑治療者。另選取同時期48例在我院體檢的健康者為對照組，其中男性28例，女性20例；年齡38～78歲，平均(61.58±7.83)歲。兩組受檢者的性別和年齡比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經我院醫學倫理委員會批準。

1.2 檢測方法 收集兩組受檢者5 mL空腹靜脈血，室溫靜置10 min，1 000 r/min離心1 min，分離血清，總RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號：R1200)提取總RNA，反轉錄試劑盒(杭州海基生物技術有限公司，貨號：D1802)反轉錄為cDNA，進行RT-qPCR擴增。miR-143上游引物：5'-TGAGATGAAG CACTGT-3'，下 游 引 物：5'-ACATCGACTGTAGCATA-3'；miR-144上游引物：5'-GGGAGATCAGAAGGTGATT-3'，下游引物：5'-GTGCAGGGTCGGAGGT-3'；miR-145上游引物：5'-TCCGATTGAGTCATTACCAT-3'，下 游 引 物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。反應體系：10μL SYBR GreenⅠMaster、1.0μL引物、2μL DNA模板、8.5μL RNase-Free H2O；反應條件：95℃預變性30 s、95℃變性5 s、60℃退火35 s，72℃延伸30 s，循環40次。以U6做內參基因，上游引物：5'-CAGGGGCCATGCTAAATCTTC-3'，下 游 引 物：5'-CTTGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反 應 結 束后得到各反應管Ct，2-ΔΔCt法計算血清miR-143、miR-144、miR-145相對表達量。

1.3 隨訪 通過電話和門診隨訪等方式對患者進行隨訪，隨訪截止2020年1月30日，總生存期定義為化療開始到隨訪截止時間或死亡。

1.4 統計學方法 應用SPSS26.0統計學軟件分析數據，計數資料比較采用χ2檢驗；正態分布計量資料以均數±標準差(±s)表示，采用t檢驗；偏態分布計量資料以[M(P25，P75)]表示，采用Z檢驗；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間生存率Log-rank檢驗；受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析指標對膀胱癌的診斷價值，曲線下面積(area under curve，AUC)采用Z檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組受檢者的血清miR-143、miR-144、miR-145水平比較 膀胱癌組血清miR-143、miR-144、miR-145水平低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組受檢者的血清miR-143、miR-144、miR-145水平比較(±s)

表1 兩組受檢者的血清miR-143、miR-144、miR-145水平比較(±s)

組別膀胱癌組對照組t值P值例數83 48 miR-143 0.20±0.07 1.07±0.36-16.672 0.001 miR-144 0.54±0.11 0.89±0.18-12.194 0.001 miR-145 1.37±0.72 5.66±1.76-16.107 0.001

2.2 血清miR-143、miR-144和miR-145水平與膀胱癌臨床病理特征的關系 血清miR-143、miR-144和miR-145水平與膀胱癌患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度無關，差異無統計學意義(P>0.05)，與TNM分期和淋巴結轉移有關，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 血清miR-143、miR-144和miR-145水平與膀胱癌臨床病理特征的關系[±s，M(P25，P75)]

表2 血清miR-143、miR-144和miR-145水平與膀胱癌臨床病理特征的關系[±s，M(P25，P75)]

病理特征性別例數miR-143 t值-0.254 P值0.800 miR-144t值1.553 P值0.124 miR-145 t值-1.643 P值0.106男女49 34 0.20±0.06 0.21±0.07 0.56±0.11 0.52±0.12 1.26±0.60 1.54±0.84年齡(歲)≥60<60腫瘤大小(cm)≥3<3 TNM分期Ta～T1 T2～T4分化程度低未分化中高分化淋巴結轉移46 37 43 40 31 52 41 42 0.20±0.07 0.21±0.06 0.19±0.07 0.22±0.06 0.22±0.07 0.19±0.06 0.19±0.07 0.22±0.06-1.369-1.917 2.154-1.675-2.684 0.175 0.059 0.034 0.098 0.009 0.54±0.12 0.55±0.11 0.51(0.46,0.59)0.56(0.46,0.65)0.58±0.10 0.52±0.12 0.52±0.10 0.56±0.13-0.386-1.044 2.084-1.658-2.359 0.700 0.296 0.040 0.101 0.021 1.34±0.80 1.42±0.62 1.24±0.76 1.52±0.65 1.57±0.60 1.26±0.76 1.29±0.81 1.45±0.61-0.546-1.822 2.053-1.024-2.289 0.587 0.072 0.044 0.307 0.021是否36 47 0.19±0.06 0.22±0.06 0.51±0.12 0.57±0.10 1.17±0.79 1.53±0.62

2.3 血清miR-143、miR-144和miR-145水平與膀胱癌預后的關系 隨訪6～36個月，中位時間18個月，共死亡18例，3年總生存率為78.31%(65/83)，以血清miR-143、miR-144和miR-145的中位數0.19、0.53、1.38為基準，分為高、低表達組。高miR-143水平組(n=43)總生存率為88.37%(38/43)，低miR-143水平組(n=40)總生存率為67.50%(27/40)；高miR-144水平組(n=41)總生存率為87.80%(36/41)，低miR-144水平組(n=42)總生存率為69.05%(29/42)；高miR-145水平組(n=43)總生存率為90.24%(37/41)，低miR-145水平組(n=42)總生存率為65.85%(27/41)；Kaplan-Meier曲線顯示，高血清miR-143、miR-144、miR-145水平組總生存率高于低miR-143、miR-144、miR-145水平組，差異有統計學意義(Log-Rankχ2=4.781、4.686、7.070，P=0.029、0.030、0.008)，見圖1。

圖1 膀胱癌患者預后的Kaplan-Meier曲線

2.4 血清miR-143、miR-144和miR-145水平對膀胱癌的診斷價值 ROC曲線顯示，miR-143+miR-144+miR-145預測膀胱癌的AUC明顯大于miR-143、miR-144、miR-145單 獨 預 測(Z=2.777、3.173、3.188，P=0.006、0.002、0.001)，見表3，見圖2。

圖2 血清miR-143、miR-144和miR-145水平診斷膀胱癌的ROC曲線

3 討論

膀胱癌的發生和發展是多基因、多階段、多因素共同作用結果，早期確診困難，膀胱癌中80%為非浸潤性腫瘤，未侵入膀胱逼尿肌，及時給予有效治療可避免其發展為浸潤性膀胱癌，改善患者預后。隨著分子學研究的不斷發展，各類靶向藥物雖然提升了患者預后，但獲得性耐藥越來越多，因此發現膀胱癌新的治療靶點具有重要意義。miRNAs是近年來新發現的一種小RNA，可在轉錄后可調控基因表達，調控細胞多種生物學行為，且50%以上位于腫瘤相關的脆性位點或基因區域，與腫瘤發生和發展密切相關，循環血液中miRNAs具有較高穩定性，不易被RNA酶降解，因此血清miRNAs水平可成為癌癥重要生物標志物。

miR-143和miR-145由MICHAEL等[7]首次于2003年報道，該報道顯示，結直腸癌組織中miR-143、miR-145表達下調，提示miR-143、miR-145可能參與結直腸發生。近年來大量研究證實，miR-143、miR-145參與多種惡性腫瘤進展，如LIU等[8]研究報道，食管鱗癌細胞中miR-143表達下調，可靶向抑制人LIM和SH3蛋白1(LASP-1)表達，抑制食管鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲。NABIPOORASHRAFI等[9]研究報道，黑色素瘤細胞中miR-143表達下調，可通過下調C-X-C基序趨化因子受體4、波形蛋白、鈣黏蛋白、基質金屬蛋白酶9等轉移相關基因抑制黑色素瘤細胞增殖、遷移和促進凋亡。SU等[10]研究報道，食管癌細胞中miR-145表達下調，可靶向RAR相關孤兒受體(RAR-related orphanreceptor，RORs)抑制食管癌細增殖和遷移。WEI等[11]研究報道，宮頸癌細胞中miR-145表達下調，可靶向尿路上皮癌相關1基因抑制宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲。上述研究提示miR-143、miR-145在多種惡性腫瘤中發揮抑癌基因作用。我們研究發現，膀胱癌患者血清miR-143、miR-145水平明顯降低，可能與受其他因子轉錄后調控或編碼基因突變等有關。同時結果還顯示，膀胱癌患者血清miR-143、miR-145水平與TNM分期和淋巴結轉移有關，提示miR-143、miR-145在膀胱癌中也可能發揮抑癌基因作用。研究發現，膀胱癌組織中miR-143、miR-145表達下調，與歐洲癌癥研究與治療組織風險評分呈正相關，提示兩者具有抑制腫瘤存活效應作用[12-13]。其機制可能與miR-143能靶向抑制MYB原癌基因2抑制膀胱癌細胞增殖、侵襲，和miR-145能靶向調節SRY盒轉錄因子11抑制膀胱癌細胞增殖、周期進展、促進凋亡有關[14-15]。

miR-144的前體以miR-144/miR-451簇形式存在，序列高度保守，最早研究發現其參與了紅細胞表型轉變，在紅細胞生成與貧血中發揮重要作用；隨著研究的進展，研究發現miR-144在多種腫瘤發生和發展受中也扮演重要角色。如CHENG等[16]研究報道，結直腸癌細胞中miR-144表達下調，能靶向前B細胞白血病轉錄因子3抑制結直腸癌細胞遷移和侵襲。MUSHTAQ等[17]研究報道，胃癌細胞中miR-144表達下調，能靶向激活增強子結合蛋白4抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲。提示miR-144也在多種惡性腫瘤中發揮抑癌基因作用。筆者研究顯示，膀胱癌患者血清miR-144水平明顯降低，且與TNM分期和淋巴結轉移有關，考慮與癌細胞突變后影響了miR-144調控機制導致其表達降低有關，并提示miR-144在膀胱癌中發揮抑癌基因作用。GUO等[18]通過miR-144抑制劑阻斷內源miR-144表達，發現膀胱癌細胞增殖明顯加快，而增強其表達則會抑制細胞增殖，其機制與miR-144能靶向zeste同源物2抑制Wnt/β-連環蛋白信號通路激活進而抑制膀胱細胞增殖有關，進一步驗證了本研究結果。我們結果顯示，高血清miR-143、miR-144、miR-145水平的膀胱癌患者3年總生存率明顯提高，說明低血清miR-143、miR-144、miR-145水平還可能直接影響膀胱癌患者預后，分析與低血清miR-143、miR-144、miR-145水平可引起膀胱癌細胞增殖、遷移、侵襲有關。結果還顯示，miR-143、miR-144、miR-145均對膀胱癌具有較高準確度，但特異度較低，而聯合檢測不僅能診斷特異度，還可提升診斷敏感度、準確度，說明聯合檢測診斷效果更好，可幫助臨床早期診斷，并幫助評估膀胱癌嚴重程度和預后。

綜上所述，膀胱癌患者血清miR-143、miR-144和miR-145水平明顯降低，與臨床病理特征有關，聯合檢測可提升膀胱癌診斷效能，有望成為膀胱癌的潛在治療靶點。