后基因組時代基于選擇導入系的水稻設計育種策略

石英堯, 馬賽, 曾威*, 郝芷圻, 李思敏, 王文生, 黎珉*

(1.安徽農業大學農學院, 合肥 230036; 2.中國農業科學院作物科學研究所, 北京 100081)

水稻(OryzasativaL.)是我國乃至世界上較為重要的糧食作物之一，是全世界超過30%以上的人口的主要食物來源。我國人口在未來20年仍將繼續增長，對糧食的需求持續增加，但我國耕地面積卻在不斷減少，未來10年單產必須提高15%以上才能確保我國的糧食安全[1-2]，因此，水稻的安全生產對保障我國糧食安全具有重要的戰略意義。水稻的兩次“綠色革命”使產量取得了兩次重大飛躍[3]：20世紀60年代，矮化育種的“綠色革命”解決了大量施肥導致的植株倒伏和減產問題，水稻單產大幅度提升；20世紀70年代，雜交水稻的三系配套將水稻產量又推向了一個更高的水平。傳統水稻育種主要分為優異親本組配獲得育種群體、優良后代選擇、優良后代培育為新品種[4]。

進入21世紀，水稻生產面臨著新的挑戰，不斷增長的人口與耕地面積和水肥資源的矛盾日益突出。隨著全球氣候環境不斷惡化，自然災害如干旱、鹽漬、高溫熱害、病害、土壤貧瘠嚴重影響了糧食安全[5]。傳統育種消耗大量的人力、物力，一般需要6～8年才能培育出一個優異品種，難以滿足水稻育種的需要。復雜數量性狀(如產量和抗逆性)一般由微效多基因控制，同時受遺傳背景和環境影響，功能基因組學成果難以直接應用于育種實踐中，如何突破傳統遺傳育種技術的瓶頸，充分利用水稻種質資源的遺傳變異，設計不同生態地區的水稻新品種所需要的廣適性品種已經成為亟需解決的重大科學問題。

黎志康等[6-7]提出選擇導入育種(breeding by selective introgression, BBSI)的理念和策略，用于復雜性狀的遺傳剖析和新品種改良。BBSI已通過“為亞非脫貧培育推廣綠色超級稻”重大國際合作項目廣泛實施，有效地將種質資源與基因發掘、目標性狀定向改良和品種選育過程結合[8]。其團隊以200余份核心種質資源為供體，應用BBSI技術構建了大量優良骨干親本背景的回交群體和選擇導入系，多個新品種通過國交和省級審定的水稻新品種，推廣面積超過600萬 hm2。同時，獲得了大量表現優異的選擇導入系(selective introgression lines, SILs)，成為培育綠色超級稻的基礎材料，為后續分子設計育種奠定了基礎[9]。近年來，水稻功能基因和群體基因組的研究使精準育種成為可能[10-11]，也稱為基因組信息育種，或設計育種(breeding by design, BBD)[12]。隨著水稻基因組不斷完善，如何將大量的遺傳變異信息與育種結合，培育適合不同環境的優良新品種是水稻分子育種面臨的新挑戰。本文闡述了BBSI研究理念及策略的發展過程及其分子設計育種中的運用，并探討了如何利用分子數量遺傳理論和全基因組變異信息來驗證并豐富該策略，包括BBSI對在其它作物育種中實施的可能性。

1 選擇導入育種策略的提出

回交(backcross, BC)育種是將一個高遺傳性狀轉入優良品種的方法[13]。BC群體的后代在表型上和其輪回親本(recurrent parent, RP)類似，但攜帶一個或多個供體的目標性狀。供體基因組被隨機導入到 RP 背景中，并且 BC 后代中 RP 基因組的比例以[1-(1/2)(t+1)](t是回交的代數)的速率恢復，對一個特定的 BC群體而言，其攜帶的供體基因組數量可能存在很大差異[14]。傳統的 BC 育種需要回交和篩選每一代 BC 的目標性狀，其應用存在一定局限性，多用于提高優良品種單顯性基因控制的抗病性等質量性狀。例如用于提高優良水稻品種Pusa Basmati-1和Kao Dawk Mali 105的抗病性[15-16]。但BC育種作為一種相對保守的方法，較少用于多基因控制的數量性狀的改良。這是因為攜帶顯性單基因的BC植株可以在每一代BC中直接選擇回交。而當目標性狀受隱性基因控制時，育種者必需從每一代BC的BC_F1雜合植株中鑒定攜帶目標隱性等位基因的植株，而通過表型選擇實現隱性基因的導入需要兩倍于顯性基因的時間。

使用隨機BC分離群體進行數量性狀位點(quantitative trait loci, QTL)定位可以得出兩個主要結論[17-21]：第一，復雜性狀一般受多個QTL控制，其效應受遺傳背景影響；第二，主效QTL較少，大部分QTL為微效位點，容易受上位性和環境影響[22-24]。這兩個結論為分子標記輔助回交(marker-assisted backcross, MABC)育種改良提供了便利[25]。一般來說，當有利基因和不利基因緊密連鎖會導致遺傳改良的失敗，而MABC育種同時進行不利基因的背景選擇和目標基因的前景選擇時，效率會更高[26-27]。隨著高通量測序技術的發展，基因型鑒定成本大幅降低，MABC被廣泛應用于稻瘟病[28-29]、細菌性白葉枯病[30-32]、癭蚊[33]、條紋病毒[34]和褐飛虱[35]等抗性改良，耐淹[36]、耐鹽[37]、耐旱[38]、耐低磷[39]等非生物脅迫耐性改良，以及香味[40]等品質性狀改良。

為了進一步將QTL挖掘與實際育種結合起來，Tanksley和Nelson提出了將QTL分析與品種選育結合起來的高代回交群體QTL分析方法(advanced backcross QTL, AB-QTL)[41]。該方法在進行QTL定位的同時，還可以將供體中的有利等位基因導入到優良自交系中，目前已廣泛應用于水稻產量[42- 43]、品質[44]、生物和非生物脅迫[45-46]等復雜性狀的遺傳分析。但與典型的基因組作圖研究一樣，AB-QTL分析需要對隨機群體進行基因型和表型的分型，因此很難應用于涉及大量育種群體的育種計劃。為了克服AB-QTL方法的缺點和局限性，黎志康等[6-7]提出了BBSI的概念和策略(圖1)，用于復雜性狀的遺傳剖析和同步改良。

圖1 選擇導入育種策略

BBSI的整體策略主要為六個步驟：①利用一個優良品種作為RP與一組不同來源背景的供體進行雜交選育出BC1F2或BC2F2群體，進一步通過自交混收形成單一的混收BC1F2或BC2F2群體。②對每個BC1F2或BC2F2群體進行不同目標性狀篩選，并與RP進行比較，篩選在目標性狀上表現明顯優于RP的單株(2%～5%)。③為單個(多個)目標性狀選擇的所有BC1F2或BC2F2植株在相同的篩選條件下對所有目標性狀進行后代測試，所有入選單株在不同篩選條件下進行后代測試以選擇第二個目標性狀，并根據附加目標性狀的數量和附加目標性狀的剩余遺傳變異量重復后代測試2～3次。到步驟③結束時，從單個 BC 群體中選擇出的所有株系都被確認攜帶改良的目標性狀，并在表型上與RP相似，形成一組在RP背景下的性狀特異性的SILs。④使用分子標記分析選定的SILs，在目標環境中對目標性狀進行精準表型分析，以挖掘影響目標性狀的基因/QTL，以及通過連鎖作圖或選擇導入(selective introgre-ssion, SI)等方法鑒定影響非目標性狀的基因和QTL。⑤根據步驟④的結果，攜帶目標性狀并在正常條件下優于RP的有希望純合的SILs進入區試試驗并逐步成為新品種，同時發掘目標/非目標性狀基因/QTL及構建遺傳網絡。⑥上述優良RP遺傳背景中選育的SILs及其與目標和非目標性狀相關遺傳(網絡)信息，構成了通過設計聚合QTL(designed QTL pyramiding, DQP)或BBD進一步改良多個復雜性狀的材料和信息平臺。

2 選擇導入育種策略的實踐

2.1 BBSI在改良復雜性狀上的顯著作用

BBSI策略已在中國及菲律賓、越南、老撾、緬甸等多個國家實施，對提升當地優良品種對非生物/生物脅迫的耐受性或抗性以及正常條件下的高產等發揮了顯著效果[47-54]。本文總結了BBSI的一部分結果，首先，幾乎所有的復雜性狀都存在大量有用的遺傳變異，這在以往的水稻遺傳改良中卻未能得到充分利用，可能是由于這些變異在很大程度上被隱藏了。例如利用BBSI進行的耐冷性(cold tolerance,CT)[54]和耐淹性(submer-gence tolerance, SUT)[55]研究中，3種秈稻類型的供體都表現出較差的CT，但導入粳稻背景下的SIL卻表現出更強的CT，說明這些供體雖然本身CT較差，但仍可用作改良目標品種耐冷性的優良供體；秈稻TKM9和Khazar兩種供體對淹水高度敏感，但導入3個優良遺傳背景的BC后代中都產生了更強的SUT。顯然，耐冷和耐淹的基因/等位基因都隱藏在這些供體中。其次，BC育種加上適當的表型選擇(在適當的壓力下與 RP 直接比較)是有效發掘這種“隱蔽基因”的有利方式。最后，與RP關系較遠的供體往往在BC后代中貢獻更多的超親分離(表1)[56-57]。

表1 利用BBSI改良8個生物及非生物脅迫性狀[56-57]

BBSI育種不僅可以改善水稻單一性狀，還可以通過對不同目標性狀的多輪表型選擇同時改善2～3個復雜性狀。Ali等[58]以具有廣適性的優異品種黃華占(Huanghuazhan, HHZ)為受體，8個不同來源的親本(Phalguna、IR64、特青、OM1723、IR50、PSBRC66、CDR22、PSBRC28)為供體，構建8個BC1群體，通過3輪表型選擇共獲得了496個BC1F4HHZ_SILs。在1～3個非生物脅迫和非脅迫條件下，大部分SILs的產量得到顯著提高。在496個BC1F5SILs中，至少有13個在短短的6年時間內被直接利用，成為東南亞、南亞等國家的綠色超級水稻(green super rice, GSR)主栽品種，推廣種植超過100萬hm2[9]。BBSI 步驟①～③和⑤中的BC育種部分已在中國和國際水稻研究所(IRRI)大規模實施，從200多份來自世界各地的微核心種質中，將有利的性狀/基因/等位基因導入46個優良親本(商業品種和雜交親本)。通過BBSI的實施，這些品種在少水、少肥和少藥的條件下仍表現出高產和穩產的特性[9]。上述研究都清楚地證明了BBSI作為一種改良復雜性狀育種策略的強大力量和優勢。這些SILs是未來BBD育種中揭示控制復雜性狀背后的基因/QTL及等位基因的核心材料[12]。

2.2 BBSI對遺傳學研究的理論貢獻

目前，已經鑒定和克隆到多個影響農藝性狀的QTL，但是大部分位點尚未克隆。影響復雜數量性狀的非等位基因間互作，尤其是多個基因間普遍存在的高級互作是造成絕大多數QTL定位研究及解釋困難的主要原因[59-62]。

通過整合基因信號轉導的網絡模型和傳統數量/群體遺傳的理論，Zhang等[63]提出了用于剖析復雜性狀遺傳網絡的分子數量遺傳學理論。該模型根據影響復雜性狀的信號轉導途徑中兩種功能基因之間最基本的功能依賴關系(functional dependency, FD)定義了兩個概念：功能遺傳單元(functional genetic units, FGUs)和層次原則(principle of hierarchy)。FGUs代表在每個信號通路水平上同一層次起作用的一組基因，它們之間的功能存在相互依賴的關系。基因間的兩大類功能依賴關系(上下游功能依賴和同一個FGU內的功能依賴)決定了數量遺傳和群體遺傳理論模型中的QTL間互作(epistasis)和非隨機關聯(non-random associations)的存在(圖2)。

圖2 復雜性狀的基本遺傳模型

基于選擇導入群體的BBSI過程可以初步驗證這一理論模型，步驟⑤是利用選定的SILs和DNA標記，揭示目標性狀和非目標性狀的基因/QTL和遺傳網絡,具體如下：從BC群體中選擇出一套SILs來改良目標性狀，這些性狀必需與影響這些性狀的供體等位基因相關聯。因此，對于入選的SILs，其目標性狀相關基因位點的供體等位基因出現的頻率將高于未被選擇的BC群體中理論上預期的頻率。SILs中特定位點(QTL)上供體等位基因的頻率越高，說明供體等位基因對目標性狀的影響越大。對于來自一個特定BC群體的SILs，使用DNA標記檢測控制目標性狀的主效基因/QTL需要進行全基因組標記檢測以確定供體等位基因頻率超出其在未選擇群體中的理論預期的位點。從統計學上說，控制目標性狀的非連鎖主效位點(存在上位性互作)選擇可能導致供體等位基因之間的一種很強的非隨機關聯[64]。因此，通過對BC群體中的目標性狀進行強脅迫選擇選育出的SILs是檢測控制目標復雜性狀的上位QTL的有用材料[63]。

BBSI成功地利用SILs和上述方法在水稻中分析了多種非生物脅迫(干旱、水淹、低溫)耐受性的遺傳網絡。例如，利用優質粳稻品種吉粳88(Jigeng 88, JG88)為RP，分別與四個供體雜交，從產生的BC2F2分離群體中選擇了72個SILs用于干旱脅迫下的產量性狀改良與遺傳網絡構建[65]。利用上述理論模型鑒定到一個由29個FGUs(包含30個QTLs)組成的假定遺傳網絡；利用來源于三個輪回親本IR64、特青、NPT和三個供體TKM9、FR13A 和 Khazar 之間的雜交，從產生的9個BC群體中選擇出162個耐淹SILs用于水淹脅迫下的遺傳網絡構建[55]，共鑒定到12個遺傳網絡，每個遺傳網絡都包含多個控制耐淹性狀的FGUs，共挖掘出由68個bin區間組成的167個FGUs，包含295個QTLs；利用相同策略，對于優良粳稻C418(RP)與4個冷敏感秈稻(供體)雜交形成的BC2F2群體，經兩輪選擇和后代測試，篩選出30個耐冷的SILs[53]。在水稻營養階段，分析了強烈冷脅迫選擇的全基因組響應，最終構建了一個由28個FGUs組成的遺傳網絡，包含56個QTLs，其中有4個顯著超導入供體等位基因位點。又利用超優一號(Chaoyou 1, CY1)(RP)和5個遺傳背景多樣但冷敏感的供體(生殖階段進行兩輪CT強選擇)的回交BC2群體，選擇出48個CT_SILs，構建了一個由46個FGUs(包含50個QTLs)組成的遺傳網絡[66]。

與傳統利用大量隨機分離群體的QTL定位方法相比，BBSI策略在非生物脅迫耐受性的遺傳分析方面具有四大優勢:首先，BBSI在位點檢測數量、等位基因挖掘和高階上位性檢測能力方面更為高效,利用BBSI總共鑒定出110多個控制非生物脅迫耐受性的QTL(在一個平均群體大小為14的SILs/群體中，平均可以檢測到17.7個QTLs)[57]。其次，通過BBSI可以進一步揭示控制DT、SUT和CT性狀的QTL遺傳網絡，以及對應DT、SUT 和 CT的SILs控制目標性狀 QTL位點的圖形基因型(圖3)。這與對基因位點之間的遺傳關系的認知是一致的，即植物非生物脅迫耐受性涉及許多信號通路和復雜的基因網絡調控。第三，大量遺傳網絡的位點研究表明，親本功能等位基因的遺傳互補性和排斥性解釋了水稻非生物脅迫耐受性的隱蔽多樣性和超親分離(表1)。最重要的是，所鑒定的影響目標性狀的位點的SILs圖形基因型為BBD提供了直接的信息，揭示了每個SILs的目標性狀如何通過檢測到的QTL組合實現目標性狀改良。

3 后基因組時代BBSI的機遇和挑戰

3.1 水稻基因組遺傳多樣性對設計育種的巨大潛在價值

近年來，以“3 000份水稻基因組研究”(3K-RG)為代表的水稻群體基因組研究取得了令人矚目的進展，揭示了水稻種群中具有的豐富遺傳多樣性[11]。這些研究成果在未來育種上的應用潛力反映在兩大方面：其一，水稻種內存在極為豐富的遺傳變異。主要體現在：①3 010份水稻基因組中發現了超過29 M單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)和超過25萬個小插入缺失標記(small insertion and deletion poly-morphisms，Indels)[11]；②在>35 000個水稻基因位點上存在超過255 000個功能等位基因[67]；③>30 000個水稻基因的存在-缺失性變異(presence and absence variation, PAV)[11]；④水稻品種基因組間存在大量微結構變異(缺失、易位、重復和倒位)。其二，水稻種內極大的遺傳變異主要表現在不同地理來源種群間的遺傳差異，如何充分利用種質資源中的有利遺傳變異是未來育種取得突破進展的關鍵[67]。上述變異數據庫的構建最終目的是能夠充分利用這些信息實現設計育種，即利用基因功能及其多樣性的精準信息按照人類的意愿設計、并高效地培育出符合人們各種需求并適應不同生態區域的優質、高產、多抗水稻新品種。毫無疑問，隨著全球水稻功能基因組研究的飛速發展和相關大數據的快速累積，我國水稻育種正在進入基于基因組大數據的分子設計育種時代。

3.2 如何實現精準遺傳變異信息下的復雜性狀高效改良

為了將水稻功能基因組學中所獲得的基礎理論與實際應用緊密結合，我國科學家在實踐BBD理念方面進行了積極地嘗試。李家洋院士團隊在解析理想株型基因IPA1介導的株型發育遺傳調控網絡基礎上，創造性地提出了理想株型塑造與雜種優勢利用相結合的BBD新思路，利用分子標記輔助選擇等方法培育出適宜長江中下游稻區種植的“嘉優中科”系列水稻新品種，在秈-粳亞種間雜種優勢利用與理想株型相結合方面獲得了重要進展[67]；此外，錢前院士團隊通過優良目標基因輔助選擇，以日本晴和93-11為供體，經過8年的雜交、回交和結合分子標記定向選擇，對特青(超高產品質相對較差)進行了改良，獲得了若干份優異后代材料[68]。最近，黃學輝團隊構建了水稻數量性狀基因關鍵變異(causative variation)圖譜，有望為水稻新品種的快速培育提供技術支持[69]。上述研究是我國在水稻分子設計育種方面的重要突破，證實了水稻BBD的概念和前景，但如何克服基因間互作及其與環境互作對復雜農藝性狀的不利影響，將水稻功能基因組和群體基因組的研究成果轉化為對復雜農藝性狀的精準和高效改良，仍是實現以改良復雜農藝性狀為主要目標的設計育種面臨的重大挑戰和科學難題。

BBSI 的最后一步(圖1)是利用從步驟③～⑤中獲得的性狀特異性SILs 及其目標性狀和非目標性狀的表型和遺傳信息，通過DQP選育優良品種，解決基因間的互作問題，在揭示控制復雜性狀的遺傳信息的同時，實現多個復雜性狀的改良。盡管離精準設計的目標還有一定距離，但DQP已逐漸成為未來實現 BBD 的重要策略，被廣泛應用于提高水稻的高產和多種非生物脅迫耐受性[65, 70-71]。根據SILs的表型變異，結合檢測到的控制目標/非目標性狀的QTL/有利等位基因，通過MAS或表型選擇，很容易實現“多供體來源+同一優良遺傳背景”的多目標性狀有利等位基因的聚合。

3.3 后基因組時代BBSI的最佳策略設想

目前，植物育種家面臨的巨大挑戰是育種目標的重大轉變，從強調提高產量到充分利用種質資源以實現可持續的高產穩產。在全球氣候變化導致的日益頻繁和極端的環境威脅下，以及對糧食質量的多樣化要求都增加了滿足未來糧食需求的難度[12]。為了應對這一挑戰，未來的BBD育種技術必需建立在作物功能基因組學和群體基因組學進展所獲得的大量信息基礎上，要達到BBSI的最佳效果，需要注意以下四點：首先，BBSI步驟①～③的主要目的是在優良遺傳背景下選育成百上千的SILs，作為未來BBD的材料平臺。因此，除了選擇對目標環境具有廣泛適應性的“最佳”品種作為RP外，使用200～300個來自世界種質資源中的微核心種質作為供體材料是確保每套優良背景的SILs都包含大量基因位點上的“最佳”等位基因的關鍵，這些基因位點是在目標環境下鑒定的，控制著來自供體基因庫導入的任何有益目標性狀。在進一步BBD過程中，該策略將大大提高供體等位基因的功能(表型)可預測性。其次，需要針對目標性狀進行有效的表型選擇。在第一輪單株選擇中，BC的初始分離群體的大小應在400～600之間，以便在關鍵發育階段施加嚴重(對RP幾乎致命的)脅迫來鑒定優良BC后代(直接與RP比較)。這將提高選擇的準確性，在早期的BC世代，選擇株系的數量減少到一個可管理的大小。然而，作為加速育種過程的一種常見做法，冬季環境是否能夠有效地選擇目標性狀的表型以及如何選擇表型目前尚不清楚。正季和冬季環境的差異如何影響不同目標性狀的基因或QTL表達和選擇效率是未來需要研究的一個問題。第三，除了具有較高的改良性狀能力和效率之外，BBSI與傳統的基因/QTL定位方法相比最大的優勢是目標和非目標性狀的所有遺傳信息(數量、基因組位置以及基因和等位基因的遺傳關系)可以直接適用于實際育種群體，因為所有這些都是在目標遺傳背景和環境中獲得的。與在中國和IRRI成功實施 BBSI 的BC育種部分相比[47-53]，在中國實施大規模的水稻BC育種工作背景下，全面實施BBSI第⑤步進行大規模基因或QTL挖掘以及目標和非目標性狀的等位基因挖掘一直是一項重大挑戰。幸運的是，隨著基因分型的成本快速降低以及水稻群體中各種類型基因組多樣性的公開可用性[11]，預計BBSI策略的這一部分將得到極大的促進和加速[67, 72]。

4 展望

綜前所述，未來兩項重大進展標志著中國水稻育種已準備好進入后基因組時代的分子設計育種。第一，中國多個機構已經選育了30多個優良遺傳背景的數千個性狀特異性SILs，這些SILs包含來自一個微核心種質的各種目標性狀的大量有益遺傳多樣性(未發表數據)；第二，全球主要作物功能和群體基因組研究的進展最終將揭示水稻基因庫中的所有功能變異，這些變異已經或正在被整合到各種數據庫中。此外，利用選擇的SILs和全基因組選擇響應的標記輔助可以很容易地擴展到高效的基因和QTL挖掘，以及利用傳統系譜育種方法選育的育種群體的復雜性狀等位基因挖掘中。后基因組時代下的BBSI育種策略將更加完善和精準，為未來農作物育種創新發展提供重要理論和實踐參考。