Pseudomonas stutzer S12過氧化氫酶基因的表達及酶學特性研究

趙書雪， 劉曉青， 伍寧豐， 田健

(1.河北農業大學食品科技學院，河北 保定071000；2.中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081)

生物體代謝會產生過氧化氫，過氧化氫酶(catalase，CAT)催化過氧化氫分解為水和氧氣，幾乎所有好氧生物體內都通過這一抗氧化反應來保護生物體機能[1]。過氧化氫酶由于其獨特的抗氧化能力在生物[2]、醫學[3]、臨床[4]和食品[5]等方面具有廣泛應用。另外，過氧化氫酶作為過氧化氫消毒的后處理工藝中的重要酶制劑，在機械消毒、紡織漂白[6]和廢水處理[7]方面有著積極作用。此外，過氧化氫酶在畜牧[8]、乳品[9]、食品保鮮[10]等方面也有著廣泛的應用。

商品過氧化氫酶主要來源于動物肝臟[11]和黑曲霉[12]。但是動物肝臟中的過氧化氫酶提取工藝復雜。黑曲霉過氧化氫酶一般通過黑曲霉自身發酵[13]產生，耐堿耐高溫，但一般商業銷售的黑曲霉過氧化氫酶的比活為100 U·mg-1，酶活力不高，且熱穩定性不好。目前研究的過氧化氫酶多為中溫酶，最適溫度是30～50 ℃，比如葡萄球菌[14]、創傷弧菌[15]、地芽孢桿菌屬[16]來源的過氧化氫酶等。中溫酶在低溫或常溫條件下催化效率低，極大限制了其在食品、洗滌、低溫環境修復等產業中的應用。對低溫過氧化氫酶的研究并不多，且熱穩定性不好，嚴重制約了其在生產實踐中的應用，亟待改進。比如Lorentzen等[17]從嗜冷海洋細菌VibriosalmonicidaLFI1238中克隆的過氧化氫酶最適溫度是0～10 ℃，60 ℃處理不到10 min失活；Zeng等[18]從SerratiamarcescensSYBC08分離的過氧化氫酶最適溫度是20 ℃，在60 ℃處理45 min剩余酶活40%；王偉[19]從南極海洋微生物中分離的芽孢桿菌Bacillussp.N2a的過氧化氫酶的最適溫度是25 ℃，在60 ℃處理30 min失活。因此，分離在低溫下具有較高活力且熱穩定性好的過氧化氫酶將能極大的提升其在工業生產中的應用。

垃圾滲濾液包含多種有害化學物質：溶解的有機物、無機鹽、重金屬及作為活性氧(reactive oxygen species，ROS)來源的異生物質有機化合物[20]，例如超氧化物，從而存在多種自由基物質，已經從中篩選到可以降解自由基的菌株，如假單胞菌[21]、擬桿菌屬[22]、雙酶梭狀芽胞桿菌[23]等。而過氧化氫酶是降解自由基的重要酶之一[24]，且垃圾滲濾液屬于城市污水，城市污水的溫度多為15～25 ℃[25]，因此垃圾滲透液是篩選低溫過氧化氫酶的理想來源。本研究從垃圾滲濾液中篩選出一株過氧化氫酶表達量較高的斯氏假單胞菌，并在大腸桿菌中表達其過氧化氫酶基因，酶學性質分析發現，該酶具有低溫性質且熱穩定性較好，為開發新型商品低溫過氧化氫酶提供了新的材料，并為其在低溫行業的應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1菌株和質粒 垃圾滲濾液采自北京北神樹衛生填埋場，從中篩選獲得PseudomonasstutzeriS12菌株，pET30a(+)質粒載體為本實驗室保存，E.coliTOP10克隆菌株、E.coliBL21(DE3)表達菌株購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2工具酶和試劑 限制性內切酶、T4 DNA連接酶購自New England Biolabs (NEB) 公司；TaqDNA聚合酶購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒和質粒小提試劑盒購自Axygen生物技術有限公司；細菌基因組提取試劑盒、普通DNA產物純化試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；BCA蛋白濃度定量試劑盒由江蘇康為世紀生物科技有限公司提供；鎳柱填料購自GE公司；30%過氧化氫購自阿拉丁試劑有限公司；其他試劑均為國產分析純，購自北京化學試劑公司。

1.2 培養基和相關溶液

LB 培養基: 5 g·L-1酵母提取物，10 g·L-1蛋白胨，10 g·L-1NaCl，固體培養基含20 g·L-1瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

過氧化氫底物溶液：首先利用高錳酸鉀滴定法[26]測定30%過氧化氫試劑摩爾濃度，然后用50 mmol·L-1pH 7.4磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液稀釋到25 mmol·L-1，即為過氧化氫底物溶液。

1.3 實驗儀器

PCR儀(Bio-rad公司)、紫外分光光度計(上海尤尼科科技有限公司)、超聲破碎儀(美國Branson公司)。

1.4 試驗方法

1.4.1過氧化氫酶高表達菌株初篩 將垃圾滲濾液用LB液體培養基稀釋20倍，涂布在LB固體培養基，37 ℃培養14～18 h，此時菌株生長完好，從中篩選出26株菌落形態單一的菌株，用6%過氧化氫進行平板檢測，觀察菌株受到過氧化氫刺激而產生氣泡的情況。

1.4.2高過氧化氫酶表達菌株復篩 從垃圾滲濾液中篩選到3個具有過氧化氫酶活性菌株，以1%的接種量接種到5 mL的LB液體培養基中，并對細胞進行超聲破碎，分別測量菌液、發酵液上清、菌體破碎上清的酶活。

1.4.3過氧化氫酶基因克隆 將從垃圾滲濾液中篩選到的具有高過氧化氫酶活性的菌株送到北京奧維森基因科技有限公司進行基因組測序，經過全基因組序列分析獲得該菌株過氧化氫酶基因katE序列信息。通過基因組提取試劑盒提取該菌株的基因組，并以該基因組為模板,用katE基因特異性引物(katE-F: cggatccATGACCGATA-AACCCAAATTGACG；katE-R: cctcgagGACCAGC-GCCTCCGCCAGG)擴增獲得katE基因片段。 PCR反應體系50 μL：基因組 2 μL，2×TaqBuffer 25 μL，katE-F1 μL，katE-R1 μL，dNTP Mix (10 mmol·L-1) 1.0 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1.0 μL，ddH2O到50 μL。 擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，62 ℃(每個循環降低1 ℃)30 s，72 ℃ 1 min，14 個循環；95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32 個循環；72 ℃ 10 min。

1.4.4pET30a-katE重組質粒的構建katE基因擴增片段經BamH I和XhoI酶切后，連接到經同樣酶切的pET30a(+)載體上，構建重組載體。將重組質粒pET30a-katE轉化到E.coliTOP10克隆菌株，經菌液PCR方法挑選陽性克隆子并送北京擎科新業生物技術有限公司測序。序列在NCBI比對分析保守結構域。

1.4.5KatE過氧化氫酶的表達 從E.coliTop10菌株中提取重組質粒pET30a-katE并轉化到E.coliBL21(DE3)表達菌株，添加終濃度為0.336 mmol·L-1IPTG，16 ℃、200 r·min-1誘導18～20 h， 4 ℃、8 000 r·min-1離心5 min，棄上清獲得菌體，用20 mmol·L-1Tris-Cl重懸菌體，用超聲破碎儀進行超聲破碎，10 000 r·min-1離心30 min后取上清，通過鎳柱純化蛋白[27]。

1.4.6KatE過氧化氫酶活力測定 過氧化氫酶活力測定采用分光光度計方法[28]并適當改進。在試管中加入900 μL含25 mmol·L-1過氧化氫底物的50 mmol·L-1pH 7.4的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，35 ℃預熱3 min，加入100 μL酶液，35 ℃反應3 min，加入1 mL的2 mol·L-1硫酸終止反應。在240 nm處檢測過氧化氫的剩余量，過氧化氫的消光系數是43.6 L·mol-1·cm-1。

酶活(U)定義：1 min分解1 μmol過氧化氫需要的酶量。

1.4.7KatE酶學性質的測定 ①最適溫度。 在50 mmol·L-1pH 7.4磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉底物緩沖液下，分別在10、20、30、35、40、50、60、70 ℃下測定KatE的過氧化氫酶活力。

②溫度穩定性。分別將酶蛋白在50、60和70 ℃下處理1、2、3、4、5 h，然后在35 ℃、50 mmol·L-1pH 7.4磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉底物緩沖液下測定KatE的過氧化氫酶活力，以未處理的酶活計為100%，計算熱處理后酶蛋白的相對酶活力。

③最適pH。在35 ℃條件下，分別在pH 5．0～6．0 (50 mmol·L-1磷酸氫二鈉-檸檬酸)、pH 6．0～8．0 (50 mmol·L-1磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉)、pH 8．0 ～ 9．0 (50 mmol·L-1Tris-鹽酸)、pH 9．0～10．0 (50 mmol·L-1甘氨酸-氫氧化鈉)的底物緩沖液下測定KatE的過氧化氫酶活力。

④pH穩定性。將酶蛋白分別在pH 5．0～6．0 (50 mmol·L-1磷酸氫二鈉-檸檬酸)、pH 6．0～8．0 (50 mmol·L-1磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉)，pH 8．0～9. 0 (50 mmol·L-1Tris-鹽酸)、pH 9．0～10．0 (50 mmol·L-1甘氨酸-氫氧化鈉)中4 ℃孵育1 h，然后在35 ℃、50 mmol·L-1pH 8.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉底物緩沖液下測定KatE 的過氧化氫酶活力，以未處理的酶活計為100%，計算pH緩沖液處理后酶蛋白的相對酶活力。

⑤金屬離子對酶活的影響。將0.03 mg·mL-1的酶分別在終濃度1 mmol·L-1的金屬離子Li+、Na+、K+、Ni2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Ba2+、Co2+、Al3+中4 ℃孵育1 h，然后在35 ℃、50 mmol·L-1pH 8.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉底物緩沖液下測定KatE的過氧化氫酶活力，以未處理的酶活計為100%，計算金屬離子溶液處理后酶蛋白的相對酶活力。

⑥動力學參數。以不同濃度的過氧化氫(4.5、6、7.5、9、12、13.15、15、18、24 mmol·L-1)為底物，分別測定不同底物濃度下的過氧化氫的利用速率，采用雙倒數作圖法 (Lineweaver-Burk法)，求該酶的Km值和Vmax值。

2 結果與分析

2.1 高活力過氧化氫酶菌株的篩選

從垃圾滲濾液中篩選到26株細菌，經過平板檢測發現3株菌產生氣泡較多，具有過氧化氫酶活性。對這3株菌進行擴大培養并測量其菌液、發酵液上清、菌體破碎上清的過氧化氫酶酶活，發現1號菌株相對其他菌株具有更高過氧化氫酶酶活，且其過氧化氫酶在胞內表達，結果如圖1所示。經過對1號菌株的16S rDNA分析，發現該菌株與假單胞菌屬的序列相似性為99%以上，因此該菌株是假單胞菌屬。之后結合全基因組分析發現該菌株的全基因組數據與斯氏假單胞菌相似性最高，因此可以判斷該菌株屬于斯氏假單胞菌，并命名該菌株為PseudomonasstutzeriS12。

圖1 從垃圾滲濾液篩選的3個菌株的過氧化氫酶活力

2.2 過氧化氫酶基因katE的序列分析

對上述篩選得到的高過氧化氫酶活性的菌株P.stutzeriS12進行全基因組測序及分析，發現該基因組上具有1個編碼過氧化氫酶的基因katE。該基因編碼486個氨基酸和1個終止密碼子，具有NADPH、血紅素、四聚體結合位點，典型(單功能)血紅素過氧化氫酶，屬于過氧化氫酶中的小亞基酶。

2.3 重組過氧化氫酶KatE的誘導表達

將含有過氧化氫酶基因katE的重組質粒pET30a-katE轉入到E.coliBL21(DE3)表達菌株，誘導表達并通過鎳柱純化獲得目的蛋白，將純化后的酶蛋白進行SDS-PAGE檢測，如圖2所示，純化后的蛋白條帶單一且條帶大小和通過計算得到的62 kD相符合。

圖2 KatE蛋白SDS-PAGE分析

2.4 KatE的酶學性質分析

2.4.1溫度對KatE的酶學性質的影響 從圖3可以看出， KatE的最適溫度為35 ℃，且在10～40 ℃之間酶活力較平穩且高，40 ℃之后，酶活迅速下降，因此KatE在低溫下酶活力較好。在60 ℃保溫2 h后剩余酶活為50%左右，因此該酶熱穩定性較好。

圖3 溫度對KatE活力的影響

2.4.2pH對KatE的酶學性質的硬性 在pH 5.0～12.0范圍內對KatE的過氧化氫酶活力進行測定，結果圖4所示，KatE的最適pH為8.0。且在35 ℃、pH 8.0時KatE酶比活可達到1 349 U·mg-1。將酶液于不同pH緩沖液處理1 h后測定酶的pH穩定性，該酶在pH 7～ 10剩余酶活均在90%以上，說明該酶在堿性條件下比較穩定，且最適pH 8.0下酶最穩定，因此該酶是堿性過氧化氫酶。

圖4 pH對KatE活力的影響

2.4.3金屬離子對KatE的過氧化氫酶活力的影響 測定不同金屬離子對酶活力的影響，結果如圖5所示，1 mmol·L-1Na+、Mg2+對該酶的活性有一定的促進作用，酶活分別提高2%、6%，Li+、K+、Ba2+對該酶的活性抑制作用不明顯，Zn2+、Mn2+、Ca2+、Al3+對酶活有部分抑制作用，Ni2+、Cu2+、Co2+對酶的抑制作用最強，酶活均下降了99%。

圖5 金屬離子對KatE過氧化氫酶活力的作用

2.4.4KatE的動力學參數測定 通過雙倒數作圖法 (Lineweaver-Burk 法)計算該酶Vmax為16 666 μmol·L-1·min-1，Km為100.5 mmol·L-1，kcat為574.05 s-1。如圖6所示，線性擬合較好，R2為0.993 2，因此該數據分析是準確的。

圖6 動力學參數測定

3 討論

斯氏假單胞菌P.stutzeri通常是生物安全級別較高的菌株，對其進行基因挖掘不僅對生物實驗安全有益處，更為以后的產業化生產提供安全基礎。目前對P.stutzeri的研究主要集中于對有機磷農藥的降解[29]、反硝化作用[30]、固氮[31]、降解黃曲霉毒素的作用[32]，但是對于其抗氧化作用目前沒有報道。而過氧化氫酶是生物抗氧化應激的細胞防御機制的重要組成部分，它可以將過氧化氫分解為氧氣和水，具有良好地抗氧化作用[33]。過氧化氫酶在動物、植物、微生物中廣泛存在，細菌、酵母、霉菌中都分離出來不少過氧化氫酶[34]。但是目前沒有關于對斯氏假單胞菌的過氧化氫酶進行體外表達和性質的研究，因此本研究對該層面進行了探究，以此豐富了對斯氏假單胞菌的研究。

本研究從垃圾滲濾液中篩選出一株可表達過氧化氫酶的斯氏假單胞菌P.stutzeriS12，克隆了該菌株的過氧化氫酶katE基因，并對過氧化氫酶KatE的酶學性質進行了研究。結果表明，KatE最適溫度是35 ℃，且在10～40 ℃酶比活較好，因此KatE是偏低溫的中溫酶。在50 ℃處理5 h，該酶酶活仍剩余70%左右，在60 ℃保溫2 h剩余50%左右,其熱穩定性優于一些中溫酶。來自谷氨酸棒桿菌C.glutamicumATCC 13032的過氧化氫酶的最適溫度為30 ℃，60 ℃保溫30 min失活，剩余酶活10%[35]；來自藤黃微球菌M.luteus的過氧化氫酶在60 ℃孵育15 min，剩余酶活70%[36]；兼性嗜冷菌V.rumoiensiss-1T的過氧化氫酶的最適溫度40 ℃，但是在65 ℃保溫10 min后蛋白酶完全失活[36]；該酶的熱穩定性還能與一些高溫酶媲美，來自嗜熱球形脲芽胞桿菌UreibacillusthermosphaericusFZSF03的過氧化氫酶最適溫度為60 ℃，60 ℃熱處理1 h，剩余酶活70%[37]；來自海洋的不動桿菌屬Acinetobactersp. YS0810過氧化氫酶最適溫度是60 ℃，在60 ℃保溫30 min后剩余酶活78%[38]；與粘質沙雷氏菌性質相似的SerratiaSYBC-01 過氧化氫酶的最適溫度70 ℃，60 ℃熱處理1 h，剩余酶活70%[39]。此外，該酶的熱穩定性明顯優于商業過氧化氫酶，比如牛肝過氧化氫酶60 ℃熱處理15 min后剩余酶活僅有 20%[36]，黑曲霉過氧化氫酶在60 ℃熱處理1 h，剩余酶活40%多[40]。可見，本研究中過氧化氫酶KatE具有良好的熱穩定性，有替代商品過氧化氫酶的潛力。此外，該酶在40 ℃之前的酶活力較高且穩定，因此該酶在低溫條件下可能會有較好的應用潛力，對于食品低溫保鮮[41]，全冷鏈行業中過氧化氫消毒的后處理有一定的作用。因此對katE基因的深入研究并寄希望于工業生產中實際應用是后面實驗研究的重點。

金屬離子對蛋白酶的酶比活影響的作用機制目前研究并不完善。本研究發現，大部分金屬離子對KatE的過氧化氫酶活力的抑制作用不明顯，Ni2+、Cu2+、Co2+對酶的抑制作用較為明顯，而Na+、Mg2+對有一定的促進作用。由于KatE的最適pH是8.0，且在堿性條件下比較穩定，因此推測該酶是堿性蛋白酶。因此，Na+提高KatE的過氧化氫酶活性的機理可能是增強了蛋白酶的結構穩定性[42]，而Mg2+提高KatE的過氧化氫酶活性的機理可能是置換了KatE活性中心的金屬離子。Co2+、Cu2+可能是與KatE發生反應，破壞了酶的空間結構，致使KatE失活，而Ni2+的抑制作用可能是氯化鎳與磷酸鹽發生反應生成絡合物從而抑制KatE的酶活。因此在反應中適當地加入Na+、Mg2+可提高酶活力，并避免在體系中混有Co2+、Cu2+、Ni2+而抑制酶活。

在35 ℃、pH 8.0時KatE酶比活可達到1 349 U·mg-1，Vmax為16 666 μmol·L-1·min-1，Km為100.5 mmol·L-1,Kcat是574.05 s-1。而牛肝過氧化氫酶的Km是 49 mmol·L-1，Kcat是68 000 s-1[43]，黑曲霉過氧化氫酶的Vmax是1 500 μmol·mg-1·min-1，Km是27.73 mmol·L-1[33]，UreibacillusthermosphaericusFZSF03過氧化氫酶的Km是101.5 mmol·L-1[28], 因此可以發現，KatE相對于商品過氧化氫酶，對過氧化氫的親和能力不高，對該蛋白進行改造以提高其對過氧化氫的親和能力，提高催化效率是后續實驗研究的重點。

本研究將來源于斯氏假單胞菌的過氧化氫酶進行了異源表達、純化并對其酶學性質進行測定。結果表明，該過氧化氫酶具有較好的中低溫環境適應性，熱穩定性較好，在冷鏈消毒和食品保鮮方面有較好的應用前景。但該過氧化氫酶的過氧化氫的親和能力不高，今后有望通過理性設計和定向進化等分子改造手段進一步提高過氧化氫酶的催化效率。