乳源蠟樣芽胞桿菌耐藥性、毒力因子檢測及分子特征研究

郭佳， 王娉， 周繼福,3， 趙曉美， 劉繼鋒， 陳穎*

(1．天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457； 2．中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；3．南京財經大學食品科學與工程學院，南京 210023)

蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)是一種革蘭氏陽性桿菌，廣泛存在于自然界和動物腸道中，好氧、產芽胞，在8～55 ℃環境下均可生長，28～35 ℃是其最適生長溫度[1]，因此容易在食品生產、運輸和銷售等環節繁殖而污染食品[2-4]。近10年來，每年都有由于蠟樣芽胞桿菌污染導致的食物中毒事件發生[5-7]。而乳制品中的污染情況也比較突出，對10年內我國吉、閩、陜三省乳品企業乳與乳制品中蠟樣芽孢桿菌的污染情況進行調查與鑒定[8-11]，結果顯示，吉林省乳制品中蠟樣芽孢桿菌的檢出率為32.90%，其中長春市檢出率高達73.33%；福建省部分地區嬰幼兒奶粉檢出率也達到52.78%；陜西省乳與乳制品中的檢出率為20.00%。謝愛蓉等[12]對溫州市市售乳粉中蠟樣芽胞桿菌的污染情況及分離株的毒力基因進行研究，蠟樣芽胞桿菌檢出率為19.00%，主要的腸毒素毒力基因為nhe基因與entFM基因。Dosanjos等[13]對巴西75份乳飲品進行微生物學檢測，羊奶、豆奶和羊奶飲料的蠟樣芽胞桿菌檢出率分別為16%、52%和44%。由此表明，乳品中蠟樣芽胞桿菌污染具有普遍性。蠟樣芽孢桿菌可引起食物中毒，癥狀主要有腹瀉和嘔吐。蠟樣芽胞桿菌引起食物中毒的主要成分是其產生的兩種腸毒素——嘔吐毒素和腹瀉毒素，這兩種毒素能夠引起嘔吐型和腹瀉型食物中毒，嚴重者可能導致敗血癥、創傷、肺部感染和心內膜炎等[14]。蠟樣芽孢桿菌含有多種毒力基因可轉錄翻譯成腸毒素，包括溶血素BL基因(hblA、hblC、hblD)、非溶血腸毒素基因(nheA、nheB、nheC)、細胞毒素K基因(cytK)[15]、腸毒素基因(bceT和entFM)和嘔吐毒素基因(ces和EM1)。其中，毒力最強的是引起嘔吐的毒素基因ces和EM1[16-17]。

目前，臨床主要采用抗生素治療蠟樣芽孢桿菌引發的食物中毒，但隨著藥物的濫用和耐藥元件的轉移，蠟樣芽孢桿菌對常見抗生素的耐藥性不斷增強。CLSI 標準M45-a2[18](苛養菌少見菌藥敏判斷標準)中推薦的蠟樣芽孢桿菌藥敏試驗抗生素分為β-酰胺類和非β-酰胺類。由于蠟樣芽孢桿菌可以產生β-酰胺酶，因此，對β-酰胺類抗生素表現出高度耐藥[19]。本研究主要選擇9種非β-酰胺類抗生素(包括治療蠟樣芽胞桿菌感染的推薦用藥)，對乳及乳制品來源的122株蠟樣芽孢桿菌進行藥物敏感性檢測，分析其主要毒力基因；并使用脈沖場凝膠電泳(PFGE)對蠟樣芽孢桿菌進行分型，以掌握原料乳及乳粉來源蠟樣芽孢桿菌的流行病學特征，為蠟樣芽孢桿菌引起的食源性疾病的預警、預防和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

蠟樣芽孢桿菌ATCC 11778、ATCC 29213及沙門氏菌H9812為本實驗室保存。122株蠟樣芽孢桿菌分離株均分離自原料乳及乳粉(來自于北京、河北及內蒙古)，其中，49株為2019年原料乳分離株；25株為2016年乳粉分離株；37株為2017年乳粉分離株；11株為2018年乳粉分離株。均采用GB 4789.14—2014《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 蠟樣芽胞桿菌檢驗》進行鑒定。

1.2 培養基和試劑

甘露醇卵黃多粘菌素(MYP)瓊脂、多粘菌素B，胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)和胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養基購于北京陸橋技術股份有限公司；水解酪蛋白瓊脂(MHA)培養基購于英國OXOID公司；dNTPs、ExTaq酶、10×ExTaq緩沖液、溴化乙錠、DL2000 DNA 標記分子購于大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖(invitrogen)、哥倫比亞血瓊脂平板、慶大霉素(gentamicin，10 μg)、四環素(tetracycline，30 μg)、紅霉素(erythromycin，15 μg)、氯霉素(chloramphenicol，30 μg)、阿米卡星(amikacin，30 μg)、環丙沙星(ciprofloxacin，5 μg)、克林霉素(clindamycin，2 μg)、復方新諾明(trimethoprim-sulfamethoxazole，1.25/23.75 μg)、利福平(rifampin，5 μg)購于英國Oxiod公司；MicrobankTM菌種保存管購于加拿大PRO-LAB公司；氯化鈉、DNA提取試劑盒來自于天根生化科技有限公司；限制性核酸內切酶XpaⅠ(15 U·μmol-1)、NotⅠ(15 U·μmol-1)、溶菌酶(15 U·μmol-1)來自于Takara公司；5×TBE、EDTA、Tris-HCl來自于索萊寶公司；Gel Red核酸染液來自于美國Biotium公司；引物由生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 主要儀器和設備

PCR擴增儀(Veriti 96 Well Thermal Cycler)，美國AB公司；離心機(5804R)，德國Eppendorf公司；電泳儀(MODEL 200/2.0 POWER SUPPLY)，分子凝膠成像儀(VersaDoc)，PFGE凝膠電泳儀(CHEF MAPPER)，美國BIO-RAD公司；數顯拍擊式均質機，法國Interscience公司；全自動微生物鑒定/藥敏系統(BD PhoenixTM-100)，美國BD公司；核酸蛋白分析儀(DU640)，德國Beckman公司。

1.4 毒力基因的檢測

使用DNA提取試劑盒提取蠟樣芽孢桿菌的基因組DNA，并用核酸蛋白分析儀對提取的細菌DNA濃度進行測定后，將DNA稀釋至20 μg·mL-1作為PCR擴增反應的DNA模板，在-20 ℃下保存備用。對蠟樣芽孢桿菌的11個毒力相關基因(hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、entFM、cytK、bceT、ces、EMl)進行PCR擴增。PCR反應體系(25 μL)為：模板2 μL，引物各1 μL(引物序列見表1)，dNTPs 2 μL，10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus)2.5 μL，ExTaq(5 U·μL-1)0.3 μL，ddH2O補齊至25 μL。擴增條件為：95 ℃，10 min；95 ℃，30 s，56 ℃，30 s，72 ℃，30 s，30個循環；72 ℃，10 min。PCR產物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 蠟樣芽孢桿菌11個毒力基因的引物序列

1.5 蠟樣芽胞桿菌藥物敏感性分析

蠟樣芽孢桿菌的藥物敏感性檢測按照世界衛生組織(WHO)推薦的K-B法進行藥物敏感實驗，參照美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)2020版[22]標準分為敏感(sensitivity，S)、耐藥(resistance，R)和中介(intermediary，I)。

1.6 脈沖凝膠電泳(pulsed-field gel electropho-resis，PFGE)分型分析

根據蠟樣芽孢桿菌PFGE規范[23]進行操作，將細菌包埋至膠塊中，使用苯丁酸氮芥(chlorambucil，CLB)對細菌進行裂解。裂解后對膠塊進行清洗、保存。然后對膠塊內DNA進行酶切并加樣、電泳。最后對電泳膠進行染色、脫色、拍照，使用BioNumerics 6.6軟件對蠟樣芽孢桿菌進行聚類分析。采用非加權平均法構建聚類圖，條帶位置差異容許度1.5%，使用Dice系數衡量圖形之間的相似度。

1.7 數據分析

使用BioNumerics 6.6軟件進行聚類分析，使用Origin.2018繪制圖，使用Excel.365繪制表格。

2 結果分析

2.1 毒力基因攜帶情況

對122株乳品來源的蠟樣芽孢桿菌攜帶的主要毒力因子進行分析，結果(表2)表明，122株蠟樣芽孢桿菌都攜帶nheA、nheB和entFM基因； 99.90%的蠟樣芽孢桿菌都攜帶4個及以上毒力因子。99.18%的蠟樣芽孢桿菌攜帶nheC基因；37.70%的蠟樣芽孢桿菌攜帶bceT基因；31.15%的蠟樣芽孢桿菌攜帶cytK基因；29.51%的蠟樣芽孢桿菌攜帶hblA基因；24.59%的蠟樣芽孢桿菌攜帶hblC基因；8.20%的蠟樣芽孢桿菌攜帶hblD基因；6.56%的蠟樣芽孢桿菌攜帶ces基因；6.56%的蠟樣芽孢桿菌攜帶EM1基因。

表2 蠟樣芽孢桿菌攜帶的毒力因子

2.2 蠟樣芽胞桿菌分離株的耐藥性

122株蠟樣芽胞桿菌對9種非β-酰胺類抗生素的藥物耐受性進行檢測，結果(圖1)表明，122株蠟樣芽胞桿菌均對氯霉素、慶大霉素、阿米卡星敏感；40株對利福平敏感；77株對利福平中介，中介率為63.11%；7株對紅霉素中介，中介率為5.74%；6株對克林霉素中介，中介率為4.92%；3株對復方新諾明中介，中介率為2.46%；1株對環丙沙星中介；1株對四環素中介；12株對復方新諾明耐藥，耐藥率為9.84%；10株對四環素耐藥，耐藥率為8.20%；5株對利福平耐藥，耐藥率為4.10%。122株蠟樣芽孢桿菌中耐藥比例為16.40%，其中，13株為單重耐藥株，7株為二重耐藥株，無多重耐藥株。耐藥譜型共6種，分別為：四環素、復方新諾明、利福平、四環素-復方新諾明、四環素-利福平、復方新諾明-利福平。流行的耐藥譜為復方新諾明和四環素-復方新諾明，分別占耐藥株的30%和25%，四環素-利福平耐藥株和復方新諾明-利福平耐藥株的比例為2%。

圖1 蠟樣芽孢桿菌對不同抗生素藥物敏感情況

2.3 蠟樣芽胞桿菌分離株的PFGE分子分型分析

使用NotⅠ對122株乳品來源的分離株進行酶切，PFGE分型后得到15個簇、106個帶型，相似性在13.1%～100.0%，呈現出較高的基因多態性(圖2)。每個帶型包含1～3株菌，未發現絕對優勢帶型，說明乳品中蠟樣芽胞桿菌的污染來源廣泛，未發現分離基質、分離時間與帶型之間的相關性。其中13個帶型包含菌株多于1株，其余93個帶型均只包含1株菌。相似性98%以上菌株大多為同一地區來源樣品中分離得到，其中包括64402、64403，62702、62712，66012、66013，63101、63103、63113，65102、65103、65111，62801、62802，65301、65303，003311、003323，21769、21772，003222、003224等菌株。

圖2 122 株蠟樣芽孢桿菌PFGE分子分型

3 討論

自蠟樣芽胞桿菌被報道可引起食物中毒以來，由其引起的感染事件呈逐年上升趨勢。近年來，蠟樣芽胞桿菌除可引起暴發性食物中毒外，還可引起胃腸外感染。蠟樣芽孢桿菌的致病性與其攜帶的毒力基因直接相關。食物中毒者產生的腹瀉癥狀主要由溶血型腸毒素基因hbl、非溶血型腸毒素基因nhe、細胞毒素基因cytK、腸毒素FM基因(entFM)和腸毒素T基因(bceT)所導致。溶血型腸毒素由亞基L1、L2及亞基B組成，分別由hblA、hblC、hblD三個基因控制合成；作用于細胞膜，并可與紅細胞結合，形成復合體，從而導致細胞裂解。本研究中有67株蠟樣芽孢桿菌不攜帶hbl基因；55株蠟樣芽孢桿菌分別攜帶hblA、hblC、hblA-hblC、hblC-hblD或hblA-hblC-hblD。Hbl通過3個亞基依次與細胞膜進行結合后才能破壞細胞膜導致細胞裂解。因此，包含hblA、hblC、hblD三個毒力基因并表達的蠟樣芽孢桿菌才能產生Hbl，本研究中有5株蠟樣芽孢桿菌同時具有這三種毒力基因。非溶血性腸毒素Nhe的三個亞基蛋白由nheA、nheB和nheC編碼；三個亞基蛋白中，NheB對Nhe的毒性起著關鍵性的作用，而NheC過量則會對Nhe的毒性起抑制作用，但三者同時存在并表達時毒性最大。本研究的122株蠟樣芽孢桿菌均檢測到nheB基因，99%的菌株同時攜帶nheA、nheB和nheC基因；且發現5株蠟樣芽孢桿菌同時攜帶nhe三個毒力基因和hbl三個毒力基因。除nhe和hbl基因外，所有菌株均攜帶entFM基因。有40株菌株攜帶bceT基因；有31株攜帶cytK基因。由此表明，nhe、entFM、hbl、bceT和cytK基因的檢出率偏高，是我國食源性蠟樣芽孢桿菌的主要毒力因子，與前人研究結果基本一致[24-26]。

遺傳、環境等因素會造成細菌變異，蠟樣芽胞桿菌也不例外。養殖過程長期使用抗生素會逐漸降低蠟樣芽胞桿菌對藥物的敏感性，使菌株產生耐藥性。因此，研究蠟樣芽胞桿菌菌株的耐藥性具有重要意義。細菌對抗生素的耐藥性主要和靶基因突變及對外界的抗逆性有關，與產生毒素的毒力基因關系較小。目前，由于蠟樣芽孢桿菌對大部分β-酰胺類藥物均有耐性，因此對其感染的推薦用藥多為非β-酰胺類。本研究表明，分離得到的122株蠟樣芽胞桿菌對氯霉素、慶大霉素、阿米卡星的敏感性均達到100%；對紅霉素未出現耐藥菌株，但已有部分中介菌株。由此可見，氯霉素、慶大霉素、阿米卡星和紅霉素仍然可作為臨床治療推薦用藥，但應警惕紅霉素耐藥蠟樣芽孢桿菌的出現。四環素類抗生素在乳制品中的最大殘留量為100 μg·kg-1[27]。常見致病菌多對四環素類抗生素產生耐藥性，因此，目前四環素類抗生素僅用于支原體、衣原體、立克次體及軍團菌的感染。本研究中約9%的菌株對四環素和復方新諾明表現出一定程度的耐藥性，與Fei等[28]研究結果相比，本研究分離的蠟樣芽孢桿菌對四環素的耐藥性顯著提高。因此，在臨床用藥方面應減少四環素的使用，且針對蠟樣芽孢桿菌感染的治療還應盡量避免β-內酰胺類抗生素、利福平及四環素類抗生素，可選用氯霉素類、氨基糖苷類和喹諾酮類抗生素。