異氰酸苯酯誘導的類膠原多肽自組裝

王苗，鄭虹寧，許菲

江南大學生物工程學院，糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122

1 引言

目前，分子自組裝是制造多功能納米器件最有效的方法之一1。然而，如何進行合理設計，使合成材料能夠自組裝形成超分子聚集體是分子自組裝面臨的挑戰。體內的生物大分子通常是在納米尺度范圍內運作，創造出復雜的超分子機制，進行與細胞代謝、通訊以及分化相關的化學、電學以及機械功能2。而這些復雜的生物機器的產生基礎是生物大分子在分子水平上編程形成特殊自組裝結構。因此，學習和利用生物系統中自然存在的結構原理，基于序列間的關系在體外設計和構建多種仿生納米材料是人類理解天然自組裝機制的基礎。

在分子尺度上操控生物大分子是納米制造的重要手段。在體外，如核酸3，多肽4-8以及蛋白9等天然生物大分子已經用于復雜生物材料的開發。相比于復雜精巧的核酸自組裝設計，多肽分子間作用力種類繁多，增加了其自組裝設計的難度。膠原蛋白是動物體內含量最高的蛋白質，也是生物醫用材料領域最常用的天然高分子之一。目前，在生物體內發現共有29種類型的膠原蛋白，不同類型的膠原蛋白的拓撲結構從納米纖維束到網絡結構等不盡相同10,11。其中II型膠原和III型膠原在體內主要以膠原纖維束的形式存在。膠原蛋白由三條肽鏈扭轉形成三股螺旋的二級結構，其中每一條肽鏈均由氨基酸三重子Gly-Xaa-Yaa的重復序列組成，Xaa通常為Pro (脯胺酸)，Yaa通常為Hyp((2S,4R)-4-羥脯氨酸)。目前天然膠原蛋白被廣泛應用于生物醫用材料，但是該類材料具有高致敏性、易被動物源所帶有的疾病如朊蛋白污染等生物風險。化學合成的類膠原多肽來源清潔、可編程性高，是理想的納米生物基底材料。

目前，基于對同源膠原多肽設計組裝已有一些報道。該設計以高脯氨酸序列，(POG)n或(PPG)n為主體，插入如Cys、Asp、Lys、Phe、His等帶有特定功能基團的氨基酸，依靠半胱氨酸之間二硫鍵12，靜電引力13,14，π–π堆疊15,16，金屬配位誘導17–20等，使其自發或可控觸發自組裝形成結構特異的組裝體，從而進一步形成結構復雜多變的生物納米材料。非脯氨酸氨基酸的引入會導致膠原三股螺旋熱穩定性下降，限制了其作為納米材料的應用范圍。為了提高膠原三股螺旋穩定性，可以在膠原序列中插入非天然氨基酸。比如，在類膠原多肽中嵌插Gly-Nleu-Pro、Gly-Pro-Nleu以及Gly-Pro-FPro三重子可以有效提高類膠原多肽三股螺旋穩定性(Nleu：N-異丁基甘氨酸；FPro：反式-4-氟脯氨酸)21,22。

類比上述基于單一非共價作用設計的類膠原多肽材料的自組裝，Luo和Tong23利用在類膠原多肽N端設計β-片層和長鏈烷烴，利用β-片層形成氫鍵作用力和長鏈烷烴疏水作用力協同誘發類膠原多肽的組裝形成了膠原蛋白水凝膠。由于其在類膠原多肽N端修飾的分子結構較大，化學合成過程復雜。本文采用簡單有機小分子修飾類膠原多肽末端促進類膠原多肽自組裝。首先，選取自身不易形成膠原蛋白三股螺旋結構的多肽(POG)6為目標序列24，以此來探索有機小分子修飾對類膠原多肽折疊與自組裝的影響。4,4’-亞甲基雙(異氰酸苯酯)分子已被成功的用于設計組裝二維(2D)有機納米材料25。因此，我們試圖將4,4’-亞甲基雙(異氰酸苯酯)分子設計在類膠原多肽(POG)6以及(POG)8的末端，以弱相互作用力協同方式提高類膠原多肽三股螺旋的熱穩定性并誘發三股螺旋分子間的高聚自組裝。實驗過程分別利用質譜和液相色譜對修飾的類膠原雜合肽進行驗證。利用圓二色譜對類膠原雜合肽的折疊進行表征。隨后，利用納米粒度儀表征可溶性組裝體的粒徑分布。最后，利用透射電鏡和原子力顯微鏡表征了類膠原雜合肽高聚自組裝的形貌，并進一步推測了其組裝機理。

2 實驗部分

2.1 實驗材料

Fmoc-Gly-Wang樹脂，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Pro-OH和Fmoc-Hyp-OH,O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，N,N-二異丙基乙胺(DIEA)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(純度≥ 99.5%)，乙腈(ACN)(純度≥ 99.8%)，二氯甲烷(CH2Cl2)(純度≥99.5%)，甲醇(CH3OH)(純度≥ 99.8%)，二甲基亞砜(DMSO)(純度≥ 99.0%)，三氟乙酸(TFA)(阿拉丁，純度≥ 99.5%)，1,5-萘二異氰酸酯(阿拉丁，純度≥ 98.0%)，4,4’-亞甲基雙(異氰酸苯酯)(安耐吉化學，純度≥ 97.0%)，三異丙基硅烷(TIS)(純度99.0%)，哌啶(純度≥ 99.0%)。

2.2 實驗方法

2.2.1 類膠原多肽的合成

采用多肽固相合成法26–29，具體步驟如下：(1)溶脹樹脂：合成0.1 mmol多肽，取0.3 g Fmoc-Gly-Wang樹脂溶于6 mL DMF溶脹6 h后除去DMF。(2)脫Fmoc保護：用4 mL 20%哌啶/80% DMF(體積比)溶液室溫下攪拌15 min，脫保護2次。脫保護后都使用DMF、CH2Cl2各洗滌3次。(3)氨基酸縮合：加入含0.5 mmol Hyp，0.5 mmol HBtu和1 mmol DIEA的DMF 6 mL室溫下攪拌2–3 h，抽干洗滌3次。(4)茚三酮檢測：若樹脂呈藍色則重復步驟(3)，若樹脂透明則反應完全連接下一個氨基酸，直到連上最后一個氨基酸后脫保護2次。分別用DMF、CH2Cl2和CH3OH洗滌3次。(5)切割多肽：將合成的(POG)6和(POG)8取少量，與95% TFA/2.5% TIS/2.5%水(體積比)切割液5 mL混勻后加入圓底燒瓶，用帶孔橡膠塞塞住瓶口，置于磁力攪拌器上裂解1–2 h。脫脂棉過濾除去樹脂顆粒，加入冷乙醚沉淀，離心三次棄上清。將得到的沉淀物加水溶解，凍干得到樣品粉末。

2.2.2 類膠原雜合肽的合成

在確定原料肽合成正確的基礎上，采用化學合成法合成類膠原多肽雜合分子25,30。將連在Wang樹脂上的(POG)6與有機分子以4 : 3的摩爾比在DMSO (6–7 mL)中進行化學合成反應。將連在Wang樹脂(POG)8與有機分子以4 : 3的摩爾比在DMF (6–7 mL)和DIEA (與多肽等摩爾量)反應，室溫攪拌24–48 h。反應后分別用DMF、CH2Cl2、甲醇各洗滌3次抽干。將反應完成后的雜合肽樹脂用切割液裂解1–2 h。冷乙醚沉淀后凍干得到樣品粉末。類膠原多肽雜合分子合成路線如圖1所示。

圖1 類膠原雜合分子合成路線圖Fig. 1 Synthesis scheme of collagen-like hybrid peptides.

2.2.3 反相高效液相色譜

采用高效液相色譜(RP-HPLC)半制備(Waters 1525；Eclipse XDB-C18 9.4 mm × 250 mm × 5 μm)對粗肽進行制備。將制備得到的肽通過分析型反相高效液相色譜(1260；EC-C18，2.1 mm × 100 mm ×2.7 μm)進行純度檢驗。流動相A液：1 L超純水中加入1 mL三氟乙酸(TFA)。流動相B液：1 L乙腈(ACN)中加入1 mL三氟乙酸(TFA)。紫外檢測220 nm處吸收峰。柱溫控制在50 °C。

2.2.4 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜

采用質譜儀MALDI-TOF-MS (ultrafleXtreme)(布魯克，美國)對樣品進行分子量鑒定。取少量粉末樣品加水溶解，基質為無Na的DHB (2,5-二羥基苯甲酸)溶液。1 μL樣品點在靶板上，待樣品晾干后再點1μL基質。基質干燥結晶后即可進靶。開始之前先使用多肽標準品進行校準。所用模式為RP700-3500。

2.2.5 樣品處理

將從高效液相色譜半制備純化得到純度較高的樣品凍干后使用超純水溶解，然后轉移到Float-A-LyzerG2透析管(允許透過分子量1000 g?mol?1)中，使用超純水透析24 h除鹽。透析后的樣品凍干后置于?20 °C保存。

2.2.6 圓二色譜(CD)

采用圓二色譜儀Chirascan (應用光物理，英國)對合成純化后的多肽進行二級結構表征。將樣品溶解在10 mmol?L?1的磷酸鹽(PB)緩沖液(pH =7)中，配制成終濃度為0.2 mmol?L?1的體系，置于4 °C孵育24 h。使用光學匹配的1 mm的石英比色皿在CD控溫4 °C下進行掃描。波長范圍為190–280 nm，間隔為1 nm，掃描速度2 snm?1得到全波長曲線。通過對225 nm處進行監測，從4到80 °C，平衡時間為6 min，每步1 °C記錄一次數據，每次每個樣品掃描時間為5 s，得到膠原熱變圖。擬合熱變曲線，將溶液在4和80 °C所對應的吸光值取平均值，平均吸光值所對應的溫度即為熔融溫度(Tm)，該數據表征膠原的熱穩定性。

2.2.7 動態光散射(DLS)

采用納米粒度儀Zetasizer Nano ZS測量樣品的水力學半徑。將樣品溶解在10 mmol?L?1PB (pH =7)緩沖液中，配置成終濃度為0.2 mmol?L?1的體系。樣品退火至4 °C，然后在4 °C孵育24 h。使用光學匹配的石英比色皿ZEN2112，在DLS控溫25 °C下進行測量，平行3次取平均值。

2.2.8 原子力顯微鏡(AFM)

采用原子力顯微鏡Multimode-8 (布魯克，美國)進行樣品自組裝后的形貌表征。將樣品溶解在10 mmol?L?1PB (pH = 7)緩沖液中，配置成濃度為2 mmol?L?1的體系。樣品退火至4 °C，然后在4 °C孵育9天。AFM制樣方法：取5 μL自組裝的樣品滴到干凈平整的云母片上表面，待完全晾干后加200 μL超純水沖洗云母表面，吹干云母片表面。采用Scanasyst Air模式進行圖像掃描，探針為 SNL-10。

2.2.9 透射電鏡(TEM)

采用透射電鏡HT-7700 (100 KV，日立，日本)對自組裝后的樣品進行形貌表征。將樣品溶解在10 mmol?L?1PB (pH = 7)緩沖液中，配置成濃度為2 mmol?L?1的體系。樣品退火至4 °C，然后在4 °C孵育9天。TEM制樣方法：取5 μL自組裝后的樣品吸附在親水處理后的銅網(300目碳支持膜，中鏡科儀)上，室溫下吸附45 s，濾紙吸走后再水洗，用10 μL 2%醋酸鈾染色45 s，待銅網完全干燥后對樣品形貌進行透射電鏡表征。

3 結果與討論

3.1 類膠原雜合肽的結構設計

如圖2所示，組裝分子分別由類膠原多肽、酰胺鍵、芳香族和氨基四部分組成。在設計的類膠原雜合肽中，芳香基團提供的π–π堆積旨在加強分子之間的作用力；酰胺鍵間隔用于連接類膠原多肽與芳香族基團以及提供的氫鍵作用力；氨基提供氫鍵作用力。本研究中，選取了自身不能形成三股螺旋的類膠原多肽(POG)6序列為膠原部分24。將(POG)6的氮端通過酰胺鍵與含有苯環的4,4’-亞甲基雙(異氰酸苯酯)分子連接得到AP6。研究修飾在末端的4,4’-亞甲基雙(異氰酸苯酯)分子是否能夠促進(POG)6的折疊以及能否進一步促進高聚組裝。近而又選取了自身可形成三股螺旋的(POG)8序列為研究對象，將其N端修飾4,4’-亞甲基雙(異氰酸苯酯)得到AP8，研究對已折疊的膠原三股螺旋能否更有效的促進高聚自組裝。

圖2 分子設計圖解以及分子結構圖Fig. 2 Illustration and Structure of the molecular design.

與此同時，選取了4,4’-亞甲基雙(異氰酸苯酯)分子的類似物1,5-萘二異氰酸酯修飾(POG)6和(POG)8氮端分別得到AnP6和AnP8。雖然4,4’-亞甲基雙(異氰酸苯酯)和1,5-萘二異氰酸酯都含有兩個芳環，但是1,5-萘二異氰酸酯中萘基團剛性較強，旨在研究有機分子剛性是否會影響類膠原多肽的折疊與組裝。文中用到的多肽序列如表1所示。

表1 類膠原多肽分子序列Table 1 Molecular Sequence of Collagen-like Peptides.

3.2 類膠原雜合肽的純度檢驗和分子質量鑒定

將純化獲得的類膠原雜合肽通過高效液相色譜表征純度。通過質譜進行分子量鑒定，實驗結果與理論相符(圖3)。AP6，Mw = 1846.05 g?mol?1，m/z= 1885.0 g?mol?1(M + K)+。AP8，Mw = 2380.25 g?mol?1，m/z= 2419.25 g?mol?1(M + K)+。AnP6，Mw = 1805.99 g?mol?1，m/z= 1828.99 g?mol?1(M +Na)+。AnP8，Mw =2340.19 g?mol?1，m/z= 2379.19 g?mol?1(M + K)+。

圖3 類膠原雜合肽RP-HPLC及MALDI-TOF分析圖Fig. 3 RP-HPLC and MALDI-TOF spectra of Collagen-like hybrid Peptides.

3.3 圓二色譜表征三股螺旋的熱穩定性

通過圓二色譜(CD)測定AP6、AP8、AnP6和AnP8的全波長吸收和熱變曲線，研究4,4’-亞甲基雙(異氰酸苯酯)和1,5-萘二異氰酸酯對類膠原多肽折疊的影響。膠原蛋白三股螺旋的特征吸收峰在225 nm附近31,32。如圖4a全波長圖黑色實線所示，(POG)6三聚體在225 nm處呈現微弱的吸收峰。相應的，圖4b的熱變實驗中沒有形成反S曲線，說明沒有形成穩三股螺旋結構。AP6三聚體的全波長CD圖如圖4a中橘黃色實線所示，MRE值大約為4，Tm值約為25.2 °C。這說明4,4’-亞甲基雙(異氰酸苯酯)分子能誘導原本不能折疊的(POG)6形成穩定的三股螺旋結構。

圖4 類膠原雜合肽CD全波長與熱變光譜圖Fig. 4 Full-wavelength scans and thermal unfolding profile of collagen-like hybrid peptidesmonitored by CD.

如圖4a，b所示，(POG)8三聚體225 nm處吸收值為3.9，Tm值約為37.7 °C，與已報道的數據相吻合24。與(POG)8三聚體相比，AP8三聚體的MRE值提高了約1個單位，Tm值提高了約21 °C，對于自身可形成三股螺旋結構的(POG)8來說，4,4’-亞甲基雙(異氰酸苯酯)顯著提高了其三股螺旋結構的熱穩定性。

為了驗證4,4’-亞甲基雙(異氰酸苯酯)分子可高效的促進類膠原多肽的分子內自組裝，我們將4,4’-亞甲基雙(異氰酸苯酯)分子替換成作用力較弱的1,5-萘二異氰酸酯分子修飾在(POG)6和(POG)8的N端得到AnP6和AnP8。同樣，如圖4c，d通過圓二色譜測定AnP6、AnP8的全波長吸收和熱變曲線，研究1,5-萘二異氰酸酯分子對(POG)6和(POG)8折疊的影響。AnP6的MRE值低，熱變曲線不是典型的反S型，說明其沒有促進(POG)6形成三股螺旋。AnP8的MRE值低于(POG)8，但是其Tm值略微高于(POG)8，這表明1,5-萘二異氰酸酯分子在一定程度上可以促進(POG)8的折疊。

3.4 動態光散射表征可溶性自組裝體的粒徑分布

利用動態光散射(DLS)對各樣品中可溶性的自組裝體的粒徑和粒徑分布進行檢測。如圖5a所示，(POG)6粒徑大小在分布在1 nm左右，(POG)8粒徑大小分布在3 nm左右，這與CD結果(POG)6沒有形成三股螺旋結構，而(POG)8形成了三股螺旋結構一致33,34。AP6和AP8的粒徑大小約7–8 nm (圖5a)，AnP6和AnP8粒徑大小約3–4 nm (圖5b)。結果表明，AP6和AP8與(POG)6和(POG)8相比能夠形成粒徑較大納米結構，而AnP6和AnP8粒徑大小與(POG)6和(POG)8無較大變化。

圖5 類膠原雜合肽粒徑分布圖Fig. 5 Size distributions of collagen-like hybrid peptides.

3.5 電子顯微鏡表征自組裝形貌

通過原子力顯微鏡(AFM)和透射電鏡(TEM)進一步表征了類膠原雜合肽三股螺旋分子間的高聚自組裝形貌。經AFM表征，AP6形成了寬度約12 nm、高度約為2 nm的纖維結構(圖6a，b)，相應的，TEM表征也顯示了類似的納米纖維結構(圖6e)。同樣，AP8形成了寬度約16 nm、高度約為5 nm的纖維結構(圖6c，d，f)。在相同組裝條件下，AnP6和AnP8則沒有形成任何納米結構，如圖7a，b AFM圖所示。

圖6 類膠原雜合肽AP6和AP8自組裝圖Fig. 6 Collagen-like hybrid peptides self-assembly of AP6 and AP8.

圖7 類膠原雜合肽AnP6和AnP8的AFM表征圖Fig. 7 AFM images ofcollagen-like hybrid peptides.

3.6 自組裝機理

本研究通過對原料肽(POG)6和(POG)8進行N端修飾有機小分子4,4’-亞甲基雙(異氰酸苯酯)得到雜合肽AP6和AP8，其形成了高穩定性的膠原三股螺旋結構，并進一步高聚自組裝形成納米纖維結構。與4,4’-亞甲基雙(異氰酸苯酯)相比較，剛性更強的類似物4,4’-亞甲基雙(異氰酸苯酯)修飾多肽N端得到的雜合肽AnP6和AnP8則沒有形成高聚自組裝。我們通過PyMOL軟件得到如下分子結構模型來對膠原纖維的形成機理進行研究。AP6三股螺旋的理論長度約6.6 nm。實驗測得AP6形成的納米纖維寬度約12 nm。AP8的三股螺旋理論長度約為8.4 nm。實驗測得AP8形成的納米纖維寬度約16 nm。如圖8所示，AP6和AP8納米纖維寬度均為未進行N端修飾的多肽長度的兩倍，這說明可能氮端的4,4’-亞甲基雙(異氰酸苯酯)分子通過多重若作用力誘導膠原三股螺旋結構進行N端對N端的排列，從而進一步形成納米纖維結構。

圖8 類膠原雜合肽組裝機理Fig. 8 Assembly mechanism of collagen-like hybrid peptide.

4 結論

在過去二十年，基于溶液自組裝，依據自下而上設計原則制備出了多種維度納米材料。膠原蛋白在體內呈現多種形態分布，但是纖維狀結構形式占據了90%。然而，高聚脯氨酸帶來了膠原蛋白結構穩定性的同時也帶來了不易功能化的缺點。近年來，研究者通過在(POG)n序列引入功能側鏈氨基酸實現類膠原多肽高聚。比如可在其中部嵌插Cys，利用Cys分子之間形成二硫鍵組裝得到纖維結構12；在(POG)n末端設計含有芳環或者氟代芳環的氨基酸組裝形成纖維結構15,16；在(POG)n或者(PPG)n末端的設計與金屬配位的氨基酸，組裝得到纖維結構17–20等。雖然以上設計均可形成高聚的膠原納米材料，但是纖維形貌難以預測與控制。

在本工作中，我們首次展示了有機小分子促進的類膠原多肽分級組裝形成結構規整的納米纖維可能性。設計含有4,4’-亞甲基雙(異氰酸苯酯)修飾類膠原多肽，利用末端的有機小分子之間形成非共價作用力協同促進類膠原多肽自組裝。對于不能形成三股螺旋結構(POG)6序列，進行異氰酸苯酯修飾后的AP6序列，形成了三股螺旋結構。對于能形成三股螺旋結構(POG)8序列，進行異氰酸苯酯修飾后的AP8序列，MRE值從3.9提高到了4.9，Tm值提高了21 °C。說明末端修飾異氰酸苯脂分子可以提高三股螺旋的穩定性。由于臨近膠原三股螺旋同向組裝具有較大的空間位阻，使得類膠原雜合肽三股螺旋呈交錯形式排列，所形成的的納米纖維的寬度約為類膠原多肽長度的兩倍。同時，值得注意的是，AP6與AP8形成的三股螺旋直徑均為1 nm左右，但是，AP8所形成納米纖維的高度約為AP6的2.5倍，，推測這些納米纖維可能是有多層的螺旋堆積而成，并且AP8堆積的層數比較多。由于AP8的分子比AP6稍長，可能其組裝效率更高，但是我們仍然無法悉知其多層堆積的組裝機制。

綜上所述，有機小分子異氰酸苯酯修飾的類膠原多肽(POG)6或(POG)8，提高了三股螺旋的穩定性并且促進了類膠原多肽自組裝形成納米纖維，實現了膠原纖維的部分可控組裝。該設計結合了超分子化學與肽的自組裝，豐富了類膠原多肽材料的設計類型，為開發新型的類膠原多肽納米材料提供了選擇。