紅色熒光碳量子點用于腫瘤微酸環(huán)境診斷

黃靖 ，王丹陽 ，李淑花 ，范紅 ，范樓珍 ,＊

1北京師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，北京 100875

2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院，北京 100043

3山西省人民醫(yī)院，太原 030012

1 引言

近年來，癌癥已經(jīng)成為危害人類身體健康的主要疾病1–3。腫瘤的早期診斷能顯著提高癌癥患者存活率或延長生存期4–6。目前，用于腫瘤診斷的熒光材料主要通過識別腫瘤細(xì)胞膜上特定的受體蛋白分子來實現(xiàn)，只能檢測某一種或某一類腫瘤7–10。因此，利用腫瘤的獨特性發(fā)展一種普適性熒光材料檢測腫瘤非常重要11–13。

腫瘤的微環(huán)境指標(biāo)，如低pH、低氧和高隙間壓力是所有實體瘤的普遍特征14。低pH的主要原因是腫瘤細(xì)胞葡萄糖攝取率升高而氧化磷酸率降低，從而導(dǎo)致乳酸聚集15–17。腫瘤組織內(nèi)的pH值為6.4–6.8，正常組織的pH值通常在7.0–7.4，因此在pH 6.8左右響應(yīng)的熒光材料適合檢測腫瘤18–20。傳統(tǒng)pH響應(yīng)的熒光材料多選用染料作為熒光劑，具有較大的毒性，響應(yīng)范圍比較寬，且容易受光漂白影響21–27。

碳量子點(CQDs)作為一種新型的零維碳納米材料，由于低毒性、易于表面修飾、良好的水溶性、抗光漂白性以及優(yōu)異的生物相容性等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于生物成像、藥物傳遞等方面28–36。我們實驗室已經(jīng)報道了一種pH響應(yīng)的熒光碳量子點(pRF-CQDs)，當(dāng)pH > 6.8時呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，而pH <6.8時呈現(xiàn)綠色熒光，但是藍(lán)綠色短波熒光信號容易受生物體自身背景熒光干擾，因此需要設(shè)計一種紅色的CQDs用于腫瘤微酸環(huán)境的診斷35。

我們以4-二甲氨基苯酚為前驅(qū)體，采用溶劑熱法合成了一種紅色熒光CQDs (R-CQDs)，RCQDs熒光發(fā)射峰為640 nm，絕對熒光量子產(chǎn)率為12.8%，通過修飾單甲醚聚乙二醇衍生物(MeOPEG-PDPA)，設(shè)計了pH響應(yīng)紅色熒光CQDs (pRFR-CQDs)37–43。當(dāng)pH < 6.8時，pRF-R-CQDs的氨基質(zhì)子化呈現(xiàn)紅色熒光，而pH > 6.8時，pRF-R-CQDs的氨基去質(zhì)子化導(dǎo)致紅色熒光淬滅，因此能夠利用熒光顏色差別區(qū)分出腫瘤組織和正常組織44–46。當(dāng)腫瘤位置處沒有形成明顯腫塊時，pRF-R-CQDs能夠檢測到微酸性腫瘤組織。因此，pRF-R-CQDs在臨床腫瘤診斷方面具有潛在的實用價值。

2 實驗部分

2.1 主要試劑及實驗儀器

4‐二甲氨基苯酚(分析純，阿法埃莎化學(xué)有限公司)、高碘酸鉀(分析純，上海阿拉丁生物科技有限公司)、單甲醚聚乙二醇2000 (分析純，上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司)。

熒光光譜儀(珀金埃爾默股份有限公司，Perkin Elmer-LS55)、紫外可見吸收光譜儀(島津儀器有限公司，UV2450)、透射電子顯微鏡(日本電子株式會社，JEM2100)，激光共聚焦熒光顯微鏡(徠卡儀器有限公司，LEICA STP)、流式細(xì)胞儀(美國BD公司，F(xiàn)ACS Diva)、X射線光電子能譜(賽默飛世爾科技公司，Thermo Scientific)傅里葉變換紅外光譜儀(賽默飛世爾科技公司，Nicolet)、小動物活體成像儀(珀金埃爾默儀器有限公司，IVIS Lumina Series)。

2.2 R-CQDs的制備

將20 mg的4-二甲氨基苯酚和60 mg的高碘酸鉀溶解在10 ml的乙醇中，超聲10 min，再將此溶液轉(zhuǎn)移至25 mL的聚四氟乙烯的高壓釜中，置于180 °C的烘箱中反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后，將此高壓釜置于室溫下冷卻，在8000 r?min?1下離心10 min，除去不溶性雜質(zhì)后將溶液烘干，在以CH3OH和CH2Cl2為洗脫劑(體積比1 : 25)的硅膠柱中分離后得到R-CQDs。

2.3 絕對量子產(chǎn)率的測量

采用配備120 mm積分球的FLR025光譜儀測量R-CQDs的量子產(chǎn)率。把FLR025光譜儀的測試光傳送到積分球上，量子點的乙醇溶液放置在石英比色皿中，溶劑乙醇作為空白對照，測量R-CQDs的量子產(chǎn)率。

2.4 pRF-R-CQDs的制備

將10 g除水處理過的MeO-PEG-OH加入250 mL圓底燒瓶中，將圓底燒瓶浸入冰鹽浴中不斷攪拌，并滴加4.3 mL溴代異丁基酰溴，體系在室溫下攪拌反應(yīng)48 h。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去THF，并將100 mL水加入剩余的有機相中，用二氯甲烷萃取有機相。對有機相依次進(jìn)行洗滌、干燥、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將得到的有機濃縮體系加入無水乙醚沉淀，減壓抽濾得到大分子引發(fā)劑(MeO-PEG-Br)。在25 mL圓底燒瓶中加入0.56 g MeO-PEG-Br、14.4 mg催化劑CuBr、2.56 g甲基丙烯酸二異丙基氨基乙酯(DPAMA)和1.42 g R-CQDs。在瓶內(nèi)保持氮氣氛圍下取配 體N,N,N?,N?,N?- 五 甲 基 二 亞 乙 基 三 胺(PMDETA，99%)21 μL加入瓶中，將圓底燒瓶浸入60 °C油浴中反應(yīng)48 h。通過中性A12O3柱除去催化劑和配體等雜質(zhì)，得到嵌段共聚物(MeO-PEGPDPA)。將R-CQDs、MeO-PEG-PDPA和N-羥基琥珀酰亞胺混合后置于室溫中于黑暗處劇烈攪拌并過夜反應(yīng)，再將得到的溶液以CH3OH和CH2Cl2為洗脫劑(體積比1 : 20)在硅膠柱中分離，最終得到pRF-R-CQDs。

2.5 細(xì)胞活性檢測

采用細(xì)胞計數(shù)法(CCK-8)檢測細(xì)胞活性。將三種細(xì)胞懸液接種在96孔板中，培養(yǎng)板置于5% CO2、37 °C下預(yù)培養(yǎng)24 h。實驗組向每孔加入10 μL不同濃度的pRF-R-CQDs緩沖溶液，空白對照組每孔加入10 μL生理鹽水，再將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。每孔加入10 μL CCK溶液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，測定在450 nm處的吸光度值。

2.6 活體成像

活體成像實驗所用動物為5–6周雌性裸鼠(15–20 g)。在裸鼠右腋下接種腫瘤細(xì)胞，至腫瘤體積達(dá)到約150 mm2進(jìn)行活體成像實驗。荷瘤裸鼠通過尾靜脈注射100 μL pRF-R-CQDs緩沖溶液(劑量為5 mg?kg?1)。注射后，在不同時間點采用活體成像儀收集熒光信號。此外，將注射12 h后的荷瘤裸鼠解剖得到腫瘤、肌肉、腦、腎、腸、脾、肺和心，在活體成像儀下觀察腫瘤、肌肉和不同器官的成像。

2.7 組織成像

將腫瘤和腿部肌肉組織分別放平擺在組織支撐器中，滴入少許包埋劑，迅速置于冷凍臺中。將冷凍的組織在冷凍切片機的機械承器上加緊，轉(zhuǎn)動旋鈕，將組織修復(fù)平整，制作冰凍組織切片(厚度：20 μm)。將切好的組織切片轉(zhuǎn)移到載玻片上，在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長為561 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 R-CQDs的熒光性質(zhì)

圖1a是R-CQDs水溶液在日光燈和365 nm紫外燈照射下的照片，R-CQDs水溶液發(fā)出明亮的紅色熒光。圖1b是R-CQDs的紫外可見吸收光譜圖(UV-Vis)及熒光光譜(PL)。在波長為210 nm處存在明顯的吸收峰，對應(yīng)于sp2共軛結(jié)構(gòu)的π–π*的躍遷吸收。在波長為285 nm附近存在一個較弱吸收峰，對應(yīng)于C＝O等結(jié)構(gòu)的n–π*躍遷吸收，R-CQDs在545 nm處有特征吸收峰，對應(yīng)的熒光發(fā)射峰位置為640 nm。圖1c是不同pH下R-CQDs的熒光光譜，熒光強度在pH 6–8范圍內(nèi)無明顯變化，表明RCQDs的熒光強度在pH 6–8范圍內(nèi)受pH影響較小。在30天的連續(xù)光照下，如圖1d所示，R-CQDs的熒光強度沒有明顯變化，具有良好的穩(wěn)定性。

圖1 (a)日光燈(左)和紫外燈(右)照射下的R-CQDs水溶液，(b)R-CQDs的UV-Vis和PL光譜圖，(c)R-CQDs在不同pH下的PL光譜(激發(fā)波長540 nm)，(d)R-CQDs的熒光穩(wěn)定性Fig. 1 (a)The photographs of R-CQDs aqueous solution under visible light and UV light, (b)UV-Vis absorption and PL spectra of R-CQDs, (c)PL spectra of R-CQDs at different pH, (d)Photostabilities of R-CQDs.

3.2 R-CQDs的形貌與結(jié)構(gòu)表征

透射電子顯微鏡(TEM)結(jié)果表明R-CQDs的尺寸大小約為4 nm (圖2a)，高分辨透射電鏡(右上插圖)結(jié)果顯示，R-CQDs的晶格間距為0.21 nm，對應(yīng)于石墨烯(100)晶面的衍射。X射線光電子能譜(XPS)如圖2b–d所示，R-CQDs主要由C、N、O三種元素組成，原子百分比分別為85.77%、4.32%、9.91%。R-CQDs的C 1s譜圖中主要有284.8 eV一個比較強的峰，對應(yīng)于石墨類sp2雜化C原子(C＝C)的結(jié)合能。另外在285.8、286.4和287.8 eV處還有三個較弱的峰，分別對應(yīng)于C―N、C―O和C＝O的結(jié)合能。R-CQDs的N 1s峰位置分別位于399和400.6 eV，分別對應(yīng)于氨基氮和石墨化氮。在傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜中(圖2e)，1065、1405、1640和3456 cm?1的峰分別對應(yīng)于C―N、C＝C、C＝O和O―H的伸縮振動。拉曼(Raman)光譜圖(圖2f)中可以看到R-CQDs在1340和1585 cm?1處分別出現(xiàn)石墨烯特有的D峰和G峰，ID/IG值約為0.81，表明R-CQDs結(jié)晶性良好，缺陷較少。圖2g是R-CQDs的X射線衍射(XRD)圖，在23°左右出現(xiàn)一個弱而寬化的衍射峰，對應(yīng)石墨(002)晶面間距。以上結(jié)構(gòu)表征結(jié)果表明，R-CQDs表面含有大量的羰基和羥基，氮元素主要以石墨氮的形式存在，由此推斷RCQDs的結(jié)構(gòu)示意圖(圖2h)。

圖2 R-CQDs的(a)TEM圖，(b–d)XPS圖，(e)FT-IR光譜圖，(f)Raman光譜圖，(g)XRD圖譜，(h)結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 2 (a)TEM images, (b–d)XPS analysis, (e)FT-IR spectra, (f)Raman spectrum, (g)XRD spectrum,(h)structure diagram of R-CQDs.

3.3 pRF-R-CQDs的熒光性質(zhì)

圖3a為pRF-R-CQDs的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3b是365 nm紫外燈激發(fā)下不同pH值的pRF-R-CQDs緩沖溶液外觀圖，當(dāng)pH < 6.8時溶液呈現(xiàn)紅色熒光，當(dāng)pH > 6.8時溶液熒光淬滅。不同pH值下熒光光譜圖(圖3c)顯示，pRF-R-CQDs溶液在pH > 6.8時熒光基本淬滅。當(dāng)pH < 6.8時，且其熒光強度明顯增高，pH 6.5時熒光最強。實驗中通過酸堿滴定的方法確定了pRF-R-CQDs的pKa值，圖3d是酸堿滴定曲線，計算了pRF-R-CQDs的pKa約等于6.76，非常接近于熒光突變點6.8。圖3e是不同pH值下pRF-R-CQDs的TEM照片，當(dāng)pH > 6.8時pRF-R-CQDs的氨基去質(zhì)子化呈現(xiàn)膠束狀，當(dāng)pH < 6.8時pRF-R-CQDs的氨基質(zhì)子化呈現(xiàn)膠束解離狀。

圖3 (a)pRF-R-CQDs的分子結(jié)構(gòu)，(b)不同pH條件下pRF-R-CQDs在紫外燈(365 nm)照射下的照片，(c)不同pH下pRF-R-CQDs的熒光光譜(激發(fā)波長540 nm)，(d)pRF-R-CQDs的酸堿滴定曲線，(e)不同pH條件下pRF-R-CQDs的TEM圖Fig. 3 (a)Structure diagram of pRF-R-CQDs. (b)Photographs showing fluorescence under UV light (excited at 365 nm)of the pRF-R-CQDs at different pH values. (c)Fluorescence spectra excited at 540 nm of pRF-R-CQDs at different pH values. (d)Potentiometric titration curves of pRF-R-CQDs. (e)TEM images of pRF-R-CQDs at different pH.

3.4 pRF-R-CQDs用于腫瘤組織檢測

將pRF-R-CQDs分別皮下注射至四種荷瘤裸鼠(腫瘤類型分別為HepG2、PANC-1、HCT116和A549)的腫瘤和腿部肌肉處，12 h之后將腫瘤和腿部肌肉取出，冷凍切片后放置于激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察。如圖4所示，四種腫瘤組織相對于正常組織即腿部肌肉組織密而細(xì)，并且發(fā)出明亮的紅色熒光，而腿部肌肉組織未呈現(xiàn)熒光。結(jié)果表明pRF-R-CQDs可以避開生物自身熒光的干擾，利用腫瘤微酸性區(qū)分出正常組織和腫瘤組織。

圖4 pRF-R-CQDs分別皮下注射至HepG2、PANC-1、HCT116和A549荷瘤裸鼠的腫瘤和腿部肌肉處，12 h之后腫瘤組織冷凍切片(左二)和腿部肌肉組織冷凍切片(右二)的激光共聚焦熒光顯微鏡照片及相應(yīng)的明場照片(標(biāo)尺：24 μm)Fig. 4 Representative confocal microscopy images of indicated tumors in red fluorescence channel and white field(left two panels)and muscles in red fluorescence channel and white field (right two panels). Scale bars: 24 μm.

3.5 pRF-R-CQDs用于腫瘤診斷

將pRF-R-CQDs緩沖溶液通過尾靜脈注射至HeLa荷瘤裸鼠體內(nèi)，注射后選用活體成像儀收集熒光信號。圖5a為pRF-R-CQDs注射后不同時間點的活體成像圖。從圖中可以觀察到，注射2 h后，在腫瘤處觀察到微弱的紅色熒光信號，說明pRFR-CQDs在參與裸鼠血液循環(huán)中能夠識別微酸性環(huán)境。由于腫瘤的被動靶向性，pRF-R-CQDs在腫瘤處聚集，其熒光信號隨時間增強。24 h后裸鼠腫瘤處的熒光信號明顯減弱，表明pRF-R-CQDs在裸鼠體內(nèi)逐漸被代謝排出體外。解剖得到的主要器官熒光成像結(jié)果如圖5b所示，由于失調(diào)的糖酵解引起腫瘤細(xì)胞間呈現(xiàn)微酸環(huán)境，所以pRF-R-CQDs在腫瘤處顯示紅色熒光，即pRF-R-CQDs可以應(yīng)用于腫瘤的診斷。

圖5 (a)荷瘤裸鼠通過尾靜脈注射pRF-R-CQDs (5 mg?kg-1)后不同時間的活體成像圖，(b)12 h后解剖得到腫瘤、肌肉和各個器官的熒光成像圖，(c)裸鼠接種腫瘤后，不同時間尾靜脈注射pRF-R-CQDs后的活體成像圖Fig. 5 (a)Representative images of a HeLa tumor-bearing mouse at the indicated time points after intravenous injection of pRF-R-CQDs (5 mg?kg?1). (b)Imaging of tumor, muscle, major organs from a mouse treated with pRF-R-CQDs.(c)After tumor inoculation, mice were intravenously administered pRF-R-CQDs solution at a dose of 5 mg?kg?1 every days. Twelve hours after each injection, mice were imaged.

將含1 × 106個細(xì)胞(0.1 mL)的HeLa細(xì)胞懸液皮下注射到裸鼠右側(cè)腋窩。接種后每天將pRF-RCQDs緩沖溶液尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)，12 h后進(jìn)行活體成像，重復(fù)觀察10天。從圖5c中可以看出，HeLa細(xì)胞植入裸鼠體內(nèi)第3天時，可以觀察到裸鼠的右腋出現(xiàn)微弱的熒光信號，而此時對應(yīng)的灰度圖中沒有明顯的腫塊，第8天時該位置出現(xiàn)明顯的凸起，有微小的腫塊長成，熒光信號比較明顯。隨著HeLa細(xì)胞植入天數(shù)的逐漸增加，腫瘤繼續(xù)增大，同時腫瘤的熒光信號也逐漸增強。實驗結(jié)果表明，當(dāng)腫瘤位置處產(chǎn)生微酸環(huán)境并沒有形成明顯的腫塊時，pRF-R-CQDs可以顯示熒光信號，有助于實現(xiàn)腫瘤的早期診斷。

圖6 (a)HeLa細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞和HUVEC與不同濃度pRF-R-CQDs溶液作用后的細(xì)胞活性圖，(b)主要器官蘇木精-伊紅染色切片(標(biāo)尺：40 μm)Fig. 6 (a)Cytotoxicity of pRF-R-CQDs on indicated cells. (b)Representative images of indicated tissues with H&E staining, Scale bars: 40 μm.

3.6 pRF-R-CQDs的毒性測試

評估了pRF-R-CQDs對三組細(xì)胞的毒性，其中HeLa與MCF-7為腫瘤細(xì)胞，HUVEC (人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)來自正常組織。將一系列不同濃度pRF-RCQDs依次添加到細(xì)胞中，24 h后測定細(xì)胞活力。圖6a表明pRF-R-CQDs在濃度高達(dá)100 μg?mL?1時不表現(xiàn)出明顯的毒性。進(jìn)一步研究pRF-R-CQDs對活體動物的毒性。給健康小鼠每隔一天尾靜脈注射pRF-R-CQDs，在第15天取出腦、心、肝、脾、肺、腎等主要器官，并切取后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色圖6b，與對照組相比，pRF-R-CQDs處理過的小鼠的主要器官中均未出現(xiàn)明顯的毒性。結(jié)果表明pRFR-CQDs在臨床癌癥診斷方面具有較大的潛能。

4 結(jié)論

合成了一種紅色熒光碳量子點R-CQDs，并將MeO-PEG-PDPA修飾到其表面，制備了一種pH 6.8響應(yīng)熒光碳量子點(pRF-R-CQDs)。當(dāng)pH值小于6.8時呈現(xiàn)紅色熒光，當(dāng)pH值大于6.8時其熒光淬滅，能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤的診斷。由于pRF-R-CQDs能夠區(qū)分腫瘤和正常組織，具有低毒性以及對腫瘤的高特異性和敏感性等特點，因此在腫瘤早期診斷方面有廣泛的應(yīng)用前景。此外，通過本研究中描述的方法可能合成近紅外波長的熒光碳量子點用于腫瘤診斷。