中國2017—2019年耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥基因及流行克隆特征

龍華婧，邱芳華，劉道利，周 意，吳嘉怡，何仰芬

(廣州中醫藥大學附屬廣州中醫醫院 1. 檢驗科； 2. 院感科，廣東 廣州 510000)

亞胺培南、美羅培南等碳青霉烯類藥物對超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)及頭孢菌素酶(AmpC)具有高度穩定性，且由于抗菌藥物后效應使其具有抗菌活性強、抗菌譜廣的特性，被認為是治療腸道桿菌所致重度感染的最后一道防線[1]。隨著碳青霉烯類藥物的廣泛使用、不合理應用，以及質粒介導的碳青霉烯酶流行，耐藥基因通過質粒在細菌間傳播及變遷[2-3]，導致耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbape-nem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)已呈全球散布[4]。根據全國細菌耐藥監測網結果報道，肺炎克雷伯菌對亞胺培南、美羅培南的耐藥率分別從2014年的4.8%、4.5%上升到2019年的10.5%、10.9%，五年間上升幅度達2倍以上[5-6]，耐藥率上升快速。本研究對2017—2019年CRKP相關檢索文獻中大量數據進行統計分析，探討近年來CRKP在我國流行的克隆及分子流行病學特征，為臨床上追蹤及實時監控CRKP醫院感染以及防控提供實際數據支持，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 文獻檢索 通過計算機檢索中國知網(CNKI)和萬方期刊數據庫，檢索發表時間為2017年1月1日—2019年12月31日，檢索詞包括耐碳青霉烯類、肺炎克雷伯菌、耐藥和基因。

1.2 文獻納入及排除標準 納入標準：(1)可獲得全文的公開發表期刊論文、學位論文；(2)文獻所研究的肺炎克雷伯菌株在中國境內采集，且有具體收集地點；(3)文獻數據可提供菌株采集地，用聚合酶鏈反應(PCR)方法檢測耐藥基因，通過多位點序列分型(MLST)分析獲得ST型別。排除標準：(1)重復報道的文獻；(2)綜述、病例報告、會議或不能獲取全文等文獻；(3)文獻僅提供菌株藥敏分析而不能提供PCR檢測的耐藥基因或MLST的ST型別。

1.3 數據提取及分析 根據巴斯德研究所網站(https://bigsdb.pasteur.fr/)提供的肺炎克雷伯菌MLST數據庫(https://bigsdb.pasteur.fr/cgi-bin/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_klebsiella_seqdef)，將所收集文獻菌株的ST型別進行比對，獲得各型別的七個管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB)，將所有菌株位點信息錄入BioNumerics(Version7.6.3)軟件創建最小生成樹。應用Microsoft Excel 2016軟件統計分析并構建相對應的統計圖。

2 結果

2.1 納入文獻 初步檢索文獻202篇，根據納入及排除標準，下載閱讀全文并手工歸納，最終納入40篇文獻[7-46]。共2 094株CRKP，來自全國15個省市，其中2 094株(100%)通過PCR檢出耐藥基因，859株(41.02%)通過MLST檢出ST型別。根據中國七大自然地理分區，本研究暫未納入來自西北及港澳臺地區的CRKP研究數據。

2.2 耐藥基因及亞型檢出情況 提取2 094株CRKP數據分析發現，1 631株(77.89%)CRKP攜帶產KPC酶耐藥基因，檢出亞型主要為KPC-2型(1 014株)；916株(43.74%)CRKP攜帶超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)耐藥基因，其中攜帶CTX-M型280株，TEM型270株，SHV型366株。215株(10.27%)CRKP攜帶金屬β-內酰胺酶及亞胺培南(IMP)酶耐藥基因，其中攜帶產NDM型130株，檢出亞型主要為NDM-1(45株)；攜帶產IPM型78株，檢出亞型主要為IMP-4(22株)；攜帶產VIM型7株。80株(3.82%)CRKP攜帶AmpC酶耐藥基因，其中攜帶FOX 28株，DHA 45株，CMY7株；4株(0.19%)CRKP攜帶OXA酶耐藥基因，其中2株為OXA-48亞型；97株(4.63%)CRKP攜帶喹諾酮類耐藥基因。見表1。

表1 2 094株CRKP耐藥基因及亞型的檢出情況

2.3 耐藥基因的地區分布 2 094株CRKP共檢出12種耐藥基因，其中KPC在各地區占比均最高，東北、華北、華東、華南、華中、西南地區分別為72.73%、92.11%、84.27%、69.39%、62.86%、91.53%。華中地區CRKP攜帶CTX-M(50.00%)、TEM(35.19%)、SHV(51.46%)、qnrS(23.54%)耐藥基因高于其他地區。見表2。

表2 2 094株CRKP耐藥基因的地區分布情況[株(%)]

2.4 ST型別檢出情況 859株CRKP菌株進行MLST，共檢出82個ST型，其中優勢型別為ST11(76.72%)，其次為ST15(2.44%)、ST76(1.86%)、ST23(1.28%)。見圖1。

圖1 859株CRKP的ST型別檢出比例

2.5 ST型別地區分布 859株CRKP菌株經MLST分型，共分為82種ST型，優勢型別為ST11(3-3-1-1-1-1-4)；65種ST型只分布在1個地區，11種ST型分布于2個地區，3種ST型分布于3個地區，1種ST型分布于4個地區，1種ST型分布于6個地區。見圖2。

2.6 耐藥基因與ST分型的相關性 共581株CRKP攜帶產KPC-2酶耐藥基因且MLST為ST11,占總ST11型別(共659株)的88.16%。見表3。

表3 耐藥基因與ST型別的關系[株(%)]

注：圖中每一個圈代表一個ST型,圈的大小代表該ST型所包含的菌株數，位點差異個數不同影響連接線由粗至細、由實至虛，最粗實線位點差異個數為1，以此類推。

3 討論

本研究納入CRKP菌株使用PCR方法或MLST的文獻，分析碳青霉烯類耐藥基因以及菌株變異情況，探討CRKP菌株的分子分型和種群結構特征。CRKP耐藥機制復雜多樣，研究[5,47-48]表明，CRKP主要耐藥機制為主動外排機制活躍，膜孔蛋白突變或缺失致外膜通透性降低，青霉素結合蛋白作用位點對碳青霉烯類親和力改變，以及碳青霉烯酶的產生等。CRKP經碳青霉烯類抗生素臨床治療無效后，其耐藥基因更易通過整合子、轉座子等元件在細菌間進行傳播，從而引起耐藥菌株暴發流行[49]。CRKP菌株進行基因序列測定及同源性研究，對耐藥菌株的克隆散播及醫院感染的監測、防控均有非常重要的意義。

本研究創新之處在于統計分析3年CRKP相關文獻數據，大數據分析發現我國CRKP主要流行的耐藥基因型為KPC-2(62.17%)，且在全國各地區占比均為最多，主要優勢序列型別為ST11型(76.72%)，在全國6個地區均有分布，與以往研究[50]結果相符，且有相關研究[51-53]報道此克隆菌株曾引起過醫院感染的暴發。產KPC-2的ST11型CRKP菌株[54-56]在我國流行，且近年來逐漸被重視。既往研究[57-58]對單株CRKP菌株進行全基因組測序，闡明產KPC-2的ST11型CRKP的基因序列；另一項研究[59]對一株ST11型CRKP菌株進行Illumina結合MinION的全基因組測序，結果發現由于IS26作用在一個IncR/IncF質粒上共存3個blaKPC-2基因，IS26的多個拷貝可介導耐藥基因的增殖，產生復雜的耐藥基因遺傳背景。已有研究[60]表明，IS26參與了blaKPC的傳播和擴增；且耐碳青霉烯的高毒性肺炎克雷伯菌(CR-hvKP)更易產生KPC-2的ST11型克隆菌株，高毒力傳播迅速，耐藥基因很可能演變成高毒質粒[61]。

雖然對產KPC-2的ST11型CRKP耐藥基因的研究不斷深入，但耐藥基因的散播流行迅速，據本研究顯示攜帶此基因的耐藥菌株已遍布全國6個地區。現階段對CRKP的綜合防控應建立多重耐藥實時監測體系，臨床嚴格執行抗菌藥物應用指征，做到規范合理使用抗菌藥物，提高醫務人員醫院感染防控意識，嚴格執行手衛生，加強無菌操作培訓等措施，避免CRKP在醫院內出現暴發流行。