自然青貯多花黑麥草優良乳酸菌的篩選及對多花黑麥草青貯品質的影響

袁潔，馬冉冉，張文潔，許能祥，趙冉冉，顧洪如，丁成龍*

（1. 江蘇省農業科學院畜牧研究所，江蘇 南京210014；2. 江蘇省農業科學院農業資源與環境研究所，江蘇 南京210014；3. 農業農村部種養結合重點實驗室，江蘇 南京210014）

多花黑麥草（Lolium multiflorum）為禾本科黑麥草屬植物，具有生長快、產量高、營養豐富、質地柔軟、畜禽喜食等特點，以鮮草、青貯、干草形式來飼喂反芻動物，是我國重要的飼料作物之一［1?3］。多花黑麥草常作為牧草在我國南方冬閑田種植，其生產具有鮮明的季節性，產草集中于翌年高溫多雨的4?5 月，滿足家畜飼喂之后仍然有大量青飼料剩余，加工貯存非常重要［4?5］。高溫多雨的天氣導致干草調制較為困難，可操作性不強［6?7］。青貯調制受降水等天氣因素的影響較小，能夠保存飼草營養成分，同時可以提升飼草的適口性和營養價值，是保存多花黑麥草較為理想的方式，同時可以解決全年家畜青飼料分配不均的問題［8］。

在實際生產中，多花黑麥草直接青貯難度較大，難以得到優質的青貯飼料。一是因為多花黑麥草含水量較高，極易導致梭狀芽孢桿菌的大量繁殖，使得丁酸積累，引起蛋白分解、產生大量氨態氮，青貯品質惡化［3，7］。二是因為新鮮牧草表面附著的有害微生物遠遠多于乳酸菌，且附著乳酸菌多為異型發酵乳酸菌，因而自然青貯時同型發酵乳酸菌難以成為優勢菌群，青貯發酵途徑難以控制，青貯發酵品質不穩定，青貯發酵極易失敗［9?11］。外源添加乳酸菌能夠確保青貯盡快進入乳酸菌主導的發酵階段，降低多花黑麥草青貯料的pH 和氨態氮含量，增加乳酸菌含量，提升青貯發酵品質［5，12?15］。青貯發酵過程中的乳酸菌必須生長快速且具備較強的產酸能力，才能快速降低青貯料的pH，防止腐敗微生物的發酵，減少營養損失，從而制備優質的青貯飼草［16］。因此，添加生長快速、產酸能力強的乳酸菌菌株，是研發優良乳酸菌菌劑的核心，對于制備優良青貯多花黑麥草具有重要意義。

多花黑麥草青貯調制相關研究中涉及的乳酸菌主要有市售乳酸菌制劑［12］、植物乳桿菌［5，13］、短乳桿菌［14］、鼠李糖乳桿菌［15］、布氏乳桿菌［15］等。張靜等［12］研究表明，市售乳酸菌制劑能夠顯著提高青貯多花黑麥草乳酸含量，對乙酸含量、氨態氮/總氮、可溶性碳水化合物含量以及干物質含量均無顯著影響。李君臨等［5］的研究表明，植物乳酸菌能夠顯著提高多花黑麥草的青貯發酵品質，但是對干物質含量、可溶性碳水化合物、酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量均無顯著影響。Parvin 等［14］研究表明，植物乳桿菌能顯著提高多花黑麥草青貯發酵品質，但是其對酵母數量沒有顯著影響，同時顯著抑制了乳酸菌的繁殖。盡管短乳桿菌抑制了酵母的繁殖，但是其對發酵品質的改善效果遠低于植物乳桿菌［14］。Li 等［15］研究表明，市售鼠李糖乳桿菌能顯著提高多花黑麥草青貯發酵品質，但是其對干物質含量沒有顯著影響。盡管市售布氏乳桿菌抑制了酵母菌的繁殖，但是其對發酵品質的改善效果遠低于鼠李糖乳桿菌［14］。為了獲得更好的青貯飼料，研究和評價適用于飼草青貯發酵過程的新菌株非常有必要［17］。目前，尚缺少關于多花黑麥草青貯料中優良乳酸菌篩選及應用的研究。

本試驗篩選自然青貯多花黑麥草中的優良乳酸菌菌株，分析菌株生理生化活性及其對多花黑麥草青貯品質的影響，以期篩選出適用于多花黑麥草青貯發酵的乳酸菌菌株，為多花黑麥草青貯乳酸菌菌劑的研發提供菌株和理論依據。

1 材料與方法

1. 1 乳酸菌的分離和優良菌株的篩選

供試多花黑麥草為四倍體多花黑麥草品種“TETILA”，由百綠公司提供，種植于江蘇省農業科學院溧水種植基地，在抽穗期（2019 年4 月20 日）進行刈割，刈割后凋萎1. 5 h，使其含水量下降至70%［3］，鍘刀切至2～3 cm，手工混合均勻，稱取300 g 裝入40 cm×30 cm 的聚乙烯袋內，真空封口機封口，室溫避光發酵60 d 后開袋取樣，用于分離乳酸菌。

稱取20 g 青貯多花黑麥草，置于含180 mL 無菌生理鹽水的密封三角瓶內，120 r·min?1室溫振蕩1 h，單層無菌紗布過濾，獲得10?1梯度濾液，進行梯度稀釋。 選取10?5、10?6、10?73 個梯度，各取稀釋液100 μL，涂布于deMan，Rogosa，and Sharpe（MRS）固體培養基，于37 ℃倒置培養48 h 進行乳酸菌的分離。對分離的菌株在MRS 固體培養基上純化2 次，進行革蘭氏染色、菌體形態觀察、過氧化氫酶接觸試驗［18］，革蘭氏陽性和過氧化氫酶陰性的菌株為乳酸菌，進行甘油保藏。

將分離純化的乳酸菌活化，按1% 的接種量加入5 mL MRS 液體培養基中，37 ℃靜置培養24 h，利用Bio-Tck微孔板分光光度計（Eon，美國）測定菌液OD600nm，用Mettler Toledo 型pH 計（FE20，中國）直接測定發酵上清液pH，初步篩選生長速率快、產酸能力強的乳酸菌。

1. 2 乳酸菌菌株生理生化特征分析

參照《乳酸菌科學與技術》［18］，進行初篩乳酸菌菌株的代謝葡萄糖產氣試驗，鑒定乳酸菌的發酵類型，不產氣的為同型發酵乳酸菌，產氣的為異型發酵乳酸菌。將初篩的乳酸菌活化，活化菌株按1% 的接種量接種到MRS液體培養基中，分別在5、15、25、35、45 ℃中靜置培養24 h，測定菌液OD600nm，比較菌株在不同溫度下的生長情況；活化菌株按1% 的接種量分別接種至pH 為7. 0、6. 5、6. 0、5. 5、5. 0、4. 5、4. 0、3. 5、3. 0 和2. 5 的MRS 液體培養基中，37 ℃靜置培養24 h，測定菌液OD600nm，分析乳酸菌的耐酸性。活化菌株按1% 的接種量分別接種至NaCl 濃度為3. 0%、6. 5%、10. 0%、20. 0%（w/v）的MRS 液體培養基中，37 ℃培養24 h 后，測定菌液OD600nm，分析乳酸菌的耐鹽性［10］。

1. 3 乳酸菌菌株的16S rRNA 序列分析及系統發育樹的構建

提取初篩菌株的基因組DNA，采用原核生物16S rRNA 通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進行PCR 擴增［10］，擴增產物送北京擎科新業生物技術有限公司進行測序。將測得的16S rRNA 序列提交NCBI Genbank（http：//blast. Ncbi. nlm. nih. gov/Blast）進行Blast 同源性比對分析，得出菌株的屬種信息。選取Genbank 中與初篩菌株相似度最高的已知菌株序列，利用MEGA 5. 1 軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統發育樹，對乳酸菌的系統發生地位進行分析，Bootstrap（1000 次重復）檢驗各分支的置信值。

1. 4 乳酸菌菌株生長曲線和產酸性能測定

將初篩的乳酸菌活化，活化菌株按1% 的接種量接種到MRS 液體培養基，混合均勻測定發酵液OD600nm初始值和pH 初始值，37 ℃靜置培養，在32 h 內每隔2 h 混合菌液并測定OD600nm和pH。以菌株的培養時間為橫坐標，以OD600nm和pH 為縱坐標，分別繪制生長曲線圖和產酸性能圖［10］。取36 h 發酵液，經0. 22 μm 水相濾膜過濾，利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測條件分析濾液中有機酸的種類和含量。

1. 5 多花黑麥草青貯調制、青貯品質及微生物數量分析

在抽穗期（2020 年4 月24 日）刈割多花黑麥草，刈割后凋萎1. 5 h，使其含水量下降至約70%，鍘刀切至2～3 cm，手工混合均勻［3，6］。多花黑麥草原料營養成分和微生物數量見表1。

表1 多花黑麥草原料營養成分和微生物數量Table 1 Chemical and microbial population in the material of Italian ryegrass

在多花黑麥草中分別添加不同的乳酸菌菌劑，按照1. 0×106cfu·g?1的添加比例［10］，用噴壺均勻噴灑于切碎的多花黑麥草上，對照組添加相應體積的水（30 mL）。 稱取300 g 裝入40 cm×30 cm 的聚乙烯袋內，真空封口機封口。每個處理調制3 個重復，室溫避光發酵60 d 后開袋取樣，進行青貯營養品質分析、發酵品質分析以及青貯微生物計數。

取150 g 多花黑麥草原料或青貯樣品，105 ℃殺青30 min，65 ℃烘干至恒重，測定干物質（dry matter，DM）含量［12］。 樣品粉碎后過0. 38 mm 篩子，采用FOSS 8400 型全自動凱氏定氮儀（丹麥）蒸餾測定粗蛋白（crude protein，CP）含量［19］。采用蒽酮?硫酸比色法測定可溶性碳水化合物（water soluble carbohydrates，WSC）和淀粉（starch）含量［20］。 采用范氏洗滌纖維法測定中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）、酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）和酸性洗滌木質素（acid detergent lignin，ADL）含量，計算獲得纖維素（cellulose）和半纖維素（hemicellulose）含量［21］。

取20 g 多花黑麥草或其青貯樣品，置于三角瓶內，加入180 mL 的蒸餾水，充分混勻后于4 ℃靜置24 h，4 層紗布過濾后，獲得濾液，使用Mettler Toledo 型pH 計（FE20，中國）測定濾液pH 值［22］。濾液經0. 22 μm水相濾膜過濾后，根據Liu 等［22］的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測條件分析濾液中乳酸（lactic acid，LA）、乙酸（acetic acid，AA）、丙酸（propionic acid，PA）、丁酸（butyric acid，BA）、異丁酸（isobutyric acid，ISOBA）含量。利用苯酚?次氯酸鈉比色法測定濾液中氨態氮（NH3-N）含量［23］。

取10 g 多花黑麥草或其青貯樣品，置于含90 mL 無菌生理鹽水（0. 9%）的密封三角瓶內，120 r·min?1室溫振蕩1 h，單層無菌紗布過濾，獲得10?1梯度濾液，進行梯度稀釋，獲得10?2、10?3、10?4、10?5、10?6、10?7梯度稀釋液［24］。采用平板計數法進行好氧細菌、乳酸菌、酵母、霉菌計數。取不同梯度的稀釋液各100 μL，分別涂布于營養瓊脂培養基、MRS 瓊脂培養基、孟加拉紅瓊脂培養基中［22］。營養瓊脂培養基在37 ℃培養1 d 后進行好氧細菌計數，MRS 瓊脂培養基在37 ℃培養2 d 后進行乳酸菌計數，孟加拉紅培養基在28 ℃培養1 d 后進行酵母菌計數、培養3 d 后進行霉菌計數。

1. 6 數據統計與分析

采用SPSS 13. 0（IBM，芝加哥，美國）軟件進行數據統計與分析。利用單因素方差分析（one-way ANOVA）及Tukey’s 檢驗（P<0. 05）對兩組以上數據進行統計與分析。利用Origin 8. 6 和Photoshop CS6 進行圖像處理。

2 結果與分析

2. 1 多花黑麥草青貯乳酸菌分離和初篩

本試驗共分離獲得180 株乳酸菌，編號為PR_LAB_1～PR_LAB_180。如圖1 所示，180 株乳酸菌培養24 h 后，OD600nm為0. 61～1. 68，發酵液的pH 為3. 85～4. 61，其中OD600nm≥1 且pH<4 的乳酸菌有5 株，為菌株PR_LAB_9、PR_LAB_34、PR_LAB_67、PR_LAB_76 和PR_LAB_86，為初篩獲得的優良乳酸菌菌株。

圖1 180 株乳酸菌在MRS 培養液中培養24 h 的菌液OD600nm及pHFig. 1 The OD600nm and pH value of 180 strains of lactic acid bacteria cultured in MRS medium for 24 h

2. 2 青貯乳酸菌的形態及生理生化特性

如表2 所示，5 株菌均為革蘭氏陽性和過氧化氫酶陰性，其中PR_LAB_76 為球菌，其他4 株均為桿菌。5 株乳酸菌在葡萄糖發酵產氣試驗中不產氣，為同型發酵乳酸菌。5 株乳酸菌均能夠在NaCl 濃度為3. 0%，15～35 ℃，以及pH 為3. 5～7. 0 的MRS 液體培養基中良好生長（＋＋＋）；在NaCl 濃度為6. 5%，以及pH 為3. 0 的MRS 培養基中一般生長（＋＋）；在NaCl 濃度為10. 0%，以及5 和45 ℃的MRS 培養基中微弱生長（＋）；在NaCl 濃度為20. 0%，以及pH 為2. 5 的MRS 液體培養基中不能生長（?）。

表2 乳酸菌的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of lactic acid bacteria

2. 3 乳酸菌16S rRNA 鑒定

將測序結果提交NCBI 進行Blast 比對分析，結果表明，5 株乳酸菌的序列與數據庫中已知的16S rRNA基因序列的相似性均高于99. 00%（表3）。 其中，PR_LAB_9 的序列與植物乳桿菌最為接近，為99. 93%；PR_LAB_34、PR_LAB_67、PR_LAB_86 與植物乳桿菌的相似度為100. 00%。由系統發育樹可知，PR_LAB_9、PR_LAB_34、PR_LAB_67、PR_LAB_86 與植物乳桿菌親緣關系最為接近（圖2）。 PR_LAB_76 與戊糖片球菌的相似度為99. 86%，與戊糖片球菌在系統發育樹中親緣關系最為接近（圖2）。

表3 基于16S rRNA 序列的NCBI 比對結果Table 3 NCBI alignment results based on 16S rRNA sequence

圖2 多花黑麥草青貯乳酸菌16S rRNA 系統發育樹Fig. 2 Phylogenetic dendrogram of lactic acid bacteria from natural silage L. multiflorum based on the 16S rRNA fragments

2. 4 乳酸菌菌株生長性能和產酸能力測定

2. 4. 1 乳酸菌菌株生長性能測定 由圖3A 可知，5 株乳酸菌能夠在2～4 h 開始快速生長，在4～12 h 生長速率達到最大，大約12 h 生長速度變緩，進入穩定期，隨后菌液OD600nm變化較小，在32 h 沒有出現菌體生長衰退。菌株PR_LAB_9、PR_LAB_34、PR_LAB_67、PR_LAB_76 和PR_LAB_86 發酵12 h 的菌液OD600nm分別為1. 508、1. 446、1. 517、1. 595 和1. 589。 在24 h 內，生長速度最快的是菌株PR_LAB_76，其次是菌株PR_LAB_86、PR_LAB_9 和PR_LAB_67，生長速度最慢的是PR_LAB_34。

圖3 乳酸菌生長曲線（A）和產酸性能（B）、24 h 產乳酸量（C）和24 h 產乙酸量（D）Fig. 3 Growth curve（A），acid production capacity（B），lactic acid production at 24 h（C），and acetic acid production at 24 h（D）of lactic acid bacteria

2. 4. 2 乳酸菌菌株產酸能力測定 如圖3B 所示，5 株乳酸菌在2～8 h 的產酸速率較快，8～12 h 產酸速率逐漸下降，14～32 h 產酸速率保持平穩，最終pH 保持在3. 8 左右。 菌株PR_LAB_9、PR_LAB_34、PR_LAB_67、PR_LAB_76、PR_LAB_86 發酵12 h 之后的pH 值分別為4. 09、4. 12、4. 07、4. 06 和4. 07。 在24 h 內，菌株PR_LAB_76 的產酸速率快于其他菌株。進一步通過HPLC 測定5 株乳酸菌發酵液中乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸含量，分析不同乳酸菌的產酸種類和含量產能力。如圖3C，D 所示，5 株乳酸菌主要產生乳酸和乙酸，發酵24 h 之后的乳酸含量分別為133. 20、132. 65、134. 66、136. 73 和135. 13 mmol·L?1，發酵24 h 之后的乙酸含量分別為57. 51、55. 77、56. 54、58. 86 和56. 08 mmol·L?1。在24 h 內，菌株PR_LAB_76 的產乳酸和乙酸的量高于其他4株乳酸菌。

2. 5 乳酸菌接種后多花黑麥草青貯發酵品質、微生物數量和營養品質分析

2. 5. 1 乳酸菌接種后多花黑麥草青貯發酵品質分析 與對照組相比，乳酸菌接種可顯著（P<0. 05）降低多花黑麥草青貯料的pH 值、氨態氮和異丁酸含量，同時顯著（P<0. 05）提高了青貯料的乳酸、乙酸含量和乳酸/乙酸（表4）。其中，菌株PR_LAB_76 處理組多花黑麥草青貯料的pH 低于其他4 株乳酸菌處理組，乳酸含量高于其他4 株乳酸菌處理（表4）。

2. 5. 2 乳酸菌接種后多花黑麥草青貯微生物數量分析 與對照組相比，5 株乳酸菌可顯著（P<0. 05）降低多花黑麥草青貯料的好氧細菌數量和酵母數量，顯著（P<0. 05）提高青貯料的乳酸菌數量（表5）。 其中，菌株PR_LAB_76 處理組多花黑麥草青貯料的乳酸菌數量高于其他4 株乳酸菌處理組，酵母數量低于其他4 株乳酸菌處理組（表5）。

表5 乳酸菌對多花黑麥草青貯微生物數量的影響Table 5 Effects of lactic acid bacteria on microbial counts in Italian ryegrass silage（Log10 cfu·g-1 FM）

2. 5. 3 乳酸菌接種后多花黑麥草青貯營養品質分析 與對照組相比，5 株乳酸菌可顯著（P<0. 05）提高多花黑麥草青貯料的可溶性碳水化合物含量；PR_LAB_67、PR_LAB_76 和PR_LAB_86 可顯著（P<0. 05）降低青貯料的中性洗滌纖維含量；PR_LAB_76 和PR_LAB_86 可顯著（P<0. 05）降低青貯料的酸性洗滌纖維和纖維素含量；PR_LAB_76 可顯著（P<0. 05）降低青貯料的干物質損失，顯著（P<0. 05）提高青貯料的干物質含量和粗蛋白含量（表6）。

表6 乳酸菌對多花黑麥草青貯營養品質的影響Table 6 Effects of lactic acid bacteria on nutritional quality in Italian ryegrass silage

綜合考慮，PR_LAB_76 處理組多花黑麥草的青貯品質最優（表4～6），其干物質、粗蛋白、可溶性碳水化合物、乳酸含量最高，pH 值最低，乳酸菌數量最多，酵母菌數量最少。

表4 乳酸菌對多花黑麥草青貯發酵品質的影響Table 4 Effects of lactic acid bacteria on fermentation quality in Italian ryegrass silage

3 討論

3. 1 多花黑麥草青貯乳酸菌的篩選和鑒定

乳酸菌的生長速率和產酸能力直接影響青貯飼草的品質，是優質乳酸菌評價的重要指標［16］。乳酸菌生長速率快，可以使得青貯料中的乳酸菌數量快速增多，促進發酵。乳酸菌產酸速度及產酸能力快，可以使得發酵青貯料的pH 快速降低，減少飼草營養損失。布氏乳桿菌、干酪乳桿菌和植物乳桿菌是強化青貯過程的常用乳酸菌［15，22，25］。李小鈴等［10］從狼尾草屬（Pennisetum）牧草中分離出生長速率高且產酸效率強的植物乳桿菌3 株和戊糖片球菌1 株。張紅梅［26］分離的1 株編號為31 的優良植物乳桿菌在培養12，24，36 和48 h 時OD600nm分別大于0. 3，0. 6，0. 8 和1. 0，該菌株有效提高了垂穗披堿草（Elymus nutans）的青貯品質。本試驗以青貯多花黑麥草為材料，分離純化180 株乳酸菌，以生長速率和產酸效率進行初篩，獲得5 株優良菌株（圖1），均能夠在12 h 內快速繁殖和產酸（圖3），經鑒定，PR_LAB_9、PR_LAB_34、PR_LAB_67、PR_LAB_86 為植物乳桿菌，PR_LAB_76 為戊糖片球菌（表3，圖2）。飼草青貯發酵是青貯微生物系統中微生物種群增殖變化和群落演替的過程，不同溫度、酸堿度、鹽度等均會影響乳酸菌的生長［10］。本試驗分離的5 株乳酸菌均能在NaCl 濃度為3. 0% 和6. 5%，10～40 ℃，pH 為3. 5～8. 0 的MRS 液體培養基中良好生長，在pH 為3. 0 以及45 ℃環境條件下生長較弱（表2）。因而，本試驗分離的5 株乳酸菌對鹽、溫度、酸堿度均有一定范圍的適應性，具有良好的青貯潛能。

3. 2 乳酸菌對多花黑麥草青貯微生物數量、發酵品質和營養品質的影響

飼草表面附著微生物影響青貯發酵最終品質，當其附著乳酸菌數量不足，乳酸菌無法成為優勢菌群，從而導致青貯發酵效果不理想，青貯發酵品質和營養品質降低［10，27］。本試驗中青貯前多花黑麥草自然附著乳酸菌數量（<105cfu·g?1FM）較少，而好氧細菌數量（>106cfu·g?1FM）、霉菌數量（>103cfu·g?1FM）和酵母菌數量（>103cfu·g?1FM）較多（表5），自然青貯后的發酵品質（pH>4. 2）（表4）、營養品質不佳（表6）。乳酸菌是青貯厭氧階段的主要微生物，將飼草的可溶性碳水化合物轉化為乳酸、乙酸等有機酸，隨之降低青貯發酵體系的pH，抑制有害微生物的繁殖，延長青貯料貯存期，并且能夠改善青貯料發酵品質［28?32］。成功的青貯意味著乳酸菌取代了飼草最初的附著微生物［33］。接種乳酸菌添加劑能夠增加青貯料中乳酸菌的數量，減少青貯料中好氧細菌和酵母的數量［34］。并且，接種乳酸菌能夠提高青貯料乳酸含量，顯著降低pH 值，降低青貯料的干物質損失［35］。研究表明，接種植物乳桿菌能夠提高多花黑麥草青貯發酵品質，但是其對酵母數量沒有顯著影響，同時顯著抑制了乳酸菌的繁殖［14］。盡管接種短乳桿菌抑制了酵母的繁殖，但是其對發酵品質的改善效果遠低于植物乳桿菌［14］。接種本試驗分離的5 株乳酸菌后，多花黑麥草青貯料的乳酸菌數目增加且達到優質青貯的標準，好氧細菌和酵母的數量顯著降低（表5），并且青貯料的乳酸和乙酸含量顯著增加、pH 值顯著降低（表4），表明該5 株乳酸菌均能夠有效改善青貯微生物群落組成，促進多花黑麥草青貯發酵。

氨態氮的含量反映了青貯過程中粗蛋白的降解情況，是評價青貯過程的一個重要參數。普遍認為，在pH 值較低時，飼草的蛋白水解活性會降低。研究表明，盡管市售乳酸菌制劑能夠顯著提高青貯多花黑麥草乳酸含量，但是其對乙酸含量和氨態氮含量均無顯著影響［12］。在本研究中，與對照相比，所有乳酸菌處理組的氨態氮含量顯著降低，這可能與乳酸菌接種后pH 值迅速降低有關（表4），抑制了梭狀芽孢桿菌等微生物的生長和蛋白水解活性［36］。可溶性碳水化合物殘留量越高，說明青貯發酵過程中干物質損失越小，從而產生營養價值更高的青貯飼料［37］。研究表明，市售乳酸菌制劑［12］和植物乳桿菌［5］對青貯多花黑麥草的可溶性碳水化合物含量和干物質含量均無顯著影響［12］。本試驗分離的5 株乳酸菌均可顯著增加青貯多花黑麥草的可溶性碳水化合物殘留量（表6），這是因為乳酸菌接種引起青貯料中快速的乳酸發酵和pH 值的快速降低，從而抑制了不良細菌發酵的可溶性碳水化合物的損失。因此，本試驗分離的5 株乳酸菌可用于提高青貯多花黑麥草發酵品質和營養品質（表4 和表6）。其中，戊糖片球菌PR_LAB_76 處理的多花黑麥草青貯料的品質最優（表4～6）。對于這種現象可能的解釋是：戊糖片球菌PR_LAB_76 的生長和產酸速度快于其他4 株植物乳桿菌（圖3）。

3. 3 戊糖片球菌作為青貯添加劑的優勢

商用的乳酸菌制劑通常含有植物乳桿菌、干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌，部分含有戊糖片球菌、嗜酸片球菌和屎腸球菌［14］。研究表明，市售乳酸菌制劑［12］、植物乳桿菌［5，13］、短乳桿菌［14］、鼠李糖乳桿菌［15］、布氏乳桿菌［15］均能夠提高青貯多花黑麥草青貯發酵品質，但是對營養品質并沒有明顯的改善效果。本研究中，戊糖片球菌PR_LAB_76 接種后，青貯多花黑麥草發酵品質顯著提高，干物質、粗蛋白、可溶性碳水化合物含量均顯著增加，并且中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、纖維素含量顯著降低（表4～6）。因此，本試驗中的戊糖片球菌PR_LAB_76 更適用于多花黑麥草的青貯調制。李東霞等［38］從自然青貯苜蓿（Medicago sativa）中篩選獲得一株戊糖片球菌a144，其能夠快速降低青貯苜蓿pH，顯著提升青貯苜蓿發酵品質和營養品質。張紅梅等［39］發現戊糖片球菌和植物乳桿菌混合添加劑接種后，青貯垂穗披堿草中乳酸菌數量顯著增加，氨態氮和中性洗滌纖維含量顯著降低，粗蛋白含量顯著增加。一般認為，片球菌、腸球菌、乳球菌和明串珠菌是青貯初期發酵的發酵劑，隨后被更能夠耐受酸度的植物乳桿菌和短乳桿菌所取代［14］。因此推測，戊糖片球菌在飼草青貯調制中能夠迅速降低pH，抑制腐敗微生物的繁殖，減少粗蛋白和可溶性碳水化合物的損失，從而使得青貯飼草能夠保存更多的營養物質、減少干物質損失。同時，快速降低的pH 有利于更耐酸的乳酸菌繁殖，進一步增強了飼草的青貯發酵。

4 結論

本研究從多花黑麥草青貯料中分離篩選獲得5 株乳酸菌菌株，PR_LAB_9、PR_LAB_34、PR_LAB_67、PR_LAB_86 為植物乳桿菌，PR_LAB_76 為戊糖片球菌。5 株乳酸菌接種劑在降低多花黑麥草青貯料pH 值和氨態氮含量的同時，增強了可溶性碳水化合物的保存。其中，戊糖片球菌PR_LAB_76 處理的多花黑麥草青貯料的品質最優，其干物質、粗蛋白、可溶性碳水化合物、乳酸含量最高，pH 值最低，乳酸菌數量最多，酵母菌數量最少。本試驗為調制優質多花黑麥草青貯飼料提供了菌株。