紫花苜蓿MsWRKY11 基因的克隆及其耐鹽功能分析

王如月，文武武，趙恩華，周鵬，安淵

（上海交通大學農業與生物學院，上海200240）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是多年生豆科草本植物，適口性好，營養價值高，富含多種微量元素，蛋白質含量豐富，有“牧草之王”的稱譽。此外，苜蓿根瘤發達，改良土壤效果顯著，是一種理想的水土保持草種。當前，世界可耕地面積日益減少，土壤鹽漬化情況日益嚴重。土壤中Na+被植物吸收，對植物細胞造成滲透脅迫，膜蛋白功能受損，影響細胞膜結構穩定，從而影響植物光合、呼吸、抗氧化系統、離子運輸以及營養物質吸收等諸多生理過程，最終抑制植物生長，嚴重時將造成植物死亡［1］。

基因轉錄調控在植物生長發育、衰老、響應脅迫中發揮重要作用。轉錄因子是植物體內一類最重要的調節基因，在植物受到外界脅迫時，會產生一系列的信號傳遞過程來激發轉錄因子對順式作用因子進行調節，使植物產生特異性或非特異性的基因差異表達，從而對脅迫做出響應［2］。WRKY 轉錄因子作為最大的轉錄因子家族，已被廣泛報道參與植物的生物脅迫、非生物脅迫、胚胎發育、新陳代謝、信號傳遞和葉片衰老等過程調控［3?5］。WRKY轉錄因子最典型的特征是其N 端具有1～2 個約60 個氨基酸的保守序列WRKYGQK，以及Cys2-His2或Cys2-His/Cys 鋅指結構［6］，屬于鋅指型轉錄因子WRKY-GCM1 超家族。WRKY 蛋白可以作為轉錄激活子或抑制子，通過WRKY 結構域和鋅指結構域，直接與靶基因啟動子中核心序列（T）（T）TGAC（C/T）的W-box 結合［7］，調節基因的表達。大量研究表明，WRKY 轉錄因子能調控植物對鹽脅迫的響應，緩解高濃度鹽引起的植物傷害。擬南芥（Arabidopsis thaliana）中過量表達棉花（Gossypium hirsutum）GhWRKY34提高了轉基因擬南芥的耐鹽性［8］。Yu等［9］對大豆（Glycine max）基因組進行分析，發現66 個GmWRKYs對鹽脅迫響應明顯。超表達GmWRKY5的轉基因植株通過調控轉錄因子STA/ZAT10 表達，增強轉基因株系耐鹽及抗旱性，但超表達GmWRKY13的轉基因植株對鹽脅迫的敏感性增強［10］。

目前，關于WRKY 轉錄因子調控非生物脅迫的研究多集中在干旱方面，而對鹽脅迫途徑調控的研究報道較少。紫花苜蓿中只有少數的WRKY 轉錄因子被分離、鑒定和功能研究，其對植物耐鹽響應途徑的調控作用仍然不清楚。 本研究從紫花苜蓿中克隆得到1 個MsWRKY11基因，利用農桿菌介導法在紫花苜蓿中超表達MsWRKY11，獲得轉基因苜蓿株系，并對其抗鹽機理進行了研究，以期為紫花苜蓿抗鹽育種提供理論依據和基因資源。

1 材料與方法

1. 1 植物材料

紫花苜蓿品種為WL-525HQ，種子來源于北京正道生態科技有限公司。

1. 2 MsWRKY11 基因的克隆

使用TransZol Up Plus RNA Kit（全式金）提取紫花苜蓿總RNA，使用TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（全式金）反轉錄。

通過NCBI 查找蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）MtWRKY11基因序列，使用Primer Premier 5. 0，根據蒺藜苜蓿MtWRKY11基因序列進行克隆引物設計，所設計引物如下：MsWRKY11-F：TCTGTTACTTTCTTCTAAT TCTTTCAAG；MsWRKY11-R：CGTCACCGTTACAGTTAGAGCAT。

以cDNA 為模板，MsWRKY11-F 和MsWRKY11-R 為上下游引物進行PCR 反應，反應體系為20 μL：cDNA 1 μL、MsWRKY11-F/R 0. 8 μL、Ex-taq 酶10 μL、ddH2O 7. 4 μL，反應程序為95 ℃預變性3 min，95 ℃預變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，30 個循環，72 ℃5 min，4 ℃保存。所得PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳（400 A，120 V，30 min），電泳結束后在紫外光下將正確大小的膠體切下，使用FastPure?Gel DNA Extraction Mini Kit（天根）進行膠回收。

1. 3 生物信息學分析

利用MEGA 5. 0 構建系統進化樹；使用NCBI 將PCR 產物測序結果與MtWRKY11序列進行比對，分析蛋白保守結構域；利用ExPASy-Protparam Tool（https：//web. expasy. org/protparam/）在線分析蛋白親疏水性；利用在線軟件TMHMM Server v. 2. 0（http：//www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/）對MsWRKY11 進行跨膜結構域預測；通過Npsa-Prabi（https：//npsa-prabi. ibcp. fr/）分析MsWRKY11 蛋白二級結構；通過I-TASSER（https：//zhanglab. ccmb. med. umich. edu/I-TASSER/）對MsWRKY11 的三級結構進行預測。

1. 4 鹽（NaCl）、水楊酸（salicylic acid，SA）和茉莉酸（jamonic acid，JA）處理下MsWRKY11 基因表達分析

2018 年9 月將種子洗凈后置于含有浸潤濾紙的鐵盤中，于25 ℃/20 ℃（白天/夜晚），光照時長14 h，光照強度400 μmol·m?2·s?1，相對濕度為65% 的人工培養室萌發，待根長達到7 cm 左右進行試驗。 將幼苗轉移至1/2 Hoagland 營養液（pH 5. 8）的桶中培養3 d 后在營養液中分別加200 mmol·L?1NaCl 或100 mmol·L?1JA 或100 mmol·L?1SA，每2 d 更換一次營養液。處理0、0. 5、1、3、6、9、12、24 h 時，每個處理分別隨機取0. 1 g 幼苗葉片和0. 1 g 根保存于?80 ℃冰箱備用，重復3 次。提取樣品RNA（全式金RNA 提取試劑盒）并反轉錄，將得到的cDNA稀釋5 倍作為模板，以紫花苜蓿EF-α作為內參基因，利用qRT?PCR 分析MSWRKY11的表達模式。反應體系為20 μL：cDNA 2 μL、Primer-F/R 0. 4 μL、PerfectStartTM Green qPCR SuperMix（全式金）10 μL、ddH2O 7. 2 μL，反應程序為95 ℃預變性3 s，94 ℃預變性5 s、58 ℃退火15 s、72 ℃延伸15 s，39 個循環，72 ℃15 s，95 ℃10 s，65 ℃升至95 ℃獲取溶解曲線。所用引物見表1。每個樣品重復3 次。使用C（t）值確定基因的表達水平，并使用2?ΔΔC（t）方法進行計算。

1. 5 紫花苜蓿遺傳轉化及轉基因植株鑒定

將“WL-525HQ”紫花苜蓿種子洗凈置于60 ℃烘箱高溫殺菌7 d，點種于含MS 培養基（MS 2. 22 g·L?1、蔗糖15 g·L?1，凝膠3. 5 g·L?1，pH 5. 8）的廣口瓶中，于25 ℃/20 ℃（白天/夜晚），光照時長14 h，光照強度400 μmol·m?2·s?1的環境中培養30 d。構建CaMV35S 啟動的PHB-MsWRKY11-Flag 表達載體轉化GV3101 農桿菌。利用葉盤法侵染紫花苜蓿葉片，在MS 培養基中24 ℃暗培養4～5 d。隨后在SM4 選擇培養基（MS 4. 43 g·L?1、蔗糖30 g·L?1、2，4-D 4 mL·L?1、6BA 0. 2 mL·L?1，凝膠3. 5 g·L?1，pH 5. 8）、MSBK 培養基（MS 4. 43 g·L?1、蔗糖30 g·L?1、KT 1 mL·L?1、6BA 0. 5 mL·L?1，凝膠3. 5 g·L?1，pH 5. 8，滅菌后加入1 mL·L?1Cef、Timentin 1 mL·L?1、200 μL·L?1Hyg）、MSS 培養基（MS 2. 22 g·L?1、蔗糖15 g·L?1，凝膠3. 5 g·L?1，pH 5. 8，滅菌后加入Cef 1 mL·L?1、Timentin 1 mL·L?1、Hyg 200 μL·L?1）、MSR 培養基（MS 2. 22 g·L?1、蔗糖15 g·L?1，瓊脂7. 5 g·L?1，IAA 1 mL·L?1，pH 5. 8）中進行培養，每2 周更換一次培養基，直至獲得完整植株。同時以非轉基因“WL-525HQ”（野生型）為陰性對照。挑選生長良好的再生植株進行PCR 鑒定陽性株系，并利用qRT?PCR 檢測MSWRKY11的表達量。

1. 6 鹽脅迫處理及相關生理指標測定

2019 年8 月，選取生長旺盛且較一致的MsWRKY11過表達株系及野生型株系，剪成7 cm 左右的枝條，扦插于蛭石∶草炭（1∶1）基質中，置于人工培養室中生長20 d，每株系隨機選取6 盆，澆灌含250 mmol·L?1NaCl 的1/2Hoagland 營養液，另外6 盆作為對照，處理15 d。地上生物量測定：每3 株幼苗為1 個重復，取地上部分測定鮮重，重復3 次。株高測定：每4 株幼苗為一個重復，用直尺測量株高，重復3 次。相對電導率測定：稱取葉片0. 1 g于25 mL 超純水中，25 ℃搖床250 r·min?1搖24 h，測定電導率（E1），121 ℃高溫高壓煮沸15 min，冷卻至室溫后測定電導率（E2），相對電導率=（E2?E1）/ E2，重復3 次。使用科銘生物試劑盒測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、超氧陰離子含量、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性、過氧化物酶（peroxidase，POD）活性，每處理重復3 次。NBT 染色：25 mmol·L?1的HEPES 溶液用NaOH 調節pH 至7. 6，溶解NBT 于HEPES buffer 中，終濃度為0. 1 mg·mL?1，作為NBT 染色液備用，取頂芽開始的第6～7 個葉片浸泡于染色液中，每株系6 片，真空15 min后29 ℃黑暗條件下染色2 h，75% 乙醇65 ℃脫色，拍照記錄。鈉、鉀元素含量測定：每3 株幼苗為1 個重復，烘干、稱重后放于50 mL 離心管中，加入1 mL HNO3、1 mL H2O2，消煮3 h，靜置過夜后取上清液，用電感耦合等離子體發射光譜儀（Optima 8000，鉑金埃爾默，美國）測定鈉、鉀元素含量，每處理重復3 次。

1. 7 耐鹽相關的基因表達模式分析

選取生長旺盛且較一致的MsWRKY11過表達株系及野生型株系，剪成7 cm 左右的枝條，扦插于1/2 Hoagland 營養液（pH 5. 8）的桶中培養14 d 后在營養液中分別加200 mmol·L?1NaCl，每2 d 更換一次營養液。在處理0、6、12、24、48 h，隨機取0. 1 g 幼苗葉片保存于?80 ℃冰箱備用，重復3 次。提取樣品RNA 并反轉錄，將得到的cDNA 稀釋15 倍作為模板，以紫花苜蓿EF-α作為內參基因，利用qRT?PCR 方法檢測耐鹽性相關的6 個關鍵基因MsNHX1、MsSOS3、MsAPX、MsGRX、MsNAC和MsP5CS在野生型和轉基因株系中的表達模式（對照處理野生型的基因表達量設定為1）。每個樣品重復3 次。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

2 結果與分析

2. 1 MsWRKY11 基因的克隆及生物信息學分析

以“WL-525HQ”紫花苜蓿cDNA 為模板，MsWRKY11-F、MsWRKY11-R 為引物，通過PCR 擴增獲得960 bp的條帶（圖1A），回收、克隆、測序，將核苷酸序列在NCBI 上進行Blast 比對，與蒺藜苜蓿WRKY11相似性為94. 00%（圖1B）。

圖1 MsWRKY11 的克隆及序列比對Fig. 1 The cloning and sequence alignment of MsWRKY11

2. 2 MsWRKY11 系統進化樹分析及同源蛋白多序列比對分析

使用MEGA-X 構建系統進化樹，發現MsWRKY11 與蒺藜苜蓿WRKY11 轉錄因子親緣關系最近（圖2A）。利用DNAMAN 將MsWRKY11基因所編碼的氨基酸序列進行多序列比對，發現MsWRKY11 含有一個WRKY結構域，鋅指結構為C2H2型（圖2B）。

圖2 MsWRKY11 系統進化樹分析與同源序列比對Fig. 2 Analysis of MsWRKY11 evolutionary tree and sequence alignment

2. 3 MsWRKY11 蛋白結構分析

在線分析結果顯示，MsWRKY11 為非跨膜蛋白，疏水性氨基酸占25%，親水性氨基酸占75%，表明MsWRKY11 為親水蛋白。 蛋白二級結構預測結果顯示，MsWRKY11 主要由10. 03% α-螺旋（alpha helix）、67. 71% 無規則卷曲（random coil）和22. 26% 延伸帶（extended strand）組成，無其他結構（圖3A）。三級結構預測結果（圖3B）與二級結構相符。

圖3 MsWRKY11 蛋白結構預測Fig. 3 MsWRKY11 protein structure prediction

2. 4 MsWRKY11 基因在NaCl、水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）處理下的表達模式

利用實時熒光定量PCR 分析了200 mmol·L?1NaCl 處理下MsWRKY11的表達情況，結果顯示MsWRKY11對鹽脅迫響應明顯，上調表達（圖4A 和D），其中，在根中的表達量變化較大，并且在根中呈現單峰型，而在葉中呈現震蕩型變化趨勢。

為了明確激素對MsWRKY11誘導表達的影響，在營養液中添加SA 和JA 處理紫花苜蓿幼苗24 h，結果顯示：SA 和JA 處理下，根中MsWRKY11的表達量均上調，最高值依次達到3. 72 和8. 33（圖4B 和C）。 并且，MsWRKY11對SA 的響應比JA 敏感，SA 處理0. 5 h，MsWRKY11表達量即呈現較高的水平，3 h 達到最大值，而JA 處理3 h 時，MsWRKY11表達量才明顯升高，9 h 達到最高水平。在葉中，SA 處理的MsWRKY11呈現波動性上調表達，最高值達到4. 25（圖4E）；而JA 處理下，MsWRKY11呈現下調表達的趨勢（圖4F）。

圖4 NaCl、SA 和JA 處理下MsWRKY11 在根和葉片中的表達模式Fig. 4 The expression pattern of MsWRKY11 in leaves and roots under NaCl，SA and JA treatment

2. 5 MsWRKY11 轉基因紫花苜蓿鑒定

PCR 鑒定結果表明，OE-1、OE-3、OE-4 和OE-7 為轉基因陽性株系（圖5A），利用qRT?PCR 檢測轉MsWRKY11基因紫花苜蓿的表達量，OE-1、OE-3、OE-4 和OE-7 株系的MsWRKY11基因表達量分別為野生型的8. 12、6. 38、19. 26 和2. 88 倍，為MsWRKY11超表達株系。

圖5 轉MsWRKY11 紫花苜蓿植株鑒定Fig. 5 Identification of transgenic alfalfa

2. 6 轉基因紫花苜蓿抗鹽性分析

2. 6. 1 過表達MsWRKY11紫花苜蓿在鹽脅迫下的表型分析 正常生長狀態下，野生型（wild type，WT）和4個轉基因株系（OE-1、OE-3、OE-4 和OE-7）均生長良好（圖6A），但在鹽脅迫下，WT 表現出株高較低、葉片發黃的表型，而轉基因株系呈現良好的生長表型，株高較高，葉色較綠（圖6B）。對其中3 個轉基因株系進行地上生物量（圖6C）和株高（圖6D）測定，均呈現出轉基因株系比WT 高的趨勢，表明MsWRKY11具有增加苜蓿抗鹽脅迫的功能。

圖6 鹽脅迫下MsWRKY11 轉基因株系的表型變化Fig. 6 Phenotype analysis of MsWRKY11 transgenic lines under salt stress

2. 6. 2 過表達MsWRKY11對鹽脅迫下紫花苜蓿膜脂過氧化的影響 過表達MsWRKY11能夠顯著降低鹽脅迫對紫花苜蓿的傷害。正常生長條件下，野生型和轉基因株系的相對電導率（圖7A）和MDA 含量（圖7B）無顯著差異，而鹽處理下，轉基因株系的電導率和MDA 含量顯著低于野生型，其中OE-3 電導率和MDA 含量最低。

圖7 鹽脅迫對過表達MsWRKY11 紫花苜蓿細胞膜脂過氧化的影響Fig. 7 Effect of overexpression of MsWRKY11 on membrane lipid peroxidation of alfalfa under salt stress

2. 6. 3 過表達MsWRKY11對鹽脅迫下紫花苜蓿抗氧化能力的影響 正常生長條件下，野生型和轉基因株系超氧陰離子含量無顯著差異（圖8B），但在鹽脅迫下，野生型苜蓿受到嚴重的氧化傷害，葉片NBT 染色（圖8A）后呈現出明顯的藍色，而轉基因苜蓿葉片的藍色較淺。野生型植株的超氧陰離子含量顯著高于轉基因株系，與NBT 染色結果一致。 鹽脅迫下，過表達株系的POD 和CAT 活性均顯著高于野生型（圖8C 和D），表明轉MsWRKY11基因紫花苜蓿的抗氧化脅迫性能明顯提高。

圖8 過表達MsWRKY11 對鹽脅迫下紫花苜蓿抗氧化脅迫能力的影響Fig. 8 Effects of overexpression of MsWRKY11 on alfalfa antioxidant ability under salt stress

2. 6. 4 鹽脅迫下過表達MsWRKY11對紫花苜蓿Na+含量和K+/Na+的影響 鹽脅迫下過表達MsWRKY11能夠顯著降低紫花苜蓿體內Na+含量，增加K+/Na+。鹽脅迫下轉基因株系OE-7 根系和葉片中Na+含量均顯著低于野生型（圖9A 和B），OE-3、OE-4 和OE-7 根系中K+含量高于WT（圖9C），OE-3 和OE-7 葉片中K+的含量高于WT，而OE-4 葉片中K+含量低于野生型，但差異不顯著（圖9D）。OE-3、OE-4 和OE-7 根系和葉片中K+/Na+高于野生型（圖9 E 和F），表明MSWRKY11能夠減少根系對Na+的吸收。

圖9 鹽脅迫下轉基因紫花苜蓿幼苗的K+、Na+含量和K+/Na+Fig. 9 Content of K+，Na+ and ratio of K+/Na+ in alfalfa seedlings under salt stress

2. 6. 5 鹽脅迫下過表達MsWRKY11對紫花苜蓿鹽脅迫相關基因表達的影響MsNHX1、MsSOS3、MsAPX、MsGRX、MsNAC和MsP5CS是6 個對鹽脅迫響應敏感，參與植物耐鹽調控途徑的基因。過表達MsWRKY11明顯改變了6 個關鍵基因（圖10）對鹽脅迫的響應模式，其中，在正常生長環境下，6 個基因在轉基因株系和野生型植株中的表達呈現高低相互變化的動態格局，但在鹽脅迫下，除MsSOS3在12 h 外，轉基因株系中6 個基因的表達量均高于野生型，表明鹽脅迫下MsWRKY11通過上調這6 個基因的表達，參與調控苜蓿對鹽脅迫的響應過程，從而提高轉基因苜蓿的耐鹽能力。

圖10 鹽脅迫下轉基因紫花苜蓿耐鹽相關基因的表達變化Fig. 10 Expression patterns of key genes related to salt stress in transgenic alfalfa under salt stress

3 討論

土壤鹽漬化作為作物生長的主要抑制因素，影響作物對水分和營養物質的吸收，引起細胞滲透脅迫，破壞細胞膜透性和細胞結構。土壤中高含量的鹽還會影響細胞對其他陽離子的吸收，間接導致作物營養缺乏，甚至造成單鹽毒害，嚴重影響作物的產量和品質［11］。提高作物的耐鹽性是作物育種的主要目標之一。WRKY 轉錄因子是最大的轉錄因子家族之一，大量報道［2?6，8?10］表明，WRKY 參與擬南芥、水稻、玉米等植物的鹽脅迫應答，但是關于紫花苜蓿WRKY 轉錄因子的研究鮮有報道。本研究利用同源克隆法從紫花苜蓿中克隆到MsWRKY11，蛋白序列分析發現MsWRKY11 與MtWRKY11 親緣關系最近，N 端具有WRKYGQK 保守序列，以及C2H2鋅指結構。諸多研究表明，植物的WRKY 轉錄因子參與激素和非生物脅迫應答，如大麥HvWRKY38受GA 誘導下調表達，受ABA 和JA 誘導上調表達［12］；AtWRKY25、AtWRKY28、AtWRKY40和AtWRKY70受鹽害、冷害和滲透脅迫的誘導［13］，AtWRKY75和OsWRKY72受高溫誘導迅速上調表達［14］。本研究發現，MsWRKY11響應NaCl、JA 和SA 的誘導，表明MsWRKY11參與鹽脅迫的應答。因此，本研究通過葉盤法得到MsWRKY11轉基因紫花苜蓿，并對其進行鹽脅迫處理，進一步研究MsWRKY11轉基因紫花苜蓿的抗鹽性。 結果表明，鹽脅迫下超表達MsWRKY11轉基因紫花苜蓿株系的株高和鮮重顯著高于野生型，并且野生型植株呈現出明顯的黃化現象，但轉基因株系生長狀況良好，無明顯黃化現象，這個現象與OsWRKY45和OsWRKY72過表達轉基因水稻表現一致［15］，說明MsWRKY11基因具有調控紫花苜蓿抗鹽脅迫的功能，超表達MsWRKY11能夠緩解鹽脅迫對紫花苜蓿的抑制作用。

鹽脅迫條件下，植物過度吸收Na+會干擾K+依賴的酶促過程，影響K+的吸收［16］，因此，維持細胞質高K+的能力是植物耐鹽性的關鍵決定因素之一［17?18］。為了進一步研究MsWRKY11轉基因株系耐鹽的生理機制，測定了鹽脅迫下紫花苜蓿葉片和根系中的K+和Na+含量。結果發現轉基因株系中Na+含量低于野生型，K+含量高于野生型，K+/Na+增高，說明MsWRKY11能夠阻止Na+進入細胞，緩解K+和Na+的競爭作用，促進K+攝取，維持苜蓿體內的K+/Na+內穩態，降低Na+離子毒性，與Li 等［19］的研究結果一致。

鹽脅迫條件下，植物細胞膜受到傷害，體內會產生大量活性氧，這是導致鹽脅迫下細胞過氧化和細胞凋亡的主要原因之一［20］。植物體內MDA 含量、超氧陰離子含量和電導率均能反映植物細胞膜受傷害的程度［21］。本研究中，鹽脅迫條件下轉基因株系和野生型的電導率、MDA 含量和超氧陰離子含量均有所增加，說明鹽脅迫使紫花苜蓿膜脂結構受到傷害，活性氧積累增加。但是轉基因株系葉片的電導率、MDA 含量和超氧陰離子含量均低于野生型，說明轉基因株系細胞膜的損傷程度較小。抗氧化酶系統的平衡直接影響植物對逆境的耐受能力，SOD、POD、CAT 等抗氧化酶在抗氧化系統中相互協調、共同作用達到清除活性氧的作用［22］。250 mmol·L?1NaCl 處理下，轉基因株系的CAT 和POD 酶活性明顯高于野生型，說明MsWRKY11超表達株系具有更高的活性氧清除能力，從而明顯降低了轉基因株系體內超氧陰離子含量，降低轉基因株系葉片的相對電導率和MDA 含量，減輕了膜系統的傷害，提高轉基因植株的耐鹽能力。

植物對非生物脅迫的響應受到多個基因調節，Chinnusamy 等［23］將這些基因分為兩類：第一類編碼功能蛋白，第二類參與信號轉導通路和表達調控過程。為了進一步探討MsWRKY11增強紫花苜蓿耐鹽機制，分析了與鹽脅迫相關的基因表達變化。谷氧還蛋白（GRX）是谷氧還蛋白系統的主要部分，與還原脫氫抗壞血酸、過氧化物氧還酶與甲硫氨酸亞砜還原酶等共同作用來發揮其抗氧化保護作用［24］。馬進等［25］對鹽脅迫下紫花苜蓿轉錄組的研究發現，MsGRX在鹽脅迫后上調表達，說明MsGRX參與苜蓿鹽脅迫應答。抗壞血酸過氧化物酶（APX）是抗壞血酸?谷胱甘肽循環中的關鍵酶，能夠清除植物體中的H2O2。已有研究表明APX的過表達能夠增強APX 酶活性，從而增強植物的抗逆性［26］。本研究中，鹽脅迫下APX的表達量迅速誘導表達，在處理6 h 表達量達到最大值，并且在0～48 h 內表達量呈現增長趨勢，OE-3 和OE-4 的表達量始終高于WT；在鹽處理各個時期GRX表達量均高于對照處理，在鹽處理12、24 和48 h 內OE-3 和OE-4 的表達量始終高于WT，說明鹽脅迫下過表達MsWRKY11會引起MsGRX和MsAPX上調表達，從而保護抗氧化酶的活性，有效地清除植物體內的過氧化物，調節細胞抗氧化系統的平衡，這與郭玉雙等［24］和Guo 等［27］的研究結果一致。植物中Na+/H+逆向轉運有兩種類型：質膜（SOS）和液泡膜（NHXs）Na+/H+逆向轉運。SOS1 負責排出細胞質中的Na+［28］，SOS3 和SOS2 能夠激活SOSl 的表達。NHX 是K+在細胞質和液泡之間轉運的中介，負責將細胞質的Na+轉運到液泡中，完成鹽的區隔化，減少細胞質中潛在的有害離子［29］。 超表達SOS1提高了擬南芥的耐鹽性［30］；耐鹽性更強的黃花苜蓿（Medicago falcate）MfSOS1表達量高于敏感型［31］。OsNHX1［32］、HvNHX1［33］和ZxNHX［34］都參與鹽脅迫應答，并在其中起到正向調控作用。本研究發現，鹽脅迫0～48 h 內OE-3 和OE-4 中MsNHX1的表達量均高于野生型。鹽處理6 h 時WT 葉片中SOS3的表達量高于OE-3 和OE-4，但是在處理24 h 后，WT 中SOS3的表達量迅速下降，低于OE-3 和OE-4，說明MsWRKY11超表達引起鹽脅迫株系MsNHX1和MsSOS3上調，將胞質中的Na+更多地轉移到液泡中，保護細胞不受滲透脅迫。NAC 是非常重要的一類轉錄因子，響應干旱、高鹽、低溫、滲透等非生物脅迫，并在脅迫應答和調節中起重要作用。 水稻OsNAC2/6/10均能響應鹽脅迫，增強水稻的耐鹽能力［35?36］。黃花苜蓿MfNAC4通過調控鹽脅迫響應基因MtZpt2-1提高了其鹽耐受性。本研究中轉基因株系的MsNAC的表達在鹽脅迫下顯著提高，而野生型中MsNAC對鹽脅迫的響應程度低于轉基因株系，因此，本研究推測MsWRKY11引起鹽脅迫下NAC 轉錄因子上調表達，從而激活了其下游鹽耐受基因的表達，增強了轉基因苜蓿的耐鹽性。P5CS基因是脯氨酸合成過程中的重要調控基因［37］，Ginzberg 等［38］的研究表明MsP5CS基因能夠被鹽脅迫誘導激活，并在鹽脅迫應答中起調節作用。在鹽處理0～48 h 內轉基因株系的MsP5CS表達量均高于野生型，說明MsWRKY11超表達引起的MsP5CS表達上調可能會導致脯氨酸合成增加，從而增加轉基因苜蓿體內的脯氨酸含量，調節滲透勢，降低鹽脅迫傷害。

4 結論

本研究從紫花苜蓿中克隆得到MsWRKY11，超表達MsWRKY11顯著降低了鹽脅迫下轉基因紫花苜蓿根和葉的Na+含量以及鹽脅迫對細胞造成的膜脂過氧化傷害，提高了苜蓿地上生物量和株高，增強了紫花苜蓿的抗鹽脅迫能力，為揭示紫花苜蓿的抗鹽機制和耐鹽分子輔助育種提供指導。