馬杜羅茄衣發酵過程中外觀顏色和內在成分的變化及相關性分析

丁寧，丁松爽，胡捷，吳創，王榮浩，時向東*

1 河南農業大學，煙草學院，河南省鄭州市金水區農業路63號 450002；

2 湖北中煙工業有限責任公司三峽卷煙廠，湖北省宜昌市夷陵區黃金路46號 443100

茄衣是外觀判斷雪茄品質和風味特征的依據之一，一般認為茄衣顏色由淺至深代表著雪茄口感由清淡至濃郁[1]。馬杜羅茄衣是一種特殊類型的茄衣，其色澤油亮、顏色較深、身分偏厚，往往被用作紀念版或限量版等高檔雪茄的茄衣，并逐漸成為近年來國際上雪茄的流行色，以表明雪茄的醇厚口感。

煙葉的顏色是其化學成分與質量的外在表現[2]。近年來，研究人員通過基于CIE色度學理論的計算機圖像處理和色差計對煙葉顏色進行量化，發現煙葉表面顏色參數變化與內在化學物質及質體色素之間存在顯著的相關性[3-6]。但迄今為止，針對雪茄茄衣外觀顏色變化的研究主要集中在煙葉調制階段，對于發酵期間茄衣顏色的變化情況未見報道[7-9]，而馬杜羅茄衣正是通過后期深度發酵才體現出其特殊的品質特點的。發酵可以促進茄衣內含物質進一步轉化，使茄衣顏色變深、油潤感和光澤感提高，煙葉內在化學成分更為協調，抽吸醇厚感增加[10]。海南3號品種茄衣顏色厚重、油分充足、耐發酵性好，是優質的馬杜羅茄衣原料。本文以海南3號為試驗材料，研究了馬杜羅茄衣發酵過程中顏色參數值及化學成分、質體色素的變化，并對馬杜羅茄衣顏色形成因素進行相關分析，旨在為優化馬杜羅茄衣發酵工藝提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在海南儋州光村雪茄煙種植基地進行，植煙土壤類型為砂壤土。供試雪茄煙品種為海南3號，遮陰種植。田間管理、采收、調制、初次發酵按當地《馬杜羅茄衣生產技術規程》進行。

1.2 試驗方法

按照海南建恒哈瓦那雪茄有限公司《雪茄煙葉分級標準》對已完成初次發酵的煙葉進行精確分級，得到茄衣等級的煙葉，保證等級內純度一致。對茄衣等級煙葉進行再次分選，得到3種厚度的茄衣，即：薄茄衣（厚度0.020～0.035 mm）、中厚茄衣（厚度0.035～0.050 mm）、厚茄衣（厚度0.050～0.065 mm），每個處理各7 kg。對煙葉進行回潮處理，控制煙葉含水率為26%±1%。而后將煙葉置于恒溫恒濕箱內進行二次發酵。發酵溫度設置為45℃，濕度為80%。自發酵之日開始取樣，每隔5 d取一次，每次1 kg，直到30 d發酵結束為止。

1.3 測定方法

1.3.1 茄衣顏色測定

在每次取出的樣品中，挑選具有代表性的10片煙葉，進行顏色參數測定。采用HP-C210色差儀，先對儀器進行黑白版校正，在煙葉一側葉緣與主脈間的中點所連成的曲線上，分別于葉長的1/3、1/2和2/3處進行測定，每片煙葉兩側共測定6個位點。測量時將煙葉正面朝上置于黑色背景板上，取點時保證煙葉平展。測定的色度學指標包括L*值（明度值）、a*（紅綠色度值，正值代表紅色度，負值代表綠色度） b*值（黃藍色度值，正值代表黃色度，負值代表藍色度），并計算C值（飽和度）、H值（色澤比）和H°值（色相角）。計算公式為：

飽和度（C）=（a2+b2）1/2；色澤比 （H）= a/b；色相角（H°）= arctan（b/a）。

1.3.2 茄衣化學成分測定

總糖、還原糖、總氮、煙堿、鉀、氯含量的測定采用流動分析法[11]，葉綠素、類胡蘿卜素含量的測定采用分光光度法[12]，每次測定重復3次。

1.3.3 數據分析

采用Microsoft Excel 2010、SPSS24.0和Origin2018進行數據處理、統計分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 茄衣煙葉發酵過程中顏色參數值的變化

由圖1可知，三個處理煙葉顏色參數值隨發酵進程的推進呈波動下降的趨勢。就明度值L*（圖1-A）而言，茄衣身份越厚明度值越低，并且在發酵過程中明度值下降趨勢也越平緩。發酵前后相比，薄、中厚、厚茄衣明度值均有極顯著差異，說明發酵促使煙葉顏色轉深。進一步分析發現，煙葉紅綠值a*（圖1-B）與黃藍值b*（圖1-C）的變化情況與明度值L*略有不同，即在發酵20 d或25 d達到最低值后稍有回升。

圖1 發酵過程中茄衣煙葉顏色參數值的變化Fig. 1 Changes of color parameter values of wrapper tobacco leaves during fermentation

其中，厚茄衣a*、b*值最低點均出現在發酵25 d，此后依次回升11.5%和3.2%。色相角H°、飽和度C、色澤比H由L*、a*、b*值計算得出，發酵期間煙葉色相角與色澤比波動較大，飽和度前期下降后期升高，與a*、b*的變化趨勢相一致。

2.2 茄衣煙葉發酵過程中化學成分的變化

由圖2可知發酵過程中，不同厚度茄衣煙葉的化學成分變化較為一致。就相對含量而言，同一發酵天數時，煙葉總糖、總氮、煙堿含量在不同處理間排序為：厚茄衣＞中等茄衣＞薄茄衣，而鉀含量情況與之相反，薄茄衣含量最高。較厚的煙葉雖然內含物質豐富，但鉀含量較低，生產中使用茄衣時應考慮品質特征與燃燒性的協調。隨著發酵的進行，水溶性總糖含量逐漸降低（圖2-A），而還原糖含量先升高后下降（圖2-B）。說明在發酵的前中期大分子糖類物質水解速率較快，還原糖生成量高于轉化量。茄衣煙葉氯含量在發酵期間的變化趨勢不明顯，但發酵后含量顯著高于發酵前（圖2-F），這是煙葉本身干物質的量經發酵后降低所導致的。

圖2 發酵過程中茄衣煙葉化學成分含量變化Fig. 2 Changes of contents of chemical components in wrapper tobacco leaves during fermentation

2.3 茄衣煙葉發酵過程中質體色素含量的變化

圖3為發酵過程中茄衣煙葉質體色素含量的變化。可以看出，各類質體色素含量均隨發酵的進行呈現降低的趨勢。其中，葉綠素a、b含量在發酵過程中始終表現為薄茄衣＞中等厚茄衣＞厚茄衣。進一步比較發現，三類茄衣葉綠素a及類胡蘿卜素含量變化相似，即薄茄衣與中等厚茄衣質體色素含量下降速度較大，且呈現“快—慢—快”的特點；厚茄衣質體色素含量降幅較低，其值依次為17.1%和29.5%。

圖3 發酵過程中茄衣煙葉質體色素含量的變化Fig. 3 Changes of plastid pigment content in wrapper tobacco leaves during fermentation

2.4 茄衣煙葉發酵過程中顏色參數與化學成分及質體色素含量的關系分析

2.4.1 描述性統計分析

從表1可以看出，按照變異系數劃分等級：總氮、氯、鉀及顏色參數中的L*、b*、C、H°為弱變異性（變異系數≤10%），其余指標為中等變異性（變異系數在10%～100%）[16]。類胡蘿卜素的偏度稍大，其余指標偏度值絕對值均小于1，基本符合正態分布。

表1 茄衣煙葉化學成分、質體色素含量和顏色指標等變量的描述性統計分析Tab. 1 Descriptive statistical analysis of variables such as chemical composition, plastid pigment content and color index of wrapper tobacco leaves.

2.4.2 簡單相關分析

為研究茄衣發酵過程中產生顏色變化的原因，進行了茄衣煙葉顏色參數與化學成分、質體色素含量之間的相關性分析（表2）。結果表明，各項顏色指標與多種化學成分、質體色素間存在相關性。其中，明度值（L*）分別與還原糖、總氮和煙堿含量呈極顯著和顯著負相關，與鉀、葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均呈極顯著正相關。說明隨著還原糖、煙堿、總氮含量的升高，煙葉顏色變深，隨著鉀、質體色素含量的升高，煙葉顏色變淺。紅綠值（a*）與總糖含量呈極顯著正相關，與煙堿含量呈顯著正相關；黃藍值（b*）與總氮含量呈極顯著負相關，與葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均呈極顯著正相關。而各項顏色參數與氯含量間相關性不顯著，說明氯含量對煙葉顏色的影響較小。

表2 發酵過程中煙葉顏色參數與化學成分及質體色素含量間的簡單相關系數Tab. 2 Simple correlation coefficient between tobacco leaf color parameters, chemical composition and plastid pigment content during fermentation

2.4.3 典型相關分析

為進一步分析茄衣顏色變化與化學成分的關系，采用SPSS24.0對發酵過程中茄衣煙葉的總糖(X1)、還原糖(X2)、煙堿(X3)、總氮(X4)、鉀(X5)、葉綠素a(X6)、葉綠素b(X7)、類胡蘿卜素(X8)與L*(Y1)、a*(Y2)、b*(Y3)、C(Y4)、H(Y5)、H°(Y6)等顏色參數進行典型相關分析（表3）。

表3 茄衣煙葉發酵過程中顏色參數與化學成分及質體色素含量的典型相關分析Tab. 3 Typical correlation analysis of color parameters, chemical components and plastid pigment content during the fermentation process of wrapper tobacco leaves

續表3

表3顯示，茄衣顏色參數與化學成分和質體色素含量的典型相關分析提取到6組典型變量，其中，第1組典型變量的相關系數達為0.988，達到極顯著水平（P<0.01），第2組典型相關系數為0.920，達到了顯著水平 （P<0.05），其余組不顯著。

得第1組典型變量為：

u1=0.4 9 7 X1+0.0 8 6 X2-0.2 9 9 X3+0.1 6 9 X4-0.402X5+1.014X6-0.093X7+0.332X8；

v1=0.915Y1-5.003Y2+0.235Y3+3.447Y4+2.48Y5-0.913Y6。

在典型變量（u1，v1）中，u1代表了茄衣煙葉的化學成分和質體色素含量情況，由u1與原始數據的相關系數可知，X4（-0.889）、X6（0.939）、X7（0.912）、X8（0.794）的載荷較大。v1代表了茄衣煙葉的顏色參數變化情況，由v1與原始數據的相關系數可知，Y1（0.971）的載荷較大。但由于X7的系數與相關系數互為反號，所以其在u1中是校正（或抑制）變量[13]，本文不予分析。因此，第1組典型變量可理解為，在一定范圍內隨著葉綠素a、類胡蘿卜素含量的降低以及總氮的升高，明度值 L*呈降低趨勢。

得第2組典型變量為：

u2=-1.478X1+1.035X2-0.861X3+0.371X4-0.969X5+1.401X6-1.1X7+0.29X8；

v2=-0.247Y1+1.02Y2+38.507Y3-37.501Y4+28.936Y5+18.478Y6。

從第2組典型變量可以看出，除去校正（抑制）變量后，化學成分與質體色素含量中X1（-0.53）、X7（-0.316）的載荷較大，顏色參數中Y4（-0.546）、Y6（0.53）載荷較大。因此，第2組典型變量可理解為，在一定范圍內隨著總糖和葉綠素b含量的降低，引起飽和度C的降低和色相角H°的升高。

3 討論

茄衣是一支成品雪茄質量的直觀體現。優質馬杜羅茄衣一般由深度發酵法生產，發酵后的茄衣色澤更深，有利于提高煙葉可用性[14]。有研究表明，采用CIE色度系統可以對煙葉顏色進行量化，發酵期間煙葉顏色的變化可以通過色差參數反映[15-16]。本研究也就發酵期間馬杜羅茄衣煙葉顏色的變化進行了分析，發現不同厚度茄衣的明度值具有顯著差異，這與王浩雅等人[17]的研究結果一致。前人研究結果顯示明度值與煙堿含量、鉀含量分別呈極顯著負相關和極顯著正相關[5]，而隨煙葉厚度的增加，煙堿含量與鉀含量分別有上升和下降的趨勢[18-19]，從而分析明度值應當與煙葉厚度呈負相關關系，本研究結果也證明了這一點。茄衣煙葉發酵后期的紅綠值與黃藍值有所回升，這與烤煙相關研究結果不同[20-21]，究其原因可能是雪茄煙需要通過發酵這一步驟促進煙葉積累的營養物質分解轉化，進而提高煙葉品質[22]，而在20～25 d煙葉發酵的程度已趨于完善，多酚、氨基酸等無色的香氣前體物質因棕色化反應產生的棕褐色物質逐漸積累，引發了煙葉紅度和黃度的升高[23]。

前人研究結果普遍認為有兩方面的原因導致煙葉發酵過程中產生顏色變化。其一，煙葉的顏色變化是其內含物分解和轉化等生理生化變化的外在反映[24-25]。在本試驗中，隨著發酵的進行，煙葉總糖含量逐漸降低，這是由于糖類被逐步氧化或參與了酚、醇類的反應生成香氣物質；煙堿含量同樣隨著發酵的進行逐漸降低，主要是游離態的煙堿揮發所引起的[26]。與總糖不同，還原糖含量隨著發酵的進行呈現單峰變化，這可能是發酵前期淀粉等多糖降解速度較快，使還原糖含量暫時升高[27]。鉀含量在發酵過程中呈現先增后減的變化趨勢，與前人[28-29]研究結果相吻合。這可能是由于煙葉中一些有機復合物的形成有金屬元素參與，隨著適宜條件下有機復合物的揮發，金屬元素的絕對含量有所降低[30]。總氮含量與氯含量呈現波動上升的變化情況，可能是由于碳水化合物、有機酸等物質放出CO2及其他物質的逸失，導致干物質總量降低，總氮、氯含量相對上升[20]。總體而言厚茄衣的變化幅度較低，這與莫嬌等人[31]研究結果一致，可能是由于厚茄衣內含物質豐富，降解速率較慢。其二，質體色素含量的變化是煙葉顏色的主要影響因素之一，并且是重要的香氣前體物質[32]。隨著發酵的進行，煙葉各類質體色素含量均呈現逐步降低的變化趨勢，與張曉娟[33]、趙奕熹[34]等人研究結果一致，這是由于發酵期間煙葉內生理生化反應仍在進行，質體色素被分解為新植二烯、β-大馬酮、紫羅蘭酮等香氣物質。上述兩方面的結果表明，化學成分、質體色素的變化與顏色參數變化相似，即雖然不同厚度茄衣中上述物質的含量有差異，但其總體變化情況較為一致。這說明盡管茄衣厚薄并不影響發酵過程中煙葉內含物分解轉化的方向，但生產中仍應考慮茄衣厚度不同造成的發酵程度差異。

煙葉各類性狀指標間雖然存在關聯性，但密切程度不同，因此利用典型相關分析的方法尋找影響煙葉顏色的主要化學成分[35]。典型相關分析中第1組典型變量表明，在一定范圍內；隨著葉綠素a、類胡蘿卜素含量的降低以及總氮含量的升高，明度值 L*呈降低趨勢，這主要是因為總氮含量可以反映煙葉內含物質的量，通常來說，具有豐富內含物質的煙葉顏色較深[36]，而葉綠素a、類胡蘿卜素作為有色物質其含量直接影響煙葉顏色的深淺[37]；第2組典型變量表明，飽和度C和色相角H°受化學成分中的總糖和葉綠素b含量影響較大，由典型載荷可以得出，在一定范圍內：隨著總糖和葉綠素b含量的降低，引起飽和度C的降低和色相角H°的升高。由典型相關分析結果可以看出，煙葉顏色與化學成分間具有密切的聯系，可以通過調控煙葉化學成分來影響茄衣的外在顏色。

目前，國產馬杜羅茄衣較為少見，本試驗通過研究馬杜羅茄衣在深度發酵過程中的外觀顏色和內在成分的變化及關系，為工業企業的實際應用提供理論參考。由于本試驗僅局限于“海南3號”品種煙葉，如何針對不同素質煙葉調控發酵工藝以改善煙葉內含物質、進而達到改善馬杜羅茄衣工業使用目的，將是今后的研究重點。

4 結論

隨著發酵的進行，茄衣煙葉顏色參數值（L*、a*、b*、C*）均呈下降趨勢，不同厚度茄衣間明度值差異顯著。隨著發酵時間增加，茄衣中總糖、煙堿和質體色素含量逐漸降低；還原糖與鉀含量呈單峰變化；總氮與氯含量波動上升。除氯含量外，煙葉各項化學成分均與多項顏色參數間存在密切的關系。通過適宜的發酵可以達到改善茄衣煙葉顏色的目的。