慢性骨髓炎感染屏障的機理研究

謝丹 林振恩 廖才杰 林志文 周騰祥 許金言

慢性骨髓炎病程長，病情遷延，一直是臨床治療過程中一個棘手的難題。雖然抗菌治療在大多數感染性疾病中應用效果較好，但由于骨骼的特殊生理和解剖特點，慢性骨髓炎治療仍然十分困難。研究顯示，抗生素在病灶內達到并保持有效抑菌濃度對于治療的成功至關重要[1]。目前研究及臨床中更多的是通過改進局部給藥的方法，提供持續的藥物濃度，來提高治療骨髓炎療效。但骨髓炎常規用藥途徑療效不佳，機理尚不清楚。有人認為是細菌分泌合成胞外多聚物，即細菌生物膜覆蓋于組織表面抵御抗生素的作用和機體的免疫反應，但這一認識仍然無法解釋慢性骨髓炎相較于其他組織慢性炎癥對于抗生素等治療更不敏感性的原因。本研究試圖從另外的角度做一探討，即探討微血管是否是慢性骨髓炎病理過程中的屏障及治療過程中的瓶頸。本實驗采用開窗注入金黃色葡萄球菌法制成慢性骨髓炎兔模型，觀察病理情況下微血管密度（microvessel density，MVD）的變化及髓內植入萬古霉素骨水泥對髓腔內金黃色葡萄球菌的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

金黃色葡萄球菌ATCC 6538（廣東環凱生物），5%魚肝油酸鈉注射液（上海東海制藥廠，每支2 mL∶0.1 g）。鼠抗兔CD34單抗（abcam公司，英國）；骨水泥（強生公司，美國）。

1.2 分組和造模

健康雄性成年新西蘭大白兔30只，體質量（2.50±0.3）kg，清潔動物，由福建中醫藥大學動物實驗中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（閩）2014-0006。隨機分成分為三組：假手術組10只，慢性骨髓炎模型組10只，萬古霉素骨水泥組10只，術前適應性飼養7 d。慢性骨髓炎模型制作方法[2]：將兔以烏拉坦靜脈麻醉，麻醉成功后取右脛骨內側縱切口3 cm，切開皮膚、皮下組織，顯露右脛骨近端內側，剝離局部骨膜后用3 mm鉆頭的手鉆在該處鉆2個縱向相連、部分重疊的骨洞，用小刮匙刮除松質骨，修整骨洞邊緣，制成6 mm×3 mm的矩形骨窗，于骨窗內注入金黃色葡萄球菌0.1 mL，金黃色葡萄球菌使用前以比濁儀生理鹽水稀釋成1×108cfu/mL，無菌骨蠟封閉骨窗，生理鹽水沖洗后縫合傷口，術后繼續回籠常規喂養4周。4周后慢性骨髓炎模型組和萬古霉素骨水泥組檢測骨窗細菌培養陽性證實造模成功。假手術組動物單純以上述方法造成骨窗，不予金黃色葡萄球菌注入，慢性骨髓炎模型組植入骨水泥，萬古霉素骨水泥組植入萬古霉素骨水泥，再經過4周后，各組動物取脛骨感染段骨質進行指標檢測。

1.3 萬古霉素骨水泥植入件制作

按馬金超法[3]將聚甲基丙烯酸甲酯以一定比例混合制作成長6 mm、寬3 mm、高3 mm長方體植入件，含萬古霉素（0.024±0.002）g，室溫下保存放置24 h，予環氧乙烷消毒2 h后備用。

1.4 組織學觀察

在兔脛骨近端取出萬古霉素骨水泥植入件后，截取脛骨骨窗橫斷面，4%甲醛溶液固定，脫鈣，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察三組骨髓微血管情況。對每張切片進行骨髓MVD計數：低倍鏡（100×）視野下選出血管最豐富的3個不相連區域，然后在高倍鏡下（400×）計數3個熱點（微血管密集區hot spot）的微血管數，取其平均值即為MVD。任何呈棕黃色陽性的內皮細胞或內皮細胞簇，且與鄰近血管和骨小梁清楚分開者為1個能夠計數的血管。

1.5 免疫組織化學染色檢測骨髓MVD

石蠟切片經脫蠟和水化后，按免疫試劑盒說明書加一抗鼠抗兔CD34單克隆抗體、二抗通用型標記IgG、辣根過氧化物酶標記、DAB顯色、復染、脫水、封固等步驟，在顯微鏡下觀察CD34陽性染色微血管情況，血管內皮細胞的細胞質呈棕黃色為陽性染色[4]。在低倍鏡視野（100×）下計數新生骨區域CD34表達陽性的微小血管，記錄5個視野內微小血管數，取其平均值作為MVD值。然后在高倍鏡下（400×）計數3個熱點（微血管密集區hot spot）的微血管數，取其平均值即為MVD。任何呈棕黃色陽性的內皮細胞或內皮細胞簇，且與鄰近血管和骨小梁清楚分開者為1個能夠計數的血管。高倍鏡下（200×）計數5個視野中的微血管數，取其均值。結果判斷標準：胞質內出現棕黃色顆粒的陽性細胞數＜5%為陰性，5%～25%為弱陽性，>25%為強陽性；微血管密度的判定參照weidner標準[4]。

1.6 骨髓細菌量檢測

截取脛骨骨窗骨斷面組織進行稱量，置于無菌勻漿器內，加入適量生理鹽水，使其成10-1稀釋度（W/V）。在恒速下進行勻漿，將內管上下移動使組織充分攪碎，然后按一定濃度將稀釋液接種及瓊脂培養基上，培養48 h（恒溫37°C）而后取出統計細菌落數，計數細菌總數，即得每克組織的細菌數[5]。每克骨細菌數（cfu/g）=同一稀釋度的平均菌落數（cfu）×稀釋倍數。

1.7 統計學處理

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析，計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗；計量資料以（）表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織學觀察

假手術組可見髓內微血管內膜光滑，血管腔未見狹窄，內皮細胞結構正常，內皮細胞、內彈性膜、中層平滑肌細胞均排列整齊，胞質呈嗜酸性紅染，細胞核形態正常。慢性骨髓炎模型組可見出現嚴重骨質破壞，膿液穿透骨質，髓腔內黃白色膿液形成；可見死骨形成及大量炎性細胞浸潤，微血管管腔不規則狹窄，內膜增厚，內皮細胞、內彈性膜、中層平滑肌細胞排列紊亂，血管周圍組織可見明顯炎癥改變。萬古霉素骨水泥組較模型組微血管病變程度輕，內膜較光滑，但與假手術組比較，內皮細胞排列不整齊，細胞核形態不規則。

2.2 各組MVD計數比較

與假手術組比較，慢性骨髓炎模型組MVD明顯下降，比較差異有統計學意義（P＜0.05），分布較為稀疏；與慢性骨髓炎模型組比較，萬古霉素骨水泥組在4周后MVD明顯上升，比較差異有統計學意義（P＜0.05），萬古霉素骨水泥組與假手術組相比差異無統計學意義（t=1.31，P＞0.05），見表1。

表1 各組MVD計數比較（個/HP，）

表1 各組MVD計數比較（個/HP，）

注：*與假手術組比較，#與慢性骨髓炎模型組比較

2.3 慢性骨髓炎模型組和萬古霉素骨水泥組感染段骨髓4周后局部金黃色葡萄球菌殘留菌量比較

與慢性骨髓炎模型組比較，萬古霉素骨水泥組經4周髓腔植入萬古霉素骨水泥治療，感染段骨髓金黃色葡萄球菌殘留菌量呈現顯著性下降，比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 慢性骨髓炎模型組和萬古霉素骨水泥組感染段骨質4周后局部金黃色葡萄球菌殘留菌量比較（cfu/g，）

表2 慢性骨髓炎模型組和萬古霉素骨水泥組感染段骨質4周后局部金黃色葡萄球菌殘留菌量比較（cfu/g，）

3 討論

在骨感染的抗生素治療上，有針對性的治療和高效率的治療一直是兩個關鍵的環節[6-7]。前者依賴于藥物敏感性試驗，并選擇適當的抗生素。后者則依賴于藥物遞送系統的通暢。機體的血管系統是體內藥物遞送的主要途徑，微血管系統是藥物通達器官的最后通路，各種生理病理因素均可影響藥物作用。如果微血管系統不通暢或者病變，向骨髓內的遞藥也將中斷。微血管密度是指生物組織中單位面積的微血管數量，近年來常用來作為評價組織局部血管生成或破壞的量化指標。腫瘤患者的血管生成研究一直臨床研究熱點，但是，其他如慢性骨髓炎的微血管密度情況及其對臨床的意義仍然缺乏深入的認識。從慢性骨髓炎的發病過程來看，細菌侵入骨骼，誘發機體的炎癥反應，局部產生了大量的炎性因子、破骨細胞，造成了炎性細胞的浸潤，這些破壞性細胞及分子對于微血管也產生了很大的影響[8-9]。本實驗對骨MVD的檢測顯示慢性骨髓炎的MVD較正常處于下降狀態，這可能反映了慢性炎癥對微血管的破壞性，這將導致機體自然遞藥過程的低效。微血管密度的研究對于慢性骨髓炎治療方法的促進具有啟示意義，很好地解釋了敏感的抗生素仍然無法達到骨髓內MIC濃度，故病情遷延不愈、竇道反復流膿。這可能是慢性骨髓炎面臨治療屏障的又一機理。

當然，細菌產生生物膜的問題，則是影響慢性骨髓炎療效的另一機理。為了尋求髓藥濃度大幅提升，增強抗菌效能，使用載體系統髓內植入作為局部遞送抗生素的介質來治療骨髓炎的情形近年來越來越普遍。這種輸送系統可在感染部位持續提供較高濃度的抗生素，并降低毒性和耐藥性[10-12]。PMMA骨水泥是常見的一種載體，研究證實，這種載體是骨髓炎藥物治療的有效選擇。本文中萬古霉素骨水泥組就是以髓內遞藥的方式使髓腔內達到并保持有效抑菌濃度才可能將感染段骨質中殘留金黃色葡萄球菌數減至最低的。當然，最佳劑量和更均勻的釋放仍然有待進一步的研究。

慢性骨髓炎微血管密度降低，血管數減少與細菌在病灶中殘留數呈負相關，筆者認為，抗生素通過微血管進入骨髓內的效能降低是慢性骨髓炎治療遷延的機理之一，是骨髓炎治療中的一個病理障礙，因此，通過清創、局部使用抗生素或使用促血管生成的藥物等方法或將有為縮短慢性骨髓炎治療時間和防止復發提供新的思路和方法。