靈芝三萜對鼻咽癌小鼠免疫功能及T細胞亞群分化的影響

王 松，王玲玲，阿依恒·曲庫爾汗

（新疆醫科大學第一附屬醫院，新疆 烏魯木齊 830054）

鼻咽癌是發生于鼻咽腔側壁、頂部的惡性腫瘤，常見表現為鼻塞、耳悶堵感、頭痛、聽力下降、涕中帶血等，對患者健康、生命構成了威脅[1]。目前，鼻咽癌主流療法為同步放化療，療效尚可，但對免疫系統造成了極大破壞，不利于康復、轉歸[2]。有研究表明[3]，鼻咽癌發病與免疫功能下降有關，因而增強鼻咽癌患者免疫功能是改善預后的途徑之一。靈芝是擔子菌綱多孔科靈芝屬真菌，為補益類中藥，有扶正固本、延年益壽等功效。研究發現[4]，靈芝及其提取物有抗腫瘤、降血脂、增強免疫力等作用。靈芝三萜是靈芝重要組成成分，靈芝的多種藥理活性與其相關。故本研究擬觀察靈芝三萜對鼻咽癌小鼠模型免疫功能的影響，以期為靈芝三萜用于鼻咽癌免疫治療提供理論依據。

1 材 料

1.1 實驗動物4周齡SPF級Balb/c小鼠65只，雌雄各半，體質量20～25 g，購自南方醫科大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK（粵）2016-0015。實驗前適應性飼養1周，飼養條件為室溫22～26℃，濕度40%～60%，自然光照，自由攝食水。本實驗經醫學實驗動物管理委員會批準，批準號：20190511。

1.2 細胞株人低分化鱗狀上皮鼻咽癌細胞株CNE-2，購自南方醫科大學附屬第一醫院生物研究室。

1.3 藥物與試劑靈芝三萜（純度＞99%，日本第一藥品產業株式會社，批號：20181209）；重組人干擾素α1b注射液（北京三元基因藥業股份有限公司；批準文號S20040010）。小鼠免疫球蛋白A（Immunoglobulin A，IgA）ELISA檢測試劑盒（批號：20190922）、免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）ELISA檢測試劑盒（批號：20190813）、免疫球蛋白M（Immunoglobulin M，IgM）ELISA檢測試劑盒（批號：20190907）均購自武漢華美生物工程有限公司；白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）ELISA檢測試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：20190821）；轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）ELISA檢測試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：20190719）。

1.4 主要儀器GB204型電子天平（瑞士特勒公司）；SAF-680T酶標儀（上海旦鼎國際貿易有限公司）；Cytomics TM FC500型流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）。

2 方 法

2.1 分組與造模65只Balb/c小鼠留取10只作為對照組，不作任何處理，其余建立鼻咽癌小鼠模型[5]，將小鼠置入24 h光照調節動物飼養箱內飼養3周，取CNE-2鼻咽癌細胞在5%CO2、37℃條件下的RPMI培養基中培養，每隔2 d傳代1次，收集對數生長期腫瘤細胞系細胞，胰酶消化，1 500 r/min離心5 min，計數后配制成1.0×107個/mL單細胞懸液。無菌條件下，小鼠右側背部皮下接種單細胞懸液，10 d后小鼠右側背部皮下出現可觸及綠豆大小的腫瘤塊，往后每隔1周測量1次腫瘤直徑，接種21 d時腫瘤體積在100 mm3以上表示建模成功。55只小鼠共建模成功44只，隨機分為模型組、干擾素組、低劑量組、高劑量組，每組11只。

2.2 實驗給藥低、高劑量組大鼠分別灌胃給予靈芝三萜溶液，劑量分別為25、50 mg/kg，灌胃體積均為0.2 mL/10 g，1次/d；干擾素組大鼠肌內注射40 000 U/mL重組人干擾素α1b注射液，隔天1次；模型組、對照組大鼠灌胃給予生理鹽水，0.2 mL/10 g，1次/d；各組大鼠均干預4周。

2.3 觀察指標

2.3.1 腫瘤質量、抑瘤率、胸腺指數、脾臟指數 干預4周后，觀察小鼠精神狀態、二便、飲食、毛色、活動情況等方面指標，每周測定1次小鼠背上腫瘤體積變化，并記錄數據。末次給藥24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，剝離腫瘤、胸腺、脾臟，腫瘤剝離后立即浸入10%多聚甲醛溶液中固定，稱重后計算抑瘤率、胸腺指數、脾臟指數。抑瘤率=（模型組腫瘤質量-治療組腫瘤質量）/模型組腫瘤質量×100%；胸腺（脾臟）指數=胸腺（脾臟）質量（mg）/體質量（g）。

2.3.2 血清IgA、IgG、IgM、IL-10、TGF-β 小鼠頸椎脫臼處死前，眼球取血，EDTA抗凝，室溫靜置0.5 h，3 000 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，取上清液。參考ELISA試劑盒說明書，采用雙抗體夾心法檢測，配置IgA、IgG、IgM、IL-10、TGF-β標準品，采用標本稀釋液按1:2 000比例稀釋，取標準品各50 μL依次加入酶標板一排6孔內，其他各孔加入稀釋液稀釋的小鼠血清50 μL。加入50 μL生物素標記的抗體，加蓋后37℃反應1 h。棄液甩干，洗板5次，每次浸泡1～2 min，200 μL/孔，甩干，依序每個孔加入底物溶液90 μL，37℃避光顯色20 min，依序加終止液50 μL，終止反應。酶標儀在450 nm波長依序測量各孔光密度值（OD值），加入終止液后15 min內檢測，實驗3次，取平均值。

2.3.3 小鼠脾臟T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+檢測 取小鼠脾臟，剔除結締組織、脂肪組織，稱重后置于尼綸網上，再將尼綸網置入PBS液，輕壓脾臟組織，將單個核細胞經網置入PBS液，吸取PBS液置入15 mL離心管內，2 000 r/min離心5 min，離心半徑10 cm，棄上清，加入1 mL PBS，震蕩混勻，離心后棄上清，加入PBS，調整細胞濃度為107個/mL。取流式管，加入CD3e FITC抗體1 μL、CD4 PE抗體0.625 μL、CD8a PE-Cy5抗體0.625 μL，再加入107個/mL脾細胞懸液100 μL，混勻后加入流式管（已預先加入了流式抗體），混勻后避光孵育15 min，再加入OptiLyseC 500 μL，立刻混勻，劇烈震蕩30 s，室溫避光孵育15 min，加入1 mL PBS，混勻后1 000 g離心5 min，離心半徑10 cm，棄上清，細胞沉淀加入500 μL流式鞘液重懸，上機檢測，實驗3次，取平均值。對淋巴細胞作FICT、PE、PE-Cy5熒光強度檢測，其中FICT為熒光1（FL1），PE為熒光2（FL2），PE-Cy5為復合熒光4（FL4）。

2.4 統計學方法采用SPSS 20.0統計學軟件分析，計量資料以（±s）表示，腫瘤體積、腫瘤質量、抑瘤率、胸腺指數、脾臟指數、免疫球蛋白水平及脾T淋巴細胞亞群指標水平均經Levene檢驗提示方差齊，進行單因素方差分析和LSD-t比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 各組小鼠一般狀況對照組小鼠毛色、二便、飲食、活動狀態均正常，體形無明顯改變。55只建模小鼠第10天時，44只小鼠體內出現大小不等的腫瘤結節，成瘤率為80.00%（44/55）。與對照組小鼠比較，模型組小鼠行動遲緩，皮毛蓬松無光澤，飲食下降，腫瘤體積逐漸增大，體質量因瘤體增大而增加；低劑量組、高劑量組和干擾素組小鼠行為、皮毛、飲食情況等均有所改善，腫瘤體積伴隨用藥時間延長而逐漸減小。（見圖1）

圖1 各組小鼠給藥后腫瘤體積變化比較（±s）

3.2 各組小鼠腫瘤質量與抑瘤率比較與模型組比較，低劑量組、高劑量組、干擾素組小鼠腫瘤質量降低（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組、干擾素組小鼠腫瘤質量降低（P＜0.05），抑瘤率升高（P＜0.05）；與高劑量組比較，干擾素組小鼠腫瘤質量降低（P＜0.05），抑瘤率升高（P＜0.05）。（見表1）

表1 各組小鼠腫瘤質量及抑瘤率比較（±s）

表1 各組小鼠腫瘤質量及抑瘤率比較（±s）

注：與模型組比較，aP＜0.05；與低劑量組比較，bP＜0.05；與高劑量組比較，cP＜0.05

組別 動物數（只）給藥劑量 腫瘤質量（g） 抑瘤率（%）模型組 11 - 1.72±0.22 -低劑量組11 25 mg/kg 1.29±0.25a 25.34±1.25高劑量組11 50 mg/kg 0.95±0.14a b 44.77±2.67b干擾素組11 40 000 U/mL 0.77±0.13a b c 55.23±2.75b c F 51.841 467.083 P 0.000 0.000

3.3 各組小鼠胸腺指數與脾臟指數比較與對照組比較，模型組、低劑量組、高劑量組、干擾素組小鼠胸腺指數和脾臟指數均降低（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組、高劑量組、干擾素組小鼠胸腺指數和脾臟指數均升高（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組、干擾素組小鼠胸腺指數和脾臟指數均升高（P＜0.05）；與高劑量組比較，干擾素組小鼠胸腺指數和脾臟指數均升高（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組小鼠胸腺指數與脾臟指數比較（±s，mg/g）

表2 各組小鼠胸腺指數與脾臟指數比較（±s，mg/g）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05；與高劑量組比較，dP＜0.05

組別 動物數（只） 給藥劑量 胸腺指數 脾臟指數對照組 10 - 3.31±0.36 6.05±0.32模型組 11 - 2.08±0.15a 3.88±0.25a低劑量組11 25 mg/kg 2.34±0.11a b 4.31±0.24a b高劑量組11 50 mg/kg 2.66±0.23a b c 4.99±0.28a b c干擾素組11 40 000 U/mL 3.01±0.29a b c d 5.51±0.35a b c d F 44.180 96.775 P 0.000 0.000

3.4 各組小鼠血清IgA、IgG、IgM水平比較與對照組比較，模型組、低劑量組、高劑量組、干擾素組小鼠血清IgA、IgG、IgM水平均降低（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組、高劑量組、干擾素組小鼠血清IgA、IgG、IgM水平均升高（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組、干擾素組小鼠血清IgA、IgG、IgM水平均升高（P＜0.05）；與高劑量組比較，干擾素組小鼠血清IgA、IgG、IgM水平均升高（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組小鼠血清IgA、IgG、IgM水平比較（±s，μg/mL）

表3 各組小鼠血清IgA、IgG、IgM水平比較（±s，μg/mL）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05；與高劑量組比較，dP＜0.05

組別 動物數（只） 給藥劑量 IgA IgG IgM對照組 10 - 54.63±3.21 433.65±10.28 588.34±10.14模型組 11 - 36.31±1.75a 342.26±9.12a 533.15±8.39a低劑量組11 25 mg/kg 40.39±1.69ab 380.47±8.47ab 541.18±7.24ab高劑量組11 50 mg/kg 45.28±1.28abc 401.45±8.26abc 552.63±6.41abc干擾素組11 40 000 U/mL 50.36±0.97abcd 419.85±7.74abcd 570.17±5.17abcd F 158.955 178.508 90.577 P 0.000 0.000 0.000

3.5 各組小鼠血清IL-10、TGF-β水平比較對照組比較，模型組、低劑量組、高劑量組、干擾素組小鼠血清IL-10、TGF-β水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組、高劑量組、干擾素組小鼠血清IL-10、TGF-β水平均降低（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組、干擾素組小鼠血清IL-10、TGF-β水平均降低（P＜0.05）；與高劑量組比較，干擾素組小鼠血清IL-10、TGF-β水平均降低（P＜0.05）。（見表4）

表4 各組小鼠血清IL-10、TGF-β水平比較（±s，ng/L）

表4 各組小鼠血清IL-10、TGF-β水平比較（±s，ng/L）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05；與高劑量組比較，dP＜0.05

組別 動物數（只） 給藥劑量 IL-10 TGF-β對照組 10 - 16.24±0.69 27.56±2.22模型組 11 - 31.35±1.25a 59.67±3.67a低劑量組11 25 mg/kg 29.48±0.55ab 55.31±3.23ab高劑量組11 50 mg/kg 26.18±0.78ab c 40.34±2.28ab c干擾素組11 40 000 U/mL 22.67±1.03ab cd 30.59±2.54ab cd F 490.389 276.071 P 0.000 0.000

3.6 各組小鼠脾臟T淋巴細胞亞群變化比較與對照組比較，模型組、低劑量組、高劑量組、干擾素組小鼠脾臟CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞占比及CD4+/CD8+比值均降低（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組、高劑量組、干擾素組小鼠脾臟CD3+、CD4+T淋巴細胞占比及CD4+/CD8+比值均升高（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組、干擾素組小鼠脾臟CD3+、CD4+T淋巴細胞占比及CD4+/CD8+比值均升高（P＜0.05）；與高劑量組比較，干擾素組小鼠脾臟CD3+、CD4+T淋巴細胞占比及CD4+/CD8+比值均升高（P＜0.05）。（見圖2、表5）

表5 各組小鼠小鼠脾臟CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群比較（±s）

表5 各組小鼠小鼠脾臟CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05；與高劑量組比較，dP＜0.05

組別 動物數（只）給藥劑量 CD3+(%) CD4+(%) CD8+(%) CD4+/CD8+對照組 10 - 67.64±3.75 48.36±4.15 23.94±5.25 2.02±0.05模型組 11 - 40.36±3.28a 29.78±2.37a 19.72±4.28a 1.51±0.03a低劑量組11 25 mg/kg 48.14±2.89ab 35.49±3.41ab 20.05±4.44ab 1.77±0.04ab高劑量組11 50 mg/kg 55.97±3.74abc 40.49±2.55abc 22.13±3.51abc 1.83±0.05abc干擾素組11 40 000 U/mL 62.34±2.59abcd 46.34±1.56abcd 24.26±4.52abcd 1.91±0.03abcd F 118.373 73.949 2.473 234.644 P 0.000 0.000 0.057 0.000

圖2 各組小鼠脾臟CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞占比

4 討 論

鼻咽癌發病隱匿，確診時多進展至晚期，盡管目前研究已對其早期診斷、治療等方法進行了深入研究，但迄今仍未取得突破性進展，其防治工作依然是醫學界重要研究課題。鼻咽癌發病機制尚不清楚，病因涉及免疫功能下降、EB病毒感染、遺傳因素、飲食環境等[6]。鼻咽部解剖復雜，這一點決定了手術危險性，目前以放化療為主，但存在非特異毒性、放療耐受、遠處轉移、免疫低下等弊端[7]。我國傳統醫學主張以中藥治療鼻咽癌，國外也將中藥作為補充替代醫學進行過研究[8]。中醫學強調“正氣存內，邪不可干”，這一獨特切入點反映在鼻咽癌治療中主要表現為調節陰陽平衡，改善免疫功能，以抵抗病邪，可彌補放化療的不足。

靈芝三萜是靈芝藥用功效的主要活性成分，藥理活性廣泛，有抗腫瘤、增強免疫功能等效應，適宜作為低毒性輔助性藥物治療鼻咽癌。靈芝作為天然植物類藥物，抗腫瘤作用早有報道，但靈芝三萜用于鼻咽癌治療研究的報道鮮見[9]。本研究為了解靈芝三萜抗鼻咽癌活性及作用機制，通過種植CNE-2鼻咽癌細胞建立鼻咽癌小鼠模型。結果表明，與對照組比較，造模小鼠毛色、二便、飲食、活動狀態及體質量均有異常改變，經靈芝三萜干預后明顯改善；進一步計算腫瘤質量與抑瘤率，從模型組到低劑量組、高劑量組、干擾素組，小鼠腫瘤質量依次下降，高劑量組、干擾素組抑瘤率高于低劑量組，提示靈芝三萜用于鼻咽癌治療中可抑制腫瘤生長，改善小鼠一般狀況，尤以高劑量靈芝三萜為佳，其效果僅次于干擾素。干擾素是一種兼有抗病毒、抗腫瘤作用的免疫增強劑，在腫瘤治療中可發揮抑制腫瘤、增強免疫功能的雙重作用，適宜用于鼻咽癌放化療時輔助治療。現代醫學認為[10-11]，機體免疫功能與腫瘤產生、發展密切相關，但宿主免疫功能受抑制時，腫瘤發生風險大，且腫瘤增長時免疫功能受抑制，二者互為因果，因此調節機體免疫功能是防治癌癥的關鍵步驟之一。

胸腺是中樞免疫器官，主要參與細胞免疫，負責調節機體免疫功能，可分泌多種細胞因子，促進T細胞成熟，在建立自身免疫耐受、維持免疫自穩方面發揮著不可或缺的作用[12]。脾臟為外周免疫器官，是T淋巴細胞、B淋巴細胞定居及產生免疫應答的場所，淋巴細胞、巨噬細胞豐富，與體液免疫關系密切[13]。胸腺與脾臟的質量與其免疫細胞數量、功能有關，二者臟器指數可反映機體免疫功能[14]。本研究結果顯示，從模型組到低劑量組、高劑量組、干擾素組，小鼠胸腺指數和脾臟指數依次升高，提示靈芝三萜可增強鼻咽癌小鼠免疫功能。IgG是人工主動免疫后機體產生的抗體，是個體發揮免疫功能的主力；IgM是體液免疫應答中最早產生的抗體，在早期免疫中發揮重要作用；IgA是外分泌液中主要抗體，與IgG、IgM共為人體重要免疫球蛋白，可結合外界抗原，發揮防御、保護作用[15]。腫瘤已經發展出多種機制逃避免疫監視，產生免疫抑制細胞因子即重要因素之一，TGF-β是目前已知的最強免疫抑制因子。由T細胞生成TGF-β是抑制免疫應答的重要因素。研究發現[16]，抑制腫瘤源性TGF-β可控制腫瘤增長，延長荷瘤小鼠存活率。IL-10是一種多效性細胞因子，具有雙向免疫調節作用，可通過抗原提呈細胞發揮免疫抑制作用，在腫瘤環境中對免疫應答可發揮負向調節作用[17]。本研究結果顯示，從模型組到低劑量組、高劑量組、干擾素組，小鼠血清IgA、IgG、IgM水平逐漸升高，IL-10、TGF-β水平逐漸下降，提示靈芝三萜可增強鼻咽癌小鼠免疫功能，推測這是靈芝三萜抑制鼻咽癌生長的機制之一。腫瘤免疫反應主要指細胞免疫反應，以T細胞亞群為主導，包括CD3＋、CD4＋、CD8＋等。CD3＋是成熟T細胞特征性標志，代表T淋巴細胞總數；CD4＋是輔助性T細胞，主要輔助B細胞生成抗體，發揮殺瘤作用；CD8＋細胞為抑制性T細胞，對細胞免疫有負調節作用，可對靶細胞產生細胞毒作用，抑制免疫作用。CD4＋/CD8＋比值降低提示機體處于免疫抑制狀態，可能誘發或加快腫瘤生長。脾臟在鼻咽癌患者細胞免疫中占主導地位，故本研究觀察了脾臟T淋巴細胞亞群分化情況。結果顯示從模型組到低劑量組、高劑量組、干擾素組，小鼠脾臟CD3＋、CD4＋T淋巴細胞占比及CD4＋/CD8＋比值依次升高，提示靈芝三萜可提高T淋巴細胞標志物水平，進一步表明靈芝三萜可刺激細胞免疫，帶動整個機體免疫力恢復。

綜上所述，靈芝三萜可提高鼻咽癌小鼠胸腺指數和脾臟指數，提高血清IgA、IgG、IgM水平，降低血清IL-10、TGF-β水平，抑制腫瘤生長，其作用機制可能與調節T細胞亞群分化，增強鼻咽癌小鼠免疫功能有關。