電針與穴位注射法治療腹瀉型腸易激綜合征小鼠模型效果的比較研究*

付怡茗，魏曉彤，柏寒，王翠平，楊繼國

（山東中醫藥大學，山東 濟南 250355）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種以持續或間歇性腹痛并伴有大便性狀異常為特征的功能性胃腸疾病，臨床以腹瀉型（IBS-D）患者最為多見。IBS發病機制復雜，病程較長且遷延難愈，常給患者帶來嚴重的生活困擾。近年來，針刺治療IBS-D以其獨特的治療優勢引起了國內外的廣泛關注[1]。研究發現，精神異常與心理障礙是導致IBS發生的重要因素，其作用機制可能與“腦-腸軸”有關[2]。基于這一特點，臨床研究發現以“健脾調神”法針刺治療IBS-D能顯著改善胃腸功能，降低疾病復發率[3]。穴位注射與電針作為針刺的常規治療方式，目前廣泛應用于臨床IBS患者的治療當中，現代研究中鮮有二者的治療效果對比的相關報道。故本研究以“健脾調神”針刺法為基礎，觀察穴位注射與電針治療IBS-D模型小鼠的效果差異，以期為臨床治療IBS-D提供方案選擇的理論依據和數據參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物4個月齡SPF級KM孕鼠5只，體質量80～120 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號：SCXK（魯）2019-0003。實驗在山東中醫藥大學實驗動物中心進行，實驗動物使用許可證號：SYXK（魯）2017-0022，實驗前將孕鼠適應性飼養1周，自由進食與飲水，室溫（24±2）℃，濕度（50±5）%。實驗動物所有操作經山東中醫藥大學實驗動物福利倫理審查委員會批準，批號：SDUTCM20200907003。

1.2 藥物與試劑0.5%乙酸水溶液（安徽雷根生物技術有限公司，批號：0917A20）；番瀉葉水煎液（山東中醫藥大學中藥房）；黃芪注射液（神威藥業集團有限公司，批號：Z13021000）；75%醫用消毒酒精（湖南廣盛源醫藥科技有限公司，批號：20180722）；10%福爾馬林中性固定液（南昌雨露實驗器材有限公司，批號：200904）；碳素墨汁（北京一得閣公司，批號：20201011）；甲苯胺藍染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號：G3663）。

1.3 主要儀器SDZ-V型華佗牌電子針療儀（蘇州醫療用品廠有限公司）；YH-A3001型電子天平（五鑫衡器有限公司）；華佗牌0.18 mm×13 mm一次性使用無菌針灸針（蘇州醫療用品廠有限公司，批號：200135）；一次性無菌注射器（江蘇治宇醫療器械有限公司，醫療器械注冊證編號：國械標準20173150338）；2.7 mm雙腔球囊導尿管（浙江優特格爾醫療用品有限公司，醫療器械注冊證編號：浙械標準20192140251）；0.5 mm×1 mm毛細硅膠管（上海深輝橡塑五金有限公司，批號：200510）；EG1160型生物組織包埋機（德國徠卡公司）；RM2135型石蠟切片機（德國徠卡公司）；E400型生物顯微鏡（日本尼康公司）；BX40型顯微鏡照相系統（日本Olympus公司）。

1.4 造模與分組5只KM孕鼠在適應性飼養1周后生產幼鼠共56只，篩選體質量10～20 g、雌雄各半的新生幼鼠32只，按隨機原則選取8只作為空白組，不予干預，正常飼養。剩余24只采用母嬰分離、乙酸灌腸、番瀉葉灌胃及夾尾刺激聯合制備實驗所需IBS-D模型小鼠[4-5]。造模新生幼鼠于出生后第2天開始進行不可預測性[6]母嬰分離，每日持續3 h；從第12天開始疊加0.5%乙酸灌腸刺激，具體實驗劑量見表1，以上均持續至第26天結束。其后正常飼養至第50天，同日開始對造模小鼠進行番瀉葉水煎液灌胃（29.4 g/100 mL），并在自制束縛袋中對小鼠尾外側1/3處行夾尾刺激，每日持續夾尾5 min，持續至第57天結束。造模后，模型小鼠出現符合中醫辨證的肝郁脾虛證候的情況，如精神抑郁（情緒敏感度增高、易怒易嘶叫，日常倦怠懶臥，毛發枯黃無光澤），排便異常（稀便率增加、排便次數增多），胃腸道功能紊亂（腸道敏感度增加、飲食減少、體質量增長速度減緩）。

表1 小鼠結腸0.5%乙酸灌腸量（mL）

造模結束后，24只模型小鼠按隨機原則分為模型組、穴位注射組和電針組，每組8只，并在空白組、模型組、穴位注射組和電針組中分別隨機選取2只小鼠，取結腸組織行HE染色，以結腸組織無明顯病理性改變作為造模成功的依據。

1.5 實驗給藥造模成功后，第60天開始進行針刺干預刺激。取穴參考《實驗針灸學》[7]中定位標準：“足三里”位于膝關節外側，腓骨小頭下約3 mm，皮下直刺6 mm；“百會”位于頂骨正中，向前平刺2 mm。采用棉繩捆綁小鼠四肢并系于解剖板進行固定，電針組小鼠常規穴區消毒后，應用0.18 mm×13 mm針灸針快速進針，連接電針儀，采用疏密波（2/100 Hz），調整強度為1，穴位單側取用次日輪換，每日持續15 min。穴位注射組采用1 mL無菌注射器給予各穴位0.05 mL黃芪注射液，并按電針組相同束縛方法束縛15 min。模型組小鼠以相同的束縛方法束縛15 min，此外不給予任何刺激。空白組正常飼養，不給予任何刺激。以6 d為1個療程，中間休息1 d，共治療4個療程。

1.6 觀察指標

1.6.1 一般情況觀察 每日觀察各組小鼠的精神行為狀態、毛發色澤狀況、活動情況、排便情況及糞便性狀等。

1.6.2 Bristol糞便性狀評分 參考Bristol糞便性狀7級評分標準[8]（見表2），針刺干預結束后當日，收集各組小鼠16:00:00—18:00:00的糞便并對各組小鼠糞便情況進行評分。

表2 Bristol糞便性狀量表

1.6.3 腹壁回縮反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）于造模結束后、針刺干預結束后當日，依據AWR評分標準[5]（見表3），分別測定各組小鼠在AWR評價達到3分時的最小容量閾值。實驗前禁食不禁水12 h，用棉繩將小鼠四肢綁在解剖板上固定，將涂抹石蠟油的帶擴張球囊的硅膠導尿管輕柔地插入小鼠肛門，使球囊末端深入肛門約5 mm，將導管與小鼠尾部用無菌膠布固定牢固。待小鼠適應20 min后，經導管向球囊勻速注入24℃溫水，使腸道擴張，擴張時間持續20 s，觀察并記錄引起小鼠腹部抬起（AWR評價為3分）的最小注水量。用注射器將球囊內的水吸凈，待10 min后進行下一次球囊擴張實驗，重復擴張3次，取3次所得最小注水量的均值代表該小鼠的最小容量閾值，評價小鼠對直腸擴張刺激的敏感性。

表3 腹壁回縮反射（AWR）評分（分）

1.6.4 小腸推進率測定 實驗前禁食不禁水24 h，于針刺結束當日按0.15 mL/10 g對各組小鼠進行墨汁灌胃，靜置15 min后，快速脫頸處死，剖開小鼠腹腔，迅速取出小鼠整個胃腸道，拉直后測定小腸推進率。小腸推進率=墨汁前沿至幽門的距離/小腸總長度×100%。

1.6.5 結腸組織的病理學改變 于小腸推進率測定結束后取距離肛門6 cm處結腸段各3 cm，經生理鹽水沖洗后放入10%中性福爾馬林固定液固定。經常規石蠟包埋組織切片，HE染色后光鏡（×200）下觀察結腸組織形態。

1.6.6 結腸組織肥大細胞（mast cells，MC）計數 取“1.6.5”經常規石蠟包埋組織切片，行甲苯胺藍染色，隨機選取3個視野光鏡（×400）下觀察MC形態，連續計數后取平均值。

1.7 統計學方法采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析。計量資料均以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 小鼠一般行為學觀察空白組小鼠精神狀態良好，毛發順滑有光澤，飲食、大便正常。造模小鼠較空白組小鼠體型偏瘦小，精神狀態較差，易怒易嘶叫打斗，毛發枯黃稀疏，日活動減少，飲食減少且出現不同程度的稀便。經穴位注射與電針治療后，小鼠情緒易激狀態明顯改善，活動增加，毛發逐漸恢復亮白色，飲食量增加。

2.2 各組小鼠Bristol糞便性狀評分比較模型組小鼠Bristol糞便性狀評分明顯高于空白組（P＜0.05）；穴位注射組、電針組小鼠Bristol糞便性狀評分明顯低于模型組（P＜0.05）；電針組小鼠Bristol糞便性狀評分明顯低于穴位注射組（P＜0.05）；表明穴位注射與電針均能改善IBS-D小鼠腹瀉狀態，但電針效果明顯優于穴位注射。（見表4）

表4 各組小鼠Bristol糞便性狀評分比較（±s，分）

表4 各組小鼠Bristol糞便性狀評分比較（±s，分）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與穴位注射組比較，cP＜0.05

組別 動物數（只） 糞便性狀評分空白組 6 3.73±0.45模型組 6 5.70±0.46a穴位注射組 6 4.71±0.46b電針組 6 4.20±0.40b c

2.3 各組小鼠AWR最小容量閾值比較造模后，模型組、穴位注射組、電針組小鼠AWR最小容量閾值均明顯低于空白組（P＜0.05），說明造模后小鼠腸道敏感性增高。干預后，電針組小鼠AWR最小容量閾值高于模型組（P＜0.05），穴位注射組小鼠AWR最小容量閾值高于模型組，但差異無統計學意義（P＞0.05）；電針組小鼠AWR最小容量閾值明顯高于穴位注射組（P＜0.05），說明電針能改善IBS-D小鼠腸道高敏感狀態。（見表5）

表5 各組小鼠AWR最低容量閾值比較（±s，mL）

表5 各組小鼠AWR最低容量閾值比較（±s，mL）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與穴位注射組比較，cP＜0.05

組別 動物數（只） 造模后 干預后空白組 6 0.308±0.020 0.318±0.005模型組 6 0.207±0.023a 0.225±0.018a穴位注射組 6 0.209±0.017a 0.232±0.006a電針組 6 0.237±0.028a 0.292±0.127b c

2.4 各組小鼠小腸推進率比較模型組小鼠小腸推進率明顯高于空白組（P＜0.05）；穴位注射組、電針組小鼠小腸推進率均明顯低于模型組（P＜0.05）；電針組小鼠小腸推進率明顯低于穴位注射組（P＜0.05）；表明穴位注射、電針均能改善IBS-D小鼠胃腸功能紊亂狀態，但電針效果優于穴位注射。（見表6）

表6 各組小鼠小腸推進率比較（±s，%）

表6 各組小鼠小腸推進率比較（±s，%）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與穴位注射組比較，cP＜0.05

組別 動物數（只） 小腸推進率空白組 6 0.743±0.015模型組 6 0.832±0.021a穴位注射組 6 0.786±0.008b電針組 6 0.740±0.007b c

2.5 各組小鼠結腸組織黏膜形態觀察各組小鼠結腸黏膜形態完好，無炎癥，黏膜固有層中無中性粒細胞浸潤，間質無水腫，柱狀細胞排列整齊，杯狀細胞數量較多。（見圖1）

圖1 各組小鼠結腸組織的病理圖（HE，×200）

2.6 各組小鼠結腸組織肥大細胞（MC）浸潤程度比較空白組小鼠結腸組織MC呈圓形，外觀平整均勻，單個散布于組織中，浸潤程度低；模型組小鼠結腸組織MC以不規則形狀集中分布為主，且浸潤程度明顯高于空白組（P＜0.05）；穴位注射組、電針組小鼠結腸組織MC以不規則橢圓形為主、邊界清晰、散在分布于組織中，且浸潤程度均明顯低于模型組（P＜0.05）；電針組小鼠結腸組織MC浸潤程度明顯低于穴位注射組（P＜0.05）。（見圖2、表7）

圖2 各組小鼠結腸組織MC浸潤程度（甲苯胺藍，×400）

表7 各組小鼠結腸組織肥大細胞數目比較（±s，個/視野）

表7 各組小鼠結腸組織肥大細胞數目比較（±s，個/視野）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與穴位注射組比較，cP＜0.05

組別 動物數（只） 肥大細胞數目空白組 6 0.67±0.37模型組 6 4.61±1.65a穴位注射組 6 3.45±0.72b電針組 6 1.78±0.46b c

3 討 論

研究發現，IBS-D的發病機制可能與胃腸動力紊亂、內臟高敏感性及腦腸互動關系密切[2]。隨著腦腸軸理論研究的不斷深入，精神心理因素已成為導致IBS-D發生的重要因素，并且與疾病發展預后密切相關。IBS-D在中醫學中多屬于“泄瀉、腸郁”的范疇，IBS-D的基本病機為肝郁脾虛，其中脾胃失調是基礎，而情不遂、神不和則為發病的關鍵。張介賓在《景岳全書》中有言：“脾胃之傷于情志者，較之飲食寒暑為更多也。”當情志生變，累及脾胃而無力化生氣血，易導致出現以氣血不足、心神失養為主要表現的臨床癥狀。基于對發病機理的認知，“健脾調神”針刺治療IBS-D在臨床收效甚佳。“百會”位于巔頂，具有調神健腦之功，依據經絡循行，腦與胃、大腸、小腸經均相通，且為掌管人體一切思維與情志的“元神之府”，同時又能夠升陽固脫，對治療泄瀉有一定的療效；“足三里”為胃之下合穴，所謂“肚腹三里留”，該穴具有健運中州，維持胃腸運動穩定的功能。兩穴相配，調情志而理氣血，健脾胃而暢氣機，不僅能夠改善胃痛、泄瀉等癥狀，又可以緩解患者抑郁、焦慮的情緒。目前認為，針刺治療IBS-D具有獨特優勢。相較于單純的運用西醫治療，電針治療IBS-D能夠更好地緩解患者腹痛的癥狀，平衡胃腸功能，改善精神狀況[9]。韋麗萍等[10]采用穴位注射黃芪注射液治療IBS-D，結果顯示其治療有效率顯著高于西醫對照組，且復發率明顯降低。此外，相較于中藥內服，電針與穴位注射具有操作簡便、副作用小、用藥量小且作用迅速的特點，更有利于患者接受及臨床的推廣使用。

本實驗采用母嬰分離、乙酸灌腸、番瀉葉灌胃和夾尾刺激聯合制備實驗所需IBS-D小鼠模型。實驗結果表明，模型小鼠Bristol糞便性狀評分提高，AWR最小容量閾值降低（P＜0.05），HE染色顯示模型小鼠結腸黏膜形態完好、無炎癥細胞浸潤、無器質性病理改變。以上各項指標均符合肝郁脾虛型IBS-D模型的病理特點。通過比較干預后各組小鼠的Bristol糞便性狀評分、AWR最小容量閾值、小腸推進率，我們發現穴位注射組與電針組小鼠的排便異常、內臟高敏感性及胃腸紊亂情況均有所改善，但電針的治療效果明顯優于穴位注射。

MC與IBS-D的關系主要體現在增加內臟敏感度，造成胃腸動力紊亂，以及破壞腸道的免疫屏障功能[11]。當人體受到外來刺激時會導致腸道內MC大量活化脫顆粒，從而釋放多種活性介質和細胞因子，其中5-羥色胺（5-HT）是重要的介質之一。5-HT廣泛存在于胃腸道中，其受體5-HT3、5-HT4廣泛參與對腸道蠕動反射的調節，從而導致IBS患者胃腸功能紊亂的形成[12]。IBS患者內臟敏感性的升高也可能與5-HT損害迷走神經的調控能力有關[13]。有研究表明，相較于正常人，IBS患者腸道MC的數量不僅在全結腸呈現整體上升趨勢，而且在單個結腸段仍顯著增加[14]，這一結果表明MC與IBS存在密切的關聯。本實驗結果顯示，模型組小鼠結腸組織MC浸潤程度明顯高于空白組（P＜0.05），說明IBS-D的發病機制可能與MC存在密切聯系；與模型組比較，穴位注射組與電針組小鼠結腸組織MC浸潤程度均降低，但電針組浸潤程度明顯低于穴位注射組（P＜0.05），這表明電針治療IBS-D的機制可能與降低MC水平有關。

綜上所述，電針和穴位注射均可對IBS-D模型小鼠起到治療作用，但兩者存在效應差異，即電針的作用優于穴位注射。需要說明的是，IBS-D屬于慢性疾病，臨床治療過程一般長達幾個月，考慮到本實驗治療時間短暫且樣本量較少，故實驗結果具有一定的局限性。電針與穴位注射治療IBS-D的作用機制仍需進一步探究。