Box-Behnken設計-響應面法優化復方白鮮皮濕疹方提取工藝*

魏其云，甄世福，楊志軍，趙小梅，徐麗波，袁 麗，楊 娟

（1.蘭州市中醫醫院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050；3.蘭州大學藥學院，甘肅 蘭州 730000）

復方白鮮皮濕疹方，為蘭州市中醫醫院結合多年臨床經驗篩選參合而成的經驗方，由白鮮皮、地膚子、苦參、馬齒莧、蛇床子、蒲公英、金銀花等12味藥材組成，具有清熱涼血、收濕斂瘡、止癢的功效，主要治療濕疹、濕瘡等，臨床療效確切[1-3]。方中白鮮皮具有清熱燥濕、祛風解毒的功效，主要活性成分為白鮮堿、黃柏酮和檸檬苦素[4]；地膚子具有利尿消腫、清熱、祛濕的功效，主要活性成分為三萜皂苷及甾類化合物[5]。復方白鮮皮濕疹方目前只能以傳統湯劑對患者熏蒸或熱敷，其臨床使用范圍受限。為了更好地開發該方，本研究擬采用制劑新技術對該處方進行二次開發，通過改變劑型進一步擴大臨床應用范圍，增加臨床患者適用性。

Box-Behnken設計-效應面法[6]建立非線性的數學模型，預測性好，試驗精度高，結果直觀，適用于多因素、多水平的試驗。目前該方法已被廣泛應用于中藥學研究領域[7-11]。基于此，本研究以復方白鮮皮濕疹方的主要有效成分綠原酸、鹽酸小檗堿、白鮮堿含量的總評歸一值（OD值）[12]為主要考察指標，以乙醇濃度、提取時間、提取次數、溶劑倍數為考察因素，采用單因素試驗結合Box-Behnken設計-響應面法優化復方白鮮皮濕疹方的提取工藝[13-14]，以期為復方白鮮皮的相關制劑研發提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器Agilent1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；XSE205DU型電子天平（賽多利斯公司）；101-1AS型電熱鼓風干燥箱（北京科偉）；HH-S型數顯恒溫水浴鍋（江蘇正基儀器有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗機（昆山舒美）。

1.2 試藥綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-201817）；鹽酸小檗堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110822-201817）；白鮮堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：111654-200301）；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純；水均為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統適應性試驗色譜柱：Inertsil氨基柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；甲醇-0.1%甲酸水溶液（89∶11）為流動相；流速：1 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：25℃；進樣量：20 μL。在上述色譜條件下進樣，綠原酸、鹽酸小檗堿、白鮮堿的色譜峰均按要求達到基線分離，分離度＞1.5，且其他成分與以上色譜峰之間無干擾。理論塔板數按白鮮堿峰計算均不低于5 000。

2.2 方法學考察

2.2.1 混合對照品溶液的配制 精密稱取綠原酸對照品11.04 mg、鹽酸小檗堿對照品8.01 mg、白鮮堿對照品5.03 mg，采用甲醇溶解并分別定容至10、10、5 mL容量瓶中，制得質量濃度分別為1.104 0、0.801 0、1.006 0 mg/mL貯備液，備用。

分別精密吸取綠原酸貯備液5.0 mL、鹽酸小檗堿貯備液2.0 mL、白鮮堿貯備液1.5 mL置于同一10 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得混合對照品溶液，備用。進樣色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品溶液的HPLC圖譜

2.2.2 供試品的制備 制備工藝：按處方比例稱取適量藥材，以藥材8倍量80%的乙醇為提取溶劑，回流提取1.5 h，共提取2次，每次提取后濾過，合并濾液，冷卻，即得供試品。

供試品溶液的制備：取上述濾液10 mL，蒸干，適量甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，進樣，色譜圖見圖2。

圖2 供試品溶液的HPLC圖譜

2.2.3 陰性對照溶液的制備 制備工藝：除金銀花、白鮮皮、蒲公英、黃柏外，按處方比例稱取其余藥材，以藥材8倍量80%的乙醇為提取溶劑，回流提取1.5 h，共提取2次，每次提取后濾過，合并濾液，冷卻，即得陰性對照。

陰性對照溶液的制備：取上述濾液10 mL，蒸干，適量甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，進樣，色譜圖見圖3。

圖3 陰性對照溶液的HPLC圖譜

2.2.4 線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液0.1、0.4、0.8、1.2、1.6 mL置于5 mL容量瓶中，分別加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，按“2.1”項下色譜條件進樣，以濃度為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y，得線性回歸方程：Y綠原酸=23 897X+9.738 7（R=0.999 8）、Y鹽酸小檗堿=25 130X+87.942（R=0.999 6）、Y白鮮堿=5 559.1X+68.708（R=0.999 2）；結果表明綠原酸在0.01104～0.17664mg/mL、鹽酸小檗堿在0.003204～0.051 264 mg/mL、白鮮堿在0.003 018～0.048 288 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.5 精密度試驗 取“2.2.1”項下制備的混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續進樣6次，計算綠原酸、鹽酸小檗堿及白鮮堿峰面積的RSD（n=6）分別為0.19%、0.06%、0.02%，說明該儀器的精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 取“2.2.2”項下的同一供試品溶液6份，分別室溫放置0、2、4、6、8、12 h，以“2.1”項下色譜條件進樣分析，求得綠原酸、鹽酸小檗堿、白鮮堿峰面積的RSD分別為0.09%、0.06%、0.05%。結果表明在12 h內供試品溶液性質穩定。

2.2.7 重復性試驗 精密稱定6份同一樣品粉末，用甲醇30 mL，超聲提取30 min，水浴蒸干，甲醇定容至5 mL容量瓶中。按“2.1”項下條件進樣測定，樣品綠原酸、鹽酸小檗堿、白鮮堿峰面積的RSD（n=6）分別為0.02%、0.03%、0.05%，說明該方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取9份同一批已知含量的供試品溶液，精密加入一定量對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備9份樣品溶液，依法進樣測定，根據“2.2.4”項下標準曲線計算回收率，綠原酸、鹽酸小檗堿、白鮮堿平均回收率分別為96.20%、95.95%、96.46%，RSD分別為1.17%、0.73%、0.49%，均小于2%，符合要求。（見表1）

表1 加樣回收率試驗

2.3 單因素試驗設計及結果以白鮮堿、綠原酸、鹽酸小檗堿的含量為評價指標，通過考察不同溶劑倍數（6倍、8倍、10倍、12倍、14倍、16倍）、乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、提取次數（1次、2次、3次）和提取時間（1.0 h、1.5 h、2.0 h）4個因素對提取效果的影響[15]，為響應面試驗因素水平的選擇提供依據。單因素試驗結果見圖4。

由圖4A可知，白鮮堿的含量隨著溶劑用量的增加變化不明顯，綠原酸的含量先增高后降低，鹽酸小檗堿的含量先降低后緩慢升高。綜合考慮影響因素，最終選擇溶劑倍數6、10、12為該因素水平。

由圖4B可知，隨乙醇濃度的增加，白鮮堿和綠原酸的含量均先緩慢升高再下降，鹽酸小檗堿含量先下降再升高最后趨于平穩。綜合考慮，最終選擇乙醇濃度50%、60%、80%為該因素水平。

由圖4C可知，綠原酸的含量隨提取次數增加而增加，白鮮堿、鹽酸小檗堿的含量隨提取次數的增加變化不大。綜合考慮，最終選擇提取次數1、2、3為該因素水平。

由圖4D可知，鹽酸小檗堿含量隨提取時間增加而增加，綠原酸和白鮮堿含量隨提取時間增加而升高，但變化不明顯。綜合考慮，最終選擇提取時間1.0、1.5、2.0 h為該因素水平。

圖4 單因素試驗結果

2.4 Box-Behnken設計-響應面法優化制備工藝

2.4.1 BBD試驗設計結果 通過前期單因素試驗，不同因素及水平值已確定，以乙醇濃度（A）、溶劑倍數（B）、提取時間（C）、提取次數（D）為自變量，以綠原酸、白鮮堿、鹽酸小檗堿含量的OD值為響應值，運用Design-Expert 8.0軟件進行Box-Behnken響應面設計4因素3水平試驗方案，見表4。

表4 星點試驗因素水平表

采用Design-Expert 8.05b軟件的星點設計方案安排復方白鮮皮濕疹方提取工藝條件，對白鮮皮濕疹方提取工藝進行優化確定，確定最佳提取工藝條件。試驗設計及結果見表5。

表5 BBD實驗設計及結果

2.4.2 模型擬合及方差分析 應用Design Expert 8.0.6軟件，OD值為響應值，分別對四個因素即乙醇濃度（A）、溶劑倍數（B）、提取時間（C）、提取次數（D）進行數據擬合分析，得到回歸方程：Y=-12.205 20+0.074 857A+1.291 06B+3.681 15C+8.053 65D-2.081 88E-003AB-9.119 49E-004AC-3.531 76E-003AD+0.049 842BC-0.115 59BD-0.219 87CD-4.520 64E-004A2-0.044 506B2-0.912 86C2。回歸模型方差分析[13]結果見表6。

由表6可知，P＜0.000 1，失擬項P＞0.05，說明此模型顯著高且擬合程度良好，對提取制備工藝的分析與預測可以用該模型。A和C無顯著性影響，B和D因素有顯著性影響（P＜0.01）。以上結果表明，各因素對該方有效成分提取率的影響并不是單純的線性關系，對其提取工藝顯著性影響由大到小的排列順序應為D＞B＞C＞A。

表6 方差分析

續表6：

2.4.3 響應面優化提取工藝及預測 根據回歸方程擬合模型，固定4個變量中的2個變量，利用軟件Design-Expert 8.0.6，繪制另外兩個變量對OD影響的三維響應面圖，可以更直觀反映響應值與各因素以及各因素之間的交互關系。（見圖5）

圖5 OD值與A、B、C、D四個因素的三維響應面

經Design-Expert軟件分析，最優制備工藝為參數為：乙醇濃度50%，溶劑倍數10.86，提取時間1.96 h，提取次數2.75。根據實際運行情況，選取乙醇濃度50%、溶劑倍數11倍，提取時間2 h，提取次數3次。

2.5 驗證試驗及結果按處方量稱取苦參、地膚子、蛇床子、馬齒莧、白鮮皮、蒲公英、金銀花等12味藥材3份，以所選最佳工藝提取條件進行平行3次的驗證試驗。結果顯示，綠原酸、鹽酸小檗堿、白鮮堿平均含量分別為0.703%、0.241%、0.155%，綠原酸、鹽酸小檗堿、白鮮堿的OD值為11.27，與預測值11.19比較，偏差為-0.71%。結果表明該回歸模型建立合理，具有良好的預測性。

3 討 論

濕疹是由多種內外因素引起的瘙癢劇烈的一種皮膚炎癥反應[16]。現代藥理研究表明，本處方中的有效成分綠原酸[17]和鹽酸小檗堿[18]都具有明顯的抑菌作用，且鹽酸小檗堿具有止癢功效[19]。單一指標優化可以根據試驗結果直接進行判斷，而多指標之間存在一定的交互作用，多個指標同時處理與每個評價指標單獨處理得到的優化結果具有差異性，因此我們引入總評歸一值（OD）。本研究采用數學方法將綠原酸、鹽酸小檗堿和白鮮堿3個指標綜合考慮，對所有量化指標進行客觀分析，讓模型具有更好的預測性；通過單因素試驗，考察并篩選出綠原酸、鹽酸小檗堿、白鮮堿3個有效成分作為考察指標，并采用OD值綜合指標數據。本研究在減少Box-Behnken設計-響應面試驗的因素和減少試驗次數的同時，可避免發生因試驗設計點選取不當而超出實際條件的情況，以此保證優化結果的良好性。

本研究利用單因素試驗和BBD-RSM優化傳統復方白鮮皮濕疹方的制備工藝[20-21]，再經試驗驗證，在最優工藝參數下提取到的樣品有效成分含量高，且實測值與預測值有較小偏差。結果顯示Box-Behnken設計-響應面法具有較為良好的預測性，可用于復方白鮮皮濕疹方提取工藝的優選。