基于層次分析法結合Box-Behnken響應面法優選陳皮麻黃飲水提工藝*

譚娥玉，王賢兒，林信亨，馬少鋒，關琴笑，唐興榮

（江門市五邑中醫院，廣東 江門 529000）

陳皮麻黃飲是名中醫唐興榮在臨床上實踐多年的驗方，該方由二陳湯和三子養親湯加減化裁而成，由陳皮、苦杏仁、紫蘇子、桔梗、麻黃、干姜、甘草、五味子、金蕎麥9味中藥組成，具有溫肺化飲、止咳平喘的功效，主要用于日久不愈的咳嗽諸證，現擬將其制備為合劑。為確保制劑質量的穩定性及有效性，本實驗以苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸及總黃酮含量為綜合評價指標，采用層次分析法（AHP）確定各指標權重系數，結合Box-Behnken響應面法優選陳皮麻黃飲的水提工藝，為進一步完善該制劑的制備工藝提供可靠依據。

1 儀器與材料

1.1 材料陳皮、苦杏仁、紫蘇子、桔梗、麻黃、干姜、甘草、五味子、金蕎麥飲片均購自廣州市集芝寶中藥有限公司，經我院藥學部李燕暉副主任中藥師鑒定為正品；橙皮苷對照品（批號：MUST-19030701，純度：98.46%）、苦杏仁苷對照品（批號：MUST-19042820，純度：99.28%）、迷迭香酸對照品（批號：MUST-19053107，純度：99.02%）、甘草酸單銨鹽對照品（批號：MUST-16113011，純度：99.10%）（成都曼思特生物科技有限公司）；磷酸為分析純，水為超純水，甲醇為色譜純。

1.2 儀器1260 InfinityⅡ型HPLC儀[美國Agilent公司，包括四元泵（G7111A）、自動進樣器（G7129A）、柱溫箱（G7129A）、DAD檢測器（G7117C）、色譜工作站（OpenLAB CDS Chem－Station）]；WH-800型超聲波清洗機（濟寧萬和超聲電子設備有限公司）；HH-3A型數顯恒溫三溫水浴鍋（金壇市精達儀器制造有限公司）；XS205DU型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；T6型紫外可見光-分光光度計（北京普析通用有限責任公司）；Best-S30型超純水機（芷昂儀器上海有限公司）。

2 方法與結果

2.1 高效液相色譜法同時測定陳皮麻黃飲中苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸的含量

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇（A）-0.2%磷酸（B）梯度洗脫：0.00～5.00 min，10%A，5.01～6.00 min，10%～18%A，6.01～16.00 min，18%A，16.01～17.00 min，18%～20%A，17.01～32.00 min，20%A，32.01～33.00 min，20%～50%A，33.01～45.00 min，50%A，45.01～50.00 min，10%A。檢測波長：苦杏仁苷207nm，0～16min；橙皮苷283 nm，16～25 min；迷迭香酸330 nm，25～30 min；甘草酸250nm，35～50min。流速：1.0mL/min；柱溫：35℃，進樣量：5 μL。

2.1.2 對照品溶液配制

2.1.2.1 對照品貯備液配制 精密稱取苦杏仁苷16.55 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含3.31 mg苦杏仁苷的貯備液；精密稱取橙皮苷16.40 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含3.28 mg橙皮苷的貯備液；精密稱取迷迭香酸4.41 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含0.441 mg迷迭香酸的貯備液；精密稱取甘草酸單銨鹽9.34 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含1.868 mg甘草酸單銨鹽的貯備液。

2.1.2.2 混合對照品溶液配制 分別精密量取苦杏仁苷貯備液4 mL、橙皮苷貯備液2 mL、迷迭香酸貯備液1 mL、甘草酸單銨鹽貯備液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含苦杏仁苷1.324 0 mg、橙皮苷0.656 0 mg、迷迭香酸0.044 1 mg、甘草酸單銨鹽0.186 8 mg的混合對照品溶液。（甘草酸質量=甘草酸單銨鹽質量/1.020 7）

2.1.3 供試品溶液配制 精密量取陳皮麻黃飲水提液20 mL，水浴蒸干，加甲醇20 mL超聲30 min，轉移至20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.4 陰性對照品溶液配制 取缺少苦杏仁、陳皮、紫蘇子、甘草的陰性對照樣品，按上述供試品溶液的制備方法制備，即得陰性對照品溶液。

2.1.5 系統適應性試驗 取上述混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液適量，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，見圖1。由圖1可知，供試品溶液色譜圖中，在與對照品色譜相應位置上有相同的色譜峰，且陰性對照對測定無干擾，說明該方法可行。

圖1 HPLC色譜圖

2.1.6 線性關系考察 將混合對照溶液稀釋為系列對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，測定峰面積，以峰面積為縱坐標，對照品溶液濃度為橫坐標，進行線性回歸計算，即得苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸單銨鹽的回歸方程、相關系數及線性范圍。結果表明4種指標成分在各自含量范圍內線性關系良好。（見表1）

表1 線性關系考察結果

2.1.7 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液5 μL，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣測定5次，以峰面積指標計算RSD（n=5）。結果顯示苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸單銨鹽峰面積的RSD分別為0.92%、1.02%、1.03%、0.97%，表明儀器精密度良好。

2.1.8 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、24 h，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，測定峰面積，計算苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸單胺鹽峰面積RSD，RSD分別為1.02%、1.05%、1.23%、2.69%（n=5），表明供試品溶液在24 h內的穩定性良好。

2.1.9 重復性試驗 取同一水提液適量，按“2.1.3”平行制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，同時測定苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸單銨鹽的峰面積，計算其峰面積RSD，RSD分別為0.94%、0.45%、0.67%、2.16%（n=6），表明方法重復性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗 精密吸取已知含量的供試品溶液10 mL，共6份，分別置于20 mL量瓶中，分別精密加入各對照品溶液，加水定容至刻度，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，測定苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸單銨鹽峰面積，由回歸方程計算，計算平均加樣回收率和RSD?？嘈尤受铡⒊绕ぼ?、迷迭香酸、甘草酸單銨鹽平均加樣回收率分別為95.32%、96.64%、96.09%、95.87%，其RSD分別為4.63%、3.05%、4.89%、2.80%，均小于5%。

2.2 紫外-分光光度法（UV）測定陳皮麻黃飲中總黃酮的含量

2.2.1 供試品溶液的制備 取20 mL濃縮水提液置于蒸發皿中，水浴蒸干后加入20 mL甲醇，超聲30 min，置于20 mL容量瓶中，定容，得甲醇提取液。精密吸取甲醇提取液1 mL，置于10 mL容量瓶中，定容，即得供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的配制 準確稱量橙皮苷對照品7.03 mg，置于20 mL容量瓶中，用甲醇定容到刻度，搖勻，即得0.351 5 mg/mL的對照品溶液。

2.2.3 顯色劑的配制 稱取ZrOCl2·8H2O固體2 g置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配成2%ZrOCl2·8H2O甲醇溶液。

2.2.4 測定方法及波長的選擇 參考相關文獻[1-2]，準確吸取供試品溶液、對照品溶液各1 mL，置于20 mL容量瓶中，分別加入1 mL 2% ZrOCl2·8H2O甲醇溶液進行顯色，再加入甲醇定容至刻度，搖勻。用2% ZrOCl2·8H2O甲醇溶液作為空白對照，放置15 min后，用紫外-可見分光光度計在200～600 nm波長處進行全波段掃描，結果顯色的供試品溶液、對照品溶液在313 nm波長處有最大吸收，故選擇總黃酮的測定波長為313 nm。

圖2 全波段掃描光譜圖

2.2.5 線性關系考察 取0.351 5 mg/mL對照品溶液0.6、0.8、1、1.2、1.4 mL分別置于20 mL容量瓶中，加入1 mL 2%ZrOCl2·8H2O甲醇溶液，用甲醇定容至刻度，搖勻。在313 nm波長處進行檢測，結果在0.021 09～0.049 21 mg/mL范圍內具良好線性，回歸方程y=15.092x+0.011 1，R2=0.999 6。

2.3 層次分析法（AHP）確定各考察指標的權重系數 參考相關文獻[3-5]，根據本方的配伍特點、各藥材的實際配比及藥理作用強弱，采用AHP法將橙皮苷、苦杏仁苷、迷迭香酸、甘草酸、總黃酮含量這5個指標的重要程度予以量化，確定各指標優先順序：橙皮苷＞苦杏仁苷=迷迭香酸＞甘草酸＞總黃酮，具體判斷矩陣見表2。采用幾何平均法計算得橙皮苷、苦杏仁苷、迷迭香酸、甘草酸、總黃酮含量權重系數分別為0.449 8、0.193 7、0.193 7、0.105 0、0.057 7，隨機一致性比率（CR）＜0.1，說明指標優先比較判斷矩陣滿足一致性要求，權重系數有效、可行。

表2 各指標5個層次的優先矩陣

2.4 Box-Behnken響應面法優化水提工藝

2.4.1 水提工藝 稱取處方量1/10藥材，置于500 mL具塞三角燒瓶，加適量純水，浸漬30 min后，加熱煮沸，調至慢火，靜置，抽濾，濾液濃縮至100 mL。

2.4.2 響應面設計及結果 本制劑是以原藥材飲片進行投料煎煮的傳統劑型，方中含有較多根莖類及種子類堅實藥材，水提過程中擴散較慢，為利于成分充分浸出，參考相關文獻[6-9]，并根據前期單因素實驗結果，以溶媒用量、提取次數和提取時間為影響因素，確定優化范圍，以5個指標含量作為水提工藝的考察指標，設計3因素3水平Box-Behnken響應面實驗（見表3），按照實驗安排表（見表4）平行稱取17份藥材按照“2.4.1”項下方法進行實驗，按照“2.1.1”項下方法測定苦杏仁苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸含量，按照“2.2.4”項下方法測定總黃酮含量，結合歸一化法和權重系數計算總分，總分=（苦杏仁苷含量×0.193 7/最大苦杏仁苷含量+橙皮苷含量×0.449 8/最大橙皮苷含量+迷迭香酸含量×0.193 7/最大迷迭香酸含量+甘草酸含量×0.1050/最大甘草酸含量+總黃酮含量×0.057 7/最大總黃酮含量）×100，結果見表4。

表3 Box-Behnken實驗設計因素水平表

表4 響應面實驗安排及結果

2.4.3 實驗結果分析 利用方差分析對各因素進行多元二次回歸，得到的回歸方程Y=64.70+6.00A+13.99B+2.92C+4.42 AB+5.84A2+7.67B2，響應面結果的方差分析見表5，結果顯示，水提工藝考察的3個因素中，溶媒用量（A）為顯著項，提取次數（B）為極顯著項，提取時間（C）為不顯著項；二次項中，B2為顯著項，表明考察因素與響應面值之間并非簡單的線性關系。模型整體具有極顯著性（P=0.000 6），且失擬合程度不顯著（P=0.705 3），表明模型能較好地反映溶媒用量（A）、提取次數（B）、提取時間（C）與評價指標加權得分（Y）之間的變化關系，能夠預測和分析該水提工藝。按照所得模型繪制的溶媒用量、提取次數、提取時間的交互作用對陳皮麻黃飲的水提工藝影響的3D響應面圖和等高線圖見圖3，從圖3中可以看出，考察的3個對象3者交互作用不明顯。軟件Design Expert 12得出陳皮麻黃飲的水提工藝為溶媒用量12倍，提取次數3次，每次提取時間1 h。

圖3 溶媒用量（A）、提取次數（B）、提取時間（C）交互作用的三維響應面圖

表5 綜合得分回歸模型方差分析表

2.4.4 驗證實驗 按照優選工藝，進行3次平行驗證實驗，結果見表6，綜合評分說明優選的提取工藝合理可行?？嘈尤受?、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸、總黃酮平均含量分別為1.060 7、0.454 6、0.034 7、0.105 6、8.203 6 mg/mL，RSD分別為4.05%、4.70%、1.36%、2.65%、1.18%，預測綜合得分102.61，實際綜合得分（101.28±3.10），RSD為3.06%，與預測值差異較小，且在合理范圍內，表明提取工藝結果穩定，預測結果可信。

表6 驗證實驗結果

3 討 論

陳皮麻黃飲的組方為9種常見的中藥，處方來源為二陳湯和三子養親湯加減化裁而成。本研究根據其組方配伍特點，選擇制劑中有效成分和組分作為評價指標進行研究。方中陳皮為君藥，研究表明橙皮苷為陳皮的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗細菌、抗病毒、抗腫瘤、抗過敏、調節免疫力等藥理作用[10]；苦杏仁中的苦杏仁苷具有止咳、平喘、抗肺纖維化等藥理作用[11]；迷迭香酸為紫蘇子主要的酚酸類活性成分[12]；甘草酸為甘草中主要活性成分之一[13-14]；黃酮類化合物是植物中重要的次生代謝產物，在抗病毒、抗炎、降血脂、降血糖、抑菌和抗癌等方面發揮著重要的作用[15]。從有效成分充分提取的角度考慮，結合該方的君、臣、佐、使配伍關系，將橙皮苷、苦杏仁苷、迷迭香酸、甘草酸及總黃酮的含量作為考察指標，采用AHP法對指標賦權并結合歸一化法計算各組實驗總分，同時也兼顧處方的配伍特點及藥效物質基礎，既能有效保障提取的全面性，又符合中醫整體論治的指導原則[16]。

中藥復方提取液中黃酮類物質種類繁多，理化性質也存在差異，而UV法的專一性較差，本課題組在預實驗中采用直接UV法測定總黃酮含量，由于存在較強的背景吸收而導致測定值偏高。陳皮麻黃飲中以陳皮為君藥，其主要的有效成分為橙皮苷，屬于二氫黃酮類化合物，在硝酸鋁顯色體系中不能產生特征吸收峰，因此，本實驗最終采用ZrOCl2比色法，利用水提液中的黃酮類成分與ZrOCl2絡合反應后，在313 nm波長處吸光度值發生顯著變化，所測得的吸光度值與水提液中的黃酮類組分在0.021 09～0.049 21 mg/mL范圍內具良好線性關系，而水提液中的其他組分在該波長下無吸收，因此可較好避免背景吸收的干擾。

本實驗采用的Box-Behnken是響應面設計中常用方法，與正交法相比，響應面法優點在于精確度更高、模擬程度更好，更適合于多因素、多水平共同影響的實驗，也兼顧了影響因素及各因素間的交互作用，通過二項式能更準確地獲取與真實實驗接近的最優條件[17]。本次優化的提取工藝簡便易行，預測效果好，可以為進一步的制劑研發提供理論依據。