無機元素指紋圖譜結合化學計量學對甘草元素富集規律及產地溯源的研究*

于喆源，韋志超，王昭國，王 繼，楊璽文

（張掖市質量檢驗檢測研究院，甘肅 張掖 734000）

甘草（Glycyrrhiza uraiensis Fisch）作為應用最廣泛的傳統食藥同源植物之一，為豆科（Leguminosae）甘草屬甘草、脹果甘草或光果甘草的干燥根及根莖，具有解毒鎮痛、祛痰止咳、調和百藥的功效[1-2]。研究表明，無機元素通過與人體內有機物形成配位鍵，承擔多種生物功能；同時在體外還可以與其他分子結合，產生協調增效作用[3]。所以，通過考察甘草中元素含量，可以明顯地區分產地、基源、是否經過炮制等信息，從而更加全面地對甘草進行質量評價。指紋圖譜是近年來用于表征天然植物中多成分特征的一種綜合性質量分析方法，可以較為全面地反映出天然植物多成分體系的整體狀況[4-5]，同時在產地溯源等非直接質量評價方面具有非常重要的意義[6-8]。一般指紋圖譜常用于天然植物內有機活性成分的分析，對甘草中元素進行指紋圖譜分析結合化學計量學進行品質評價的報道相對較少。因此，本實驗采用電感耦合等離子質譜儀（ICP-MS）[9-10]，以27種無機元素的穩定同位素含量為指標建立無機元素指紋圖譜，并采用化學計量學手段對指紋圖譜信息進行化學模式識別研究，以期找到甘草內無機元素的累積規律，為更加合理地對甘草整體元素富集情況評價和產地溯源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料硝酸（優級純，成都市科隆化學品有限公司），純化水，元素標準溶液信息見表1。

表1 元素標準溶液信息

本實驗藥材采集自甘肅張掖各縣區不同生長區域，經張掖市質量檢驗檢測研究院藥品檢驗中心楊璽文工程師鑒定為豆科甘草屬甘草（Glycyrrhiza uraiensis Fisch）根莖，采集后陰涼處自然晾干，放入自封袋保存備用。樣品信息見表2。

表2 14批甘草藥材來源信息

1.2 儀器及設備電感耦合等離子質譜儀（ICP 2030，日本島津公司）；超純水機（Q-GardA2，默克密理博公司）；萬分之一電子天平（GL224i-1SCN，賽多利斯公司）；微波消解儀（Mars6，美國CEM公司）。

1.3 方法

1.3.1 供試品溶液的制備 精密稱取約0.4 g甘草樣品粉末于聚四氟乙烯消解罐中，加入濃硝酸5 mL，輕輕振蕩后混勻置微波消解儀內，按照表3消解程序升溫消解，消解完成后，冷卻至室溫，加少量純化水潤洗并轉移至50 mL量瓶中定容，得待測溶液。標準物質和空白對照采用同樣方式消解處理。

表3 微波消解程序

1.3.2 標準溶液的制備 將元素標準溶液用2% HNO3配制成相應的標準工作液。其中Ag、As、Au、Ce、Co、Cs、I、La、Mo、Ni、Pd、Se、Sn、Te、Ti、W、Y元素濃度梯度為0、0.05、0.25、0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/L；Ba、Cu、Fe、Sr、Zn元素濃度梯度為0、1.0、5.0、10.0、20.0、100.0、200.0、500.0、1 000.0 μg/L；Pb元 素濃度梯度為0、0.05、0.25、0.5、1.0、5.0、10.0、25.0 μg/L；Al、Mn元素濃度梯度為0、1.0、5.0、10.0、20.0、100.0、200.0 μg/L；Cr、V元素濃度梯度為0、0.05、0.25、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/L。

1.3.3 儀器參數設置ICP-MS參數設置：射頻功率為1 200 W，等離子體氬氣體積流量8 L/min，輔助氣體積流量1.1 L/min，載氣體積流量0.7 L/min，采樣深度5 mm，池氣體6 mL/min，池電壓-21 V，能量過濾器7.0 V；儀器調諧主要技術指標：常規分析靈敏度指標115 In＞40 000 cps；方法選擇：碰撞模式，池氣體6 mL/min，池電壓-21 V，能量過濾器7.0 V；內標溶液Bi、Ge、Sc、Rh、Re、In用于監測基質效應，同時在線加入，進行內標法定量。每個樣品重復測定3次，取平均值。

1.3.4 標準曲線的繪制 根據試樣中27種無機元素含量，配制系列質量濃度標準溶液，在優化的實驗條件下采集標準溶液，以各元素質量濃度為縱坐標（X），內標校正后的峰強度為橫坐標（Y），繪制標準曲線，得各元素對照品的回歸方程。（見表4）

表4 各元素回歸方程，相關系數和線性范圍

1.3.5 方法驗證 取1號甘草藥材的消化后定容溶液，連續進樣3次，考察其目標待測元素含量，RSD均小于5%；3水平加標回收試驗，回收率均在80%以上，符合指紋圖譜要求[11]。

2 結果與分析

2.1 指紋圖譜的建立及相似度分析由于甘草的各無機元素含量差異極大，直接比對會造成不便。為便于無機元素指紋圖譜繪制和比較研究，故對得到各元素含量縮放至同一數量級后，以元素種類為橫坐標，相對含量為縱坐標繪制指紋圖譜。（見圖1）可以看出，不同批次的甘草藥材在元素含量上有一定差異，但是曲線趨勢大致相同，這種趨勢特征可作為甘草的產地特征。指紋圖譜相似度采用夾角余弦相似度進行表征，夾角越小，余弦值越接近于1，則越相似，結果見表5所示，表明樣品甘草在元素富集特征存在比較明顯的一致性，S14樣品因生長年限為多年生，從圖譜可以看出雖然元素組成及比例與其他樣品相似，但相似度分析與其他樣品還是具有明顯的區別。

表5 龜齡集元素指紋圖譜相似度分析

圖1 甘草元素指紋圖譜

2.2 化學計量學

2.2.1 聚類分析 運用IBM SPSS 19.0統計分析軟件，以14批不同生長區域甘草的27個元素含量作為變量，采用組間連接聚類方法，以歐式距離平方為度量標準進行系統聚類分析[12]。從聚類結果來看，當分類距離d＝10～15時，14批不同生長區域的甘草可聚分為3類：編號為S2的為一類；S4、S12、S6的樣品分別為一類；其余樣品為一類。甘草元素具有較高的相似性，但可以看出采自甘肅省張掖市不同區域的甘草間依然存在差別，其中肅南裕固族自治縣樣品和其他采自張掖市的樣品存在明顯的差分，且當分類距離小于5時，可以看到不同縣區存在聯系，來自張掖市不同縣區的樣品存在差分；不同縣區的絕大部分分為一類。14批甘草聚類分析樹狀圖見圖2。

圖2 14批甘草樣品聚類分析結果

2.2.2 主成分分析 以主成分的特征根和貢獻率作為選擇主成分的依據，將14批不同生長區域甘草樣品的27個元素含量作為變量導入統計分析軟件進行因子分析。結果，提取到5個主成分因子，其累積貢獻率＞0.9，其中前3個累積方差貢獻率為82.861%，表明前3個主成分因子即可以代表樣品80%以上的信息；主成分因子1、2、3可作為甘草藥材元素評價指標，適用于主成分分析。主成分因子的特征值和方差貢獻率見表6。

表6 甘草藥材元素主成分特征根和貢獻率

將得到的成分矩陣進行正交旋轉，得到27個指標在3個主成分中的旋轉矩陣。結果顯示見表7，27個元素對主成分均具有較明顯的貢獻率，其中Al、Co、Cr、La、Fe貢獻率最大，對甘草整體元素水平的評價具有意義，同時這些貢獻率大的元素對人體也具有明顯的生物學意義，如：Fe參與人體造血和免疫，可影響神經系統[13-14]；Cr可影響糖脂代謝，要通過激活體內鉻調素來協同或增強胰島素功能而發揮作用[15]；Co以維生素B12和輔酶形式在人體內發揮重要生理作用[16-17]；Al、La則會對人體產生一定的不良影響[18-20]。

表7 旋轉成分矩陣

續表7：

以W1、W2、W3代表3個主成分來作為14批甘草樣品元素成分所表達的信息，以其27個元素含量標準化處理后值A為變量，進行向量運算，建立品質評價模型[9]。得到第一主成分的線性關系表達式為：W1=0.943A1+0.669A2+0.979A3+0.988A4+0.901A5+0.984A6+0.989A7+0.836A8-0.573A9+0.715A10+0.955A11+0.773A12-0.225A13+0.978A14+0.256A15+0.036A16+0.339A17+0.715A18+0.599A19+0.264A20+0.903A21+0.600A22+0.986A23+0.967A24-0.039A25+0.0.547A26+0.880A27；第二主成分的線性關系表達式為：W2=-0.085A1+0.282A2-0.002A3-0.021A4-0.215A5-0.011A6-0.073A7-0.084A8+0.284A9-0.286A10+0.042A11+0.176A12+0.304A13+0.042A14+0.925A15+0.860A16+0.686A17-0.286A18-0.201A19+0.897A20-0.100A21-0.252A22-0.060A23-0.087A24+0.898A25-0.002A26+0.027A27；第三主成分的線性關系表達式為：W3=-0.267A1+0.455A2-0.136A3-0.028A4+0.114A5-0.108A6-0.090A7+0.055A8+0.598A9+0.359A10-0.220A11+0.517A12+0.775A13-0.082A14-0.118A15-0.342A16-0.182A17+0.359A18-0.403A19+0.194A20-0.296A21-0.424A22-0.076A23-0.149A24-0.327A25-0.165A26+0.141A27。將上述表達式與所對應的3個主成分的方差貢獻率加權后，得到甘草質量綜合評價函數的表達式為：W（綜合）=（56.911%W1+16.003%W2+9.947%W3）/82.861%，綜合得分越高表示藥材樣品的整體元素含量水平越高[9]。14批甘草樣品主成分得分、綜合得分及排名見表8。

表8 14批不同種植地點甘草元素主成分得分、綜合得分及排名

結果顯示，甘草生長中對于元素積累量與甘草的生長地域有比較明顯的相關性，同時，和甘草的生長年限也有明顯的相關性。評分第一的14號樣品是野生多年生甘草，其根部直徑約4 cm，明顯區別于其他樣品，這與化學計量學的統計結果基本一致。

2.2.3 偏最小二乘法判別分析 以14批甘草樣品中27個共有無機元素穩定同位素含量為變量，進行OPLS-DA分析，結果見圖3，與聚類分析結果一致，張掖市肅南裕固族自治縣種植樣品在左半區，其他采自張掖市的樣品在右半區，且S2號多年生野生甘草也與其他樣品顯示出一定的差異性。通過VIP值篩選出甘草差異較為明顯的的元素，結果見圖4，以VIP值＞1為篩選標準，標記出13個貢獻較大的元素，依次為Ba、Te、Al、Cs、Co、Ce、Fe、La、V、As、Mn、Cr、Y，即上述元素與甘草種植環境具有密切的關系。這與主成分分析得出的結論基本一致。

圖3 14批甘草樣品的OPLS-DA模型得分圖

圖4 14批甘草樣品OPLS-DA模型中共有元素的VIP值

3 小 結

指紋圖譜雖然無法確定被檢測到的所有物質明確的化學組成，但對于天然植物樣品質量控制具有積極的促進作用。

本試驗對同一生態區域不同生長區域的甘草建立了無機元素穩定同位素指紋圖譜。相似度評價結果顯示，14批不同生長區域的甘草樣品在元素種類上基本一致，但含量有一定差距，不同地域和生長時間尤其是多年生野生甘草其元素累計規律存在較為明顯的區別。化學計量學主成分分析結果顯示，Ba、Te、Al、Cs、Co、Ce、Fe、La、V、As、Mn、Cr、Y在特征主成分中具有較大貢獻值。同時從分析結果看，雖然取樣地點從生態學上屬于同一生態區域，但其元素組成依然有明顯的差異性，原因可能與種植地域土壤礦物質及水分等自然條件和肥料施用有關。但因工作條件有限，所采集樣品批次與覆蓋地域較為集中，樣品本身的不均一性引起的誤差被放大，部分結論并沒有完全達到理想預期。但可以看出，通過無機元素穩定同位素指紋圖譜結合化學計量學評價甘草元素富集規律，可以為天然甘草種植年限和種植地域溯源的判定提供一定依據，同時為進一步建立全面的質量評價體系提供一定基礎。未來的工作中，將在此基礎上，進一步擴大取樣的范圍，增加樣品代表性，更加深入地進行試驗。