益腎養卵方對早發性卵巢功能不全患者卵巢儲備功能、卵巢顆粒細胞Bcl-2/Bax的表達及PI3K/AKT信號通路的影響*

張 慧，李雯雯，張建濤

（1.北京航空總醫院，北京 100022；2.首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京 100010；3.中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053）

卵巢功能會隨著女性年齡增大不斷衰退，通常女性月經停止年齡在50.7歲左右[1]，但部分女性在40歲之前出現繼發性閉經，伴低雌激素、促性腺激素升高等，即早發性卵巢功能不全（POI）[2]。POI發生率為1%～5%，且近年來呈現出低齡化的趨勢[3]。當前，POI的致病機制尚不明確，現代醫學認為其與醫源性損傷、免疫、遺傳等因素有密切關聯[4]。越來越多研究指出：卵巢顆粒細胞自噬可能與POI的發生與進展有密切關聯[5]。中醫學認為其病機在于腎虛血瘀，以致邪盛正衰，久而促成POI[6]，與現代醫學中磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路介導卵巢顆粒細胞自噬引起POI有一定相關性。本次研究旨在觀察益腎養卵方治療POI療效，并分析其對PI3K/AKT信號通路的影響，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 診斷標準

1.1.1 西醫診斷標準 參考《早發性卵巢功能不全的臨床診療中國專家共識》[7]與《婦產科學》[8]擬定POI臨床診斷標準：（1）年齡＜40歲；（2）月經紊亂（閉經、月經稀發）超過4個月；（3）連續2次（間隔4～6周）血清促卵泡生成素（FSH）＞25 mIU/mL，雌激素波動性下降。

1.1.2 中醫診斷標準 參考《中醫婦科學》[9]擬定POI中醫診斷標準。主癥：月經提前或推后，量少色淡紅（深紅），或月經停閉。次癥：腰膝酸軟，形體消瘦，潮熱盜汗，肢麻耳鳴，失眠健忘等，舌紅，苔少，脈細緩。具備主癥與至少2項次癥，結合舌脈即可診斷。

1.2 納入標準（1）年齡＜40歲的育齡期女性；（2）符合POI中西醫診斷標準；（3）近3個月內未接受相關治療；（4）同意參與本次研究，并簽署知情同意書。

1.3 排除標準（1）輸卵管不通、先天性性腺發育不全、生殖道畸形等器質性疾病者；（2）合并內分泌疾病或嚴重心肝腎原發性疾病者；（3）年齡≥40歲；（4）依從性較差，無法配合治療者。

1.4 研究對象選取2019年1月至2020年3月在北京航空總醫院中醫門診及婦科接受治療的POI患者120例，采用隨機數字表法將患者分為對照組與治療組，每組60例。本次研究經北京航空總醫院倫理委員會批準同意進行，研究過程遵守相關倫理學要求，倫理學審批號：201900152。

1.5 治療方法

1.5.1 對照組 患者于月經周期第5天起服用雌二醇地屈孕酮片[Abbott Biologicals B.V.（荷蘭），批準文號：H20150345，規格：2 mg/片]進行治療，1粒/次，1次/d，餐后0.5 h口服。停藥后若未出現月經來潮，則在停藥7 d后繼續服藥治療，若月經來潮，則在第5天開始重復使用。

1.5.2 治療組 在對照組基礎上加用益腎養卵方治療，方藥組成：熟地黃20 g，鹿角膠、菟絲子、女貞子、山藥、枸杞子各15 g，丹參、山萸肉、淫羊藿、覆盆子各10 g，陳皮、砂仁各6 g。1劑/d，加清水煎煮，取300 mL水煎液早晚分服。

兩組均以3個月經周期記為1個療程。

1.6 觀察指標

1.6.1 中醫證候積分 參考《中藥新藥臨床研究指導原則（試行）》[10]并結合患者具體癥狀表現進行評分，主癥按照癥狀嚴重程度無、輕度、中度、重度分別計0、2、4、6分，次癥按照癥狀嚴重程度無、輕度、中度、重度分別計0、1、2、3分，評分越高提示癥狀越嚴重。

1.6.2 卵巢儲備功能 患者月經周期第3～5天，清晨空腹抽取5 mL肘靜脈血，室溫下靜置1～2 h，離心（3 000 r/min，15 min），取血清液，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清抗苗勒管激素（AMH）水平（試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司，批號：ARB10908），化學發光免疫法檢測血清FSH、雌二醇（E2）、黃體生成素（LH）水平（上海滬震實業有限公司，FSH試劑盒批號：hz-H0760c，E2試劑盒批號：hz-0022c；LH試劑盒批號：hz-H0115c），并計算FSH/LH值；通過陰道超聲檢查測定卵巢直徑，并計算卵巢總體積TOV（TOV=最大長寬高直徑乘積×π/6）；測定竇卵細胞數量（AFC）。

1.6.3 卵巢顆粒細胞凋亡相關因子（Bcl-2/Bax）、PI3K/Akt信號通路表達水平 蛋白印跡法檢測卵巢顆粒細胞Bcl-2/Bax與子宮前后壁PI3K/Akt信號通路表達水平，冰浴條件下加入細胞裂解液提取總蛋白并測定濃度。取50 μg蛋白上樣，經SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離后轉至PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上，4℃孵育過夜。一抗37℃孵育3 h，二抗37℃孵育1 h，采用Image Lab軟件進行分析處理。

1.7 療效標準參考《中藥新藥臨床研究指導原則（試行）》[10]擬定POI療效標準，痊愈：臨床癥狀、體征均完全消失，經期正常，不孕者妊娠或療效指數≥95%；顯效：臨床癥狀、體征顯著改善，經期恢復（28±7）d，療效指數≥70%，＜95%；有效：臨床癥狀、體征減輕，經期、經量改善，療效指數≥30%，＜70%；無效：未達到上述標準。療效指數=[（治療前中醫證候積分-治療后中醫證候積分）/治療前中醫證候積分]×100%。

1.8 統計學方法研究數據采用SPSS 21.0統計學軟件進行分析處理。療效采用秩和檢驗；中醫證候積分、卵巢儲備功能指標、Bcl-2、Bax、磷酸化PI3K（p-PI3K）、磷酸化Akt（p-Akt）蛋白表達等計量資料采用（±s）表示并進行t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 基線資料兩組患者基線資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。（見表1）

表1 兩組患者基線資料比較（±s）

表1 兩組患者基線資料比較（±s）

組別 例數 年齡（歲） 病程（年）Kupperman評分（分）對照組60 35.17±2.26 3.24±0.87 15.28±3.37治療組60 35.21±2.35 3.18±0.79 15.32±3.64 t 0.095 0.395 0.062 P 0.924 0.693 0.950

2.2 兩組患者療效比較治療組治療總有效率88.33%（53/60）高于對照組的70.00%（42/60）。治療組患者療效顯著優于對照組（P＜0.05）。（見表2）

表2 兩組患者療效比較[例（%）]

2.3 兩組患者中醫證候積分比較與治療前比較，兩組患者治療后中醫證候積分均顯著降低（P＜0.05），且治療后治療組患者中醫證候積分顯著低于對照組（P＜0.05）。（見表3）

表3 兩組患者中醫證候積分比較（±s，分）

表3 兩組患者中醫證候積分比較（±s，分）

組別 例數 治療前 治療后 t P對照組 60 44.92±13.48 35.84±12.16 3.874 0.000治療組 60 44.87±14.53 24.61±11.94 8.345 0.000 t 0.020 5.104 P 0.984 0.000

2.4 兩組患者卵巢儲備功能指標比較與治療前比較，兩組患者治療后AMH、E2、AFC均顯著升高（P＜0.05），FSH、LH、FSH/LH均顯著下降（P＜0.05）；治療后治療組患者AMH高于對照組，FSH、FSH/LH均低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；兩組患者治療前后TOV比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見表4）

表4 兩組患者卵巢儲備功能指標比（±s）

表4 兩組患者卵巢儲備功能指標比（±s）

AMH（ng/mL） FSH（mIU/mL） E2（pmol/L） LH（mIU/mL）治療前 治療后 t P 治療前 治療后 t P 治療前 治療后 t P 治療前 治療后 t P對照組60 0.61±0.42 0.95±0.53 3.895 0.000 30.51±3.39 16.37±5.18 17.692 0.000 93.64±18.37 104.28±12.72 3.689 0.000 9.76±1.34 7.08±2.45 7.434 0.000治療組60 0.58±0.39 1.14±0.48 7.014 0.000 30.67±3.58 13.27±4.94 22.092 0.000 91.86±22.53 107.35±14.81 4.450 0.000 9.83±1.47 6.46±2.21 9.835 0.000 t 0.405 2.058 0.251 3.355 0.474 1.218 0.273 1.456 P 0.686 0.042 0.802 0.001 0.636 0.226 0.786 0.148 AFC（個） TOV（cm3） FSH/LH治療前 治療后 t P 治療前 治療后 t P 治療前 治療后 t P對照組60 2.78±1.2 3.94±2.03 3.802 0.000 5.54±3.62 6.18±2.94 1.063 0.290 3.12±0.18 2.27±0.29 19.290 0.000治療組60 2.59±1.17 4.63±2.27 6.188 0.000 5.63±3.858 6.31±3.24 1.047 0.297 3.15±0.24 2.02±0.21 27.447 0.000 t 0.874 1.755 0.132 0.230 0.775 5.408 P 0.384 0.082 0.895 0.818 0.440 0.000組別 例數組別 例數

2.5 兩組患者卵巢顆粒細胞Bcl-2/Bax、PI3K/Akt信號通路表達水平比較與治療前比較，兩組患者治療后Bcl-2、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2/Bax均顯著升高（P＜0.05），Bax蛋白表達水平均顯著下降（P＜0.05）；治療后治療組患者Bcl-2、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2/Bax均高于對照組，Bax蛋白表達低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（見表5、圖1）

表5 兩組患者卵巢顆粒細胞Bcl-2/Bax、PI3K/Akt信號通路表達水平比較（±s）

表5 兩組患者卵巢顆粒細胞Bcl-2/Bax、PI3K/Akt信號通路表達水平比較（±s）

Bcl-2/β-actin Bax/β-actin治療前 治療后 t P 治療前 治療后 t P對照組60 0.33±0.12 0.51±0.22 5.538 0.000 0.64±0.17 0.53±0.24 2.897 0.004治療組60 0.34±0.16 0.62±0.17 9.290 0.000 0.62±0.21 0.45±0.18 4.761 0.000 t 0.387 3.065 0.573 2.066 P 0.699 0.003 0.567 0.041 p-PI3K/β-actin p-Akt/β-actin治療前 治療后 t P 治療前 治療后 t P對照組60 0.43±0.06 0.52±0.09 6.445 0.000 0.44±0.05 0.48±0.08 3.284 0.001治療組60 0.45±0.08 0.59±0.13 7.104 0.000 0.43±0.06 0.57±0.11 8.655 0.000 t 1.549 3.429 0.992 5.125 P 0.124 0.001 0.323 0.000 Bcl-2/Bax治療前 治療后 t P對照組60 0.52±0.03 0.95±0.06 49.652 0.000治療組60 0.51±0.03 1.23±0.17 32.307 0.000 t 1.826 12.031 P 0.070 0.000組別 例數組別 例數組別 例數

圖1 兩組患者子宮內膜p-PI3K/p-AKT蛋白表達電泳條帶圖

3 討 論

自噬是真核細胞特有的自我降解機制，即通過溶酶體途徑降解受損的細胞器或長壽命蛋白質，是細胞維持穩態必須的機制。一般情況下，自噬維持在正常水平以保持內環境穩態，但氧化應激、炎癥反應等不良刺激均可引起自噬水平的變化，自噬水平異常上調可引起細胞凋亡，卵巢顆粒細胞自噬導致卵泡細胞過早過快鎖閉可能是引起POI的主要原因之一[11]。自噬是由相關信號通路與自噬基因調控的，其中PI3K/AKT信號通路與卵巢顆粒細胞自噬關系最為密切。PI3K是由調節亞基（p85）與催化亞基（p110）構成的異源二聚體，酪氨酸激酶受體可與p85相結合，同時解除對p110的抑制，使其與p85羧基端相結合，并促進二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）轉變為三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）激活Akt。之后Akt構象變化并磷酸化，p-Akt作用于下游凋亡相關蛋白并調節自噬水平[12]。Bcl-2、Bax是調節卵巢顆粒細胞凋亡的重要因子，二者互為拮抗作用，Bax蛋白表達水平上調，Bcl-2活性下降會促進細胞凋亡；反之Bcl-2蛋白表達水平上調，Bax活性下降則抑制細胞凋亡[13]。壓力、缺氧、饑餓等應激狀態會抑制Akt活化，繼而誘導細胞自噬，引起細胞凋亡。白俊等[14]研究指出，卡鉑可以通過調節PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導卵巢顆粒細胞自噬。王文靜等[15]研究指出，補腎養精顆?？梢栽黾觩-PI3K、p-Akt蛋白表達，上調下游Bcl-2蛋白表達水平并抑制Bax表達，從而抑制卵泡顆粒細胞凋亡?？梢奝I3K/AKT信號通路與卵泡鎖閉有密切關聯。

自噬參與了細胞增殖、分化、能量調節等諸多生理過程，過度自噬降解細胞生存所必須的成分并誘導細胞凋亡，與中醫學中“邪之所湊，其氣必虛”理念大致相同[6]。疾病可以看做是機體邪氣與正氣斗爭的過程，通常情況下機體處于陰陽平衡狀態，應激狀態下機體正氣不足，PI3K/AKT通路受到抑制，無法調控卵巢顆粒細胞自噬過程，繼而引起卵泡鎖閉，引發POI。POI在中醫學中屬于“不孕癥”“閉經”“月經過少”等范疇?！稖責岱暝础吩疲骸靶爸跏?，蓋以腎氣先虛，故邪乃湊之而伏于少陰”，指出了腎精充盛對抵抗外邪入侵的重要作用?！秼D人歸》云：“婦人所重在血……胎孕乃成”，說明氣血條暢、腎精充盛是胎孕順利的根本?！毒霸廊珪吩疲骸澳I乃精血之?！?，腎藏精，主生殖。若腎氣虛虧，則生殖之精無所養，女性無法正常排卵，則月經失調。故治療POI需補腎益沖，經水自通，胎孕乃成。黎慧[16]研究指出，自擬排卵湯聯合炔雌醇環丙孕酮片可以調控PI3K/AKT信號通路，調節患者激素水平，促使排卵恢復。李鳳英等[17]指出，溫腎助陽調周法可以通過調控PI3K/AKT信號通路，改善患者性激素水平，促進卵巢功能恢復。上述研究均證實補腎中藥可調節PI3K/AKT信號通路，從而改善患者卵巢功能。本研究選用的益腎養卵方由左歸丸化裁而成，方中熟地黃滋陰補血，鹿角膠益精養血，菟絲子滋補肝腎，女貞子補益腎陰，山藥補中益氣，枸杞子滋補肝腎，山茱萸補腎益氣，淫羊藿補腎壯陽，覆盆子固精補腎。女性易因疾病而緊張焦慮以致氣血不通，故佐以丹參清熱活血，陳皮燥濕化痰，砂仁行氣調中。全方滋補腎陰，溫補腎陽，同時通調氣血，健脾養肝?，F代藥理學研究指出，鹿角膠可改善微循環，調節性激素水平；覆盆子可促進排卵；熟地黃可促進卵泡成熟；山茱萸有助于調節性激素分泌。綜上，本方可調節月經周期，改善卵巢功能。

當前，AMH、FSH、AFC、E2、TOV是臨床上評估卵巢儲備功能的重要指標。其中，血清AMH水平不隨月經周期發生波動，具有一定的穩定性，此外血清AMH能夠反映卵泡發育成竇狀卵泡的水平。觀察AMH即可判斷卵巢內是否存有卵泡，是評估卵泡數量的唯一潛在標志，也是反映卵巢儲備功能的理想指標[18]。AFC是指卵巢內直徑2～9 mm的小卵泡，其與女性卵巢儲備功能呈正相關性。FSH/LH是反映卵巢功能的重要指標，FSH/LH＞2～3.6提示卵巢儲備功能不良[19]。本研究結果表明，與治療前比較，兩組患者治療后卵巢儲備功能指標AMH、E2、AFC均顯著升高（P＜0.05），FSH、LH、FSH/LH均顯著下降（P＜0.05），提示兩種治療方法均能改善POI患者卵巢儲備功能。治療后，治療組患者AMH高于對照組（P＜0.05），FSH、FSH/LH低于對照組（P＜0.05），結合兩組患者臨床療效與中醫證候積分提示益腎養卵方治療POI效果更佳。益腎養卵方治療POI的主要作用機制在于調控PI3K/AKT信號通路，并調節Bcl-2/Bax的比值，該比值越大，說明抗凋亡能力越強[20]。治療后，兩組患者p-PI3K、p-Akt蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05），提示PI3K/AKT信號通路被激活，并調控下游Bcl-2、Bax蛋白表達。治療后兩組患者Bcl-2、Bcl-2/Bax均顯著升高（P＜0.05），Bax蛋白表達水平均顯著下降（P＜0.05），且治療組患者Bcl-2、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2/Bax均高于對照組（P＜0.05），Bax蛋白表達低于對照組（P＜0.05），提示益腎養卵方可以通過調節PI3K/AKT信號通路，抑制卵巢顆粒細胞過度自噬，減少細胞凋亡，從而改善POI患者疾病癥狀，提高卵巢儲備功能。

綜上所述，益腎養卵方可以調節PI3K/AKT信號通路，上調Bcl-2并抑制Bax蛋白表達，避免卵巢顆粒細胞過度自噬，從而減少卵巢顆粒細胞凋亡，提高患者卵巢儲備功能。