原發(fā)性失眠患者中醫(yī)證型與神經(jīng)肽S受體基因rs324981多態(tài)性的相關(guān)性*

楊 軍，謝宇平，蘇曉艷，馬 薇，惠培林，周麗雅

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院睡眠醫(yī)學(xué)中心，甘肅 蘭州 730000）

失眠癥是患者對睡眠時間和（或）質(zhì)量不滿足并影響日間功能的一種主觀體驗，其具體表現(xiàn)在睡眠-覺醒節(jié)律紊亂過程中睡眠時間及深度的不足[1]。我國失眠癥的發(fā)生率高達(dá)45.4%[2]。研究證實長期失眠會增加心腦血管疾病、高血壓、焦慮、抑郁、癡呆和免疫力低下等的風(fēng)險[3-6]，并且也是導(dǎo)致工作、學(xué)習(xí)效率低下和工業(yè)事故的主要原因之一[7]。失眠癥按照病因分為繼發(fā)性失眠和原發(fā)性失眠（primary insomnia，PI），PI是指出現(xiàn)睡眠障礙（難以入睡和/或睡眠維持困難或睡眠后精力未恢復(fù)），病程至少持續(xù)1個月，并且引起具有臨床意義的煩惱或者社交、職業(yè)等心理社會功能的損害，排除由于其他睡眠與精神/心理障礙，以及軀體疾病、酒精或藥物等導(dǎo)致的失眠[8]。神經(jīng)肽S（neuropeptide S，NPS）及神經(jīng)肽S受體（neuropeptide S receptor，NPSR）是一種新發(fā)現(xiàn)的睡眠調(diào)節(jié)系統(tǒng)[9]，其中NPSR基因rs324981單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）與人類睡眠習(xí)慣改變密切相關(guān)[10]，并且前期研究也發(fā)現(xiàn)NPSR基因rs324981可能參與了PI的調(diào)節(jié)[11]。目前有較多的研究發(fā)現(xiàn)疾病的中醫(yī)證型與基因存在一定的關(guān)聯(lián)，但尚缺乏NPSR基因rs324981多態(tài)性與PI患者中醫(yī)證型易感性的相關(guān)性研究，故本研究擬探討PI中醫(yī)證型與NPSR基因rs324981多態(tài)性的關(guān)系，旨在從微觀量化指標(biāo)來評價PI中醫(yī)證型。

1 資料與方法

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)PI診斷符合《美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊》第4版（DSM-4）[8]的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[12]、《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》“不寐”[13]中的中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)，辨證為肝郁化火證、痰熱內(nèi)擾證、陰虛火旺證、心脾兩虛證、心虛膽怯證。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)（1）符合PI西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）年齡18～65歲；（3）中國人群；（4）志愿并簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)（1）其他睡眠或精神障礙及酒精、藥物等醫(yī)學(xué)問題引起的繼發(fā)性失眠，尤其是焦慮障礙引起的失眠；（2）高血壓、心臟病、甲狀腺功能障礙、糖尿病、腫瘤等疾病患者；（3）有其他明確的失眠原因，如近期有重大心理應(yīng)激而致失眠者；（4）妊娠、哺乳期婦女；（5）多導(dǎo)睡眠圖（PSG）監(jiān)測結(jié)果為主觀失眠；（6）PSG監(jiān)測結(jié)果顯示呼吸暫停-低通氣指數(shù)（AHI）>5；（7）無法判斷中醫(yī)證型及資料不全者。

1.4 研究對象本研究方案經(jīng)甘肅省人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（編號：sy1120150043），所有受試者均簽署書面知情同意。納入2016年12月至2019年7月就診于甘肅省人民醫(yī)院睡眠醫(yī)學(xué)中心的失眠，為PI組。共收集PI患者154例，男48例，女106例，年齡18～65歲。中醫(yī)辨證：肝郁化火證47例（30.52%），痰熱內(nèi)擾證16例（10.39%），陰虛火旺證60例（38.96%），心脾兩虛證24例（15.58%），心虛膽怯證7例（4.55%）。匹配130名健康者為對照組，來源于甘肅省人民醫(yī)院體檢中心招募的人群，選擇年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）等與PI組相匹配的健康人群，并保證兩組間患者無血緣關(guān)系。共收集健康人群130名，其中男42名，女88名，年齡18～65歲。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 匹茲堡睡眠質(zhì)量指數(shù)（PSQI）評分[14]根據(jù)PSQI評分進(jìn)行睡眠質(zhì)量分級，分別為睡眠質(zhì)量好（≤5分），睡眠質(zhì)量一般（6～11分），睡眠質(zhì)量較差（12～16分），睡眠質(zhì)量很差（17～21分）。

1.5.2 基因分型 采集受試者空腹肘靜脈血，取乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝全血2 mL，將其轉(zhuǎn)移至-70℃的低溫冰箱凍存以待提取DNA。采用血液基因組DNA提取試劑盒（北京天根生物技術(shù)有限公司），按照其操作步驟提取基因組DNA。采用NanoDrop2000分光光度計檢測DNA的濃度與純度，1.25%瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA質(zhì)檢合格，-20℃儲存?zhèn)溆谩２捎肁ssayDesigner 3.1軟件進(jìn)行引物設(shè)計，引物由北京博淼生物科技有限公司合成。rs324981引物序列如下，上游引物：ACGT TGGATGCATACCTGCAAATAGCGGAC，下游引物：ACGTTGG ATGCAGGACTGGTCAACATCTTG。使用美國Agena平臺，采用MassARRAYSNP 4.0基因分型實驗技術(shù)，進(jìn)行基因多態(tài)性位點的基因分型檢測。PCR擴(kuò)增反應(yīng):反應(yīng)總體積為5μL含有10ng/μL的模板DNA（1 μL），Primer Mix（1 μL），H2O（1.85 μL），Hot-StarTaq（0.1 μL），MgCl2（0.325 μL），dNTP Mix（0.100 μL），PCR Buffer with 15 mmol/L MgCl2（0.625 μL）。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性20 s，56℃退火30 s，72℃延伸3 min，變性、退火、延伸3個程序共進(jìn)行45個循環(huán),最后在72℃下延伸3 min后得到PCR產(chǎn)物。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。運用哈溫平衡（Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE）檢測驗證對照組遺傳平衡，計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 基線資料及HWE檢驗PI組與對照組性別、年齡、BMI比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。（見表1）

表1 基線資料

應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)在線工具SNP Stats進(jìn)行NPSR基因rs324981多態(tài)性基因型分布頻率的HWE檢測。結(jié)果顯示，對照組NPSR基因rs324981（P=0.878）基因型分布頻率符合HWE條件，具有良好的群體代表性。

2.2 PI患者中醫(yī)證型與NPSR基因rs324981多態(tài)性基因型和等位基因之間的關(guān)系陰虛火旺證患者NPSR基因rs324981多態(tài)性基因型分布與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[P=0.034，OR=2.10，95%CI（1.05，4.19）]，但兩者等位基因分布比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；其他各中醫(yī)證型NPSR基因rs324981多態(tài)性的基因型和等位基因分布分別與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；PI患者各中醫(yī)證型基因型和等位基因分布兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。（見表2）

表2 不同中醫(yī)證型的NPSR基因rs324981多態(tài)性與對照組比較[n(%)]

2.3 虛證、實證PI患者基因分布與對照組比較實證（肝郁化火證、痰熱內(nèi)擾證）PI患者和虛證（心脾兩虛證、心虛膽怯證、陰虛火旺證）PI患者NPSR基因rs324981多態(tài)性基因型和等位基因分別與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；實證與虛證基因型和等位基因比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。（見表3）

表3 虛證、實證PI患者基因分布與對照組比較[n(%)]

2.4 NPSR基因rs324981多態(tài)性與睡眠質(zhì)量水平的關(guān)系PI患者不同睡眠質(zhì)量人群NPSR基因rs324981多態(tài)性的基因型、等位基因分布比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表4）

表4 NPSR基因rs324981多態(tài)性與睡眠質(zhì)量的關(guān)系[n(%)]

3 討 論

NPSR基因rs324981是7號染色體p14.3區(qū)NPSR基因第107個三聯(lián)密碼中A/T突變。研究表明[15]，NPSR基因rs324981的A/T突變導(dǎo)致了活性中心的受體結(jié)合位點一個氨基酸發(fā)生改變（天冬氨酸→異亮氨酸），使NPS敏感性增大了約10倍。另外，NPSR基因rs324981的T基因型可能會導(dǎo)致睡眠潛伏期延長及睡眠持續(xù)時間縮短[16-17]，并且NPSR基因rs324981中TT純合基因型人群比攜帶A基因型人群睡眠時間顯著縮短[17]，而前期研究也發(fā)現(xiàn)攜帶NPSR基因rs324981的T基因型較正常人群更易患PI。

PI屬于中醫(yī)學(xué)“不寐”范疇，其病因主要與飲食、情志、勞倦及年老體虛等因素相關(guān)，病機(jī)總屬陽盛陰衰，陰陽失交。中醫(yī)對于疾病的治療以辨證為基礎(chǔ)，而“證”是中醫(yī)理論的核心。有學(xué)者對“證”與基因多態(tài)性的相關(guān)性進(jìn)行了探究，認(rèn)為兩者之間存在必然的聯(lián)系[18-19]?；蚪M學(xué)研究從整體水平上反映了疾病發(fā)展過程中不同階段基因隨時空變化表達(dá)的動態(tài)演變過程，而中醫(yī)學(xué)的“證”則為不同階段病因病機(jī)的高度概括,并且中醫(yī)學(xué)的“證”與基因遺傳多態(tài)性都具有“個體化”的特點，可見兩者之間有著共同的物質(zhì)基礎(chǔ)，而這種物質(zhì)基礎(chǔ)很有可能反映在基因或基因組水平上。因此，基因檢測技術(shù)可應(yīng)用于探索中醫(yī)證型分類的微觀分子基礎(chǔ)。目前已有較多學(xué)者在高血壓、冠心病、腦卒中、腫瘤等疾病中醫(yī)證型與基因多態(tài)性相關(guān)性方面作了有益探索。胡霖霖等[20]研究發(fā)現(xiàn)，失眠障礙患者的中醫(yī)證型與5-HTTLPR/5-HTTVNTR基因多態(tài)性分布相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)NPSR基因rs324981多態(tài)性表達(dá)水平在PI各中醫(yī)證型及對照組中均有表達(dá)。PI陰虛火旺證患者NPSR基因rs324981多態(tài)性基因型分布與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[P＜0.05，OR=2.10，95%CI（1.05，-4.19）]。154例PI患者中陰虛火旺證患者占多數(shù)，這一結(jié)果可能與該證型患者年齡較大有關(guān)，年齡為（51.97±6.73）歲，高于其他證型（P＜0.05）。PI失眠陰虛火旺證患者的病因病機(jī)為久病和/或年老致患者體內(nèi)津液虧虛，陽不交陰、陰虛不斂而陰陽失交，臟腑功能紊亂、陰虛火旺擾亂心神故而失眠。而PI排除由于其他睡眠與精神/心理障礙，以及軀體疾病、酒精或藥物等導(dǎo)致的失眠，因此陰虛火旺證較好地反映了PI的病因病機(jī)。NPS-NPSR是一種新發(fā)現(xiàn)的系統(tǒng)，目前該領(lǐng)域的研究主要以動物研究為主，而臨床研究較少，并且與中醫(yī)證型易感性的研究更是空白，因此本研究結(jié)果缺乏對比。

NPS-NPSR系統(tǒng)促覺醒作用明顯，主要表現(xiàn)為延長睡眠潛伏期，減少覺醒向慢波睡眠的轉(zhuǎn)換次數(shù)，增加覺醒時間，縮短慢波睡眠和快速眼動睡眠時間[21-22]。不同睡眠質(zhì)量的失眠患者所對應(yīng)的睡眠特征存在差異，而不同睡眠特征所構(gòu)成的中醫(yī)證型也存在差異。本研究通過對PI患者PSQI量表的評估，分析NPSR基因rs324981多態(tài)性突變是否與睡眠質(zhì)量存在相關(guān)性。結(jié)果表明，不同睡眠質(zhì)量患者所攜帶的NPSR基因rs324981多態(tài)性的基因型、等位基因分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。因此，NPSR基因rs324981多態(tài)性可能未參與睡眠質(zhì)量的調(diào)節(jié)。NPSR基因rs324981多態(tài)性是否與睡眠結(jié)構(gòu)參數(shù)存在相關(guān)性，還需通過多導(dǎo)睡眠監(jiān)測參數(shù)進(jìn)一步分析。

綜上所述，易感基因NPSR基因rs324981多態(tài)性表達(dá)水平可能影響PI患者陰虛火旺證的發(fā)生。但本研究也存在研究樣本量較小、缺乏對比研究等缺陷。因此，未來需要在大樣量的基礎(chǔ)上增加更多NPSR多態(tài)性位點，以便更加清晰地揭示NPSR基因多態(tài)性與PI中醫(yī)證型易感性的關(guān)系，以促進(jìn)PI中醫(yī)證候的客觀化和標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展，為以后PI患者提供更加精準(zhǔn)的治療策略。