蛋雞輸卵管炎造模方法的篩選與驗證

朱永明 王倩 宋玉卓 郗艷菊 郭永紅 范開

摘 要：為了篩選蛋雞輸卵管炎造模方法，采用30%苯酚膠漿和大腸桿菌、沙門氏菌混合菌液分別對健康蛋雞進(jìn)行造模，通過觀察造模后蛋雞的精神狀態(tài)、輸卵管病理切片、酶聯(lián)免疫吸附法檢測炎癥因子IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量對造模效果進(jìn)行評價。結(jié)果表明，30%苯酚混合明膠、甘油注入蛋雞子宮部可造成輸卵管炎，表現(xiàn)為不安，喜臥，站立不直，被毛凌亂，產(chǎn)蛋困難，黃白色分泌物增多;其所產(chǎn)的雞蛋蛋殼表面出現(xiàn)血跡，有大小不等的顆粒;輸卵管被覆上皮增厚，嗜中性粒細(xì)胞浸潤，并有彌漫的趨勢;血清中IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量均顯著高于對照組（P<0.05）;而大腸桿菌、沙門氏菌混合菌液造模不會導(dǎo)致輸卵管炎，與對照組相比無差別。本試驗結(jié)果顯示，30%苯酚膠漿導(dǎo)入輸卵管子宮部可以建立良好的輸卵管炎模型，優(yōu)于大腸桿菌和沙門氏菌的混合菌液模型。

關(guān)鍵詞：蛋雞;輸卵管炎;造模;驗證

中圖分類號：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B文章編號：1673-1085（2021）10-0005-06

收稿日期：2021-08-20

*基金項目：河北省功能性飼料添加劑技術(shù)創(chuàng)新中心建設(shè)補(bǔ)助經(jīng)費(fèi)（217790537H）。

作者簡介：朱永明（1992-），女，河北滄州人，碩士，研究方向為微生物學(xué)，E-mail：779546000@qq.com;并列第一作者：王倩（1991-），女，河北石家莊人，學(xué)士，研究方向為制劑工藝研究，E-mail：406299391@qq.com。

**通訊作者：郗艷菊（1981-），女，河北滄州人，碩士，研究方向為動物營養(yǎng)，E-mail：149697628@qq.com。

輸卵管炎是威脅蛋雞健康的常發(fā)病之一，影響蛋雞生產(chǎn)性能的發(fā)揮，多發(fā)生于初產(chǎn)蛋雞、高產(chǎn)蛋雞[1，2]。當(dāng)?shù)半u處于產(chǎn)蛋期，輸卵管每天都高負(fù)荷工作，難免會出現(xiàn)問題;尤其是雞舍環(huán)境不潔凈造成大腸桿菌、沙門氏菌等病原菌容易由泄殖腔侵入輸卵管引發(fā)輸卵管炎，會使產(chǎn)蛋率下降5%～30%，主要造成蛋殼品質(zhì)的下降[3、4]，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖戶的經(jīng)濟(jì)效益。

為了更好地研究蛋雞輸卵管炎，本試驗對輸卵管炎的造模方法進(jìn)行篩選，模擬輸卵管炎的發(fā)病情況，篩選出最佳輸卵管炎造模方法，并通過對蛋雞精神狀態(tài)、輸卵管組織切片以及炎癥因子雞白介素2（IL-2）、雞白介素6（IL-6）、雞腫瘤壞死因子（TNF-α）、雞γ干擾素（IFN-γ）含量進(jìn)行評價，以對造模后輸卵管炎進(jìn)行驗證，為后續(xù)治療蛋雞輸卵管炎藥物的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 試驗材料

1.1 試劑

大腸桿菌、沙門氏菌由實(shí)驗室分離自臨床商品蛋雞輸卵管炎病例;苯酚膠漿由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院實(shí)驗室自制;伊紅-蘇木精購自上海山浦化工有限公司;IL-2試劑盒（E-EL-Ch0120c）、IL-6試劑盒（E-EL-Ch0228c）、TNF-α試劑盒（E-EL-Ch0215c）、IFN-γ試劑盒（E-EL-Ch0026c）均購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。

LB培養(yǎng)基、LA培養(yǎng)基按照微生物學(xué)實(shí)驗教程[5]進(jìn)行配置。

1.2 試驗動物及分組

試驗雞是處于高產(chǎn)期的白萊航蛋雞，90羽，隨機(jī)分為3組，分別為空白組30羽、大腸桿菌與沙門氏菌混合菌液組30羽、苯酚膠漿組30羽。

1.3 主要儀器

MB-530酶標(biāo)分析儀，深圳市匯松科技發(fā)展有限公司;MLS-3020高壓蒸汽滅菌鍋，SANYO;AUW120D電子天平，SHIMADZU;THZ-98AB恒溫振蕩器，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;JB-CJ-2FD潔凈工作臺，蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司;SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博遠(yuǎn)安業(yè)有限公司。

2 試驗方法

2.1 混合菌液制備

用滅菌過的接種環(huán)挑取斜面上的大腸桿菌、沙門氏菌，將菌種接種于LA培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化，然后分別挑取菌落接種到裝瓶量50 mL/300 mL的LB液體培養(yǎng)基中，180 r/min、37 ℃培養(yǎng)18 h，采用10倍法平板計數(shù)估算菌液濃度，分別將大腸桿菌和沙門氏菌菌液濃度調(diào)至2×109 cfu/mL，然后3：2混合，備用。

2.2 30%苯酚膠漿制備

參考文獻(xiàn)[6、7]進(jìn)行改進(jìn)，稱取30 mL 液化苯酚、5 g明膠、20 mL甘油，加蒸餾水至100 mL，置于錐形瓶中，密封保存，備用。

2.3 建模

建模方法參考姬曉琪的方法[6]：取出試驗雞，至于解剖臺上，使其仰臥保定，左手握住兩側(cè)跖部，掌心緊貼著蛋雞的龍骨突，使蛋雞背部靠緊解剖臺，泄殖孔朝上;右手母指和食指分開附于泄殖孔下方的羽毛，輕輕地向下按壓，可見泄殖腔泄殖道背側(cè)寬大的輸卵管口，另一人將藥劑導(dǎo)入距輸卵管口2～3 cm處即可。

試驗前，每天早晚兩次正常飼喂，直至蛋雞產(chǎn)蛋率穩(wěn)定在80%以上后開始建模;空白組（A組）不做處理，苯酚膠漿組（B組）注射1 mL的苯酚膠漿，混合菌液組（C組）注射1 mL的混合菌種培養(yǎng)液。

2.4 觀察及檢測指標(biāo)

2.4.1 觀察蛋雞精神狀態(tài) 觀察蛋雞產(chǎn)蛋量以及異常蛋情況。

2.4.2 病理學(xué)觀察 建模48 h后每組取3只蛋雞進(jìn)行放血和剖檢，觀察氣囊和卵巢組織的變化情況，并取卵巢及輸卵管組織進(jìn)行切片制作。

石蠟切片制作及HE染色流程[8]：固定→沖洗→修塊→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→貼片→烘片→復(fù)水→染色→脫水→透明→封片。

2.4.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗 取全血在37 ℃條件下放置1 h（不加抗凝劑），4 ℃冰箱過夜，當(dāng)血清自然析出后，以 4℃、3000 r/min離心10 min，分離血清，棄去不溶物，將血清移至一干凈離心管，-80 ℃保存?zhèn)溆茫瑓⒖荚噭┖姓f明書步驟進(jìn)行血清中的炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平檢測。

2.4.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，以P<0.05為差異顯著性判斷。

3 結(jié)果

3.1 建模后蛋雞的臨床表現(xiàn)

采用30%的苯酚膠漿對白萊航蛋雞建模后，蛋雞表現(xiàn)為不安，喜臥，站立不直，被毛凌亂，產(chǎn)蛋困難，黃白色分泌物增多，使泄殖孔周圍的羽毛浸入分泌物，泄殖腔有糞便沾染，其所產(chǎn)的雞蛋蛋殼表面出現(xiàn)血跡，有大小不等的顆粒;而混合菌液組則與空白對照組臨床表現(xiàn)一致，二者在蛋雞外觀及雞蛋表面無明顯差別，蛋雞表現(xiàn)站姿正常，羽毛干凈有光澤，泄殖腔無糞便沾染，產(chǎn)蛋順暢，蛋形正常，表面光潔。剖解后，苯酚膠漿組蛋雞氣囊透明，卵巢正常，卵泡排列有序，輸卵管子宮部呈紫紅色，炎癥反應(yīng)明顯;混合菌液組與空白對照組的內(nèi)臟器官均無明顯病變。三組的蛋雞外觀和雞蛋表面變化見圖1、圖2。

3.2 組織病理學(xué)結(jié)果

空白對照組的輸卵管子宮部組織結(jié)構(gòu)完整，層次清晰，細(xì)胞組成正常（圖3，A）。苯酚膠漿組輸卵管被覆上皮增厚，嗜中性粒細(xì)胞浸潤，并有彌漫的趨勢（圖3，B）?；旌暇航M的輸卵管結(jié)構(gòu)與空白對照組相似，未見炎癥特征（圖3，C）。苯酚膠漿呈現(xiàn)良好的建模效果，優(yōu)于混合菌液建模。

3.3ELISA檢測炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量變化

由表1可知，B組蛋雞的血清中IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量均顯著高于空白對照組（P<0.05）且具有統(tǒng)計學(xué)意義;C組蛋雞的血清中IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量與空白對照組相比無明顯差異;B組蛋雞血清中的IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量均顯著高于C組（P<0.05）且具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明B組即苯酚膠漿組可以引起蛋雞輸卵管炎炎癥反應(yīng)。

4 討論

目前輸卵管炎造模以化學(xué)法和病原菌法的方式比較常見?；瘜W(xué)造模法以苯酚為主，具有驗證反應(yīng)快、反應(yīng)明顯等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是與臨床實(shí)際病癥不一致;病原微生物造模法以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等接種為主，具有與臨床實(shí)際病癥一致的優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是反應(yīng)慢、炎癥反應(yīng)不明顯。

張小麗等[9]用15%的液化苯酚，混合適量纖維素，制成苯酚糊劑進(jìn)行大鼠輸卵管炎的造模，結(jié)果顯示用苯酚膠漿注入雙側(cè)輸卵管內(nèi)造成大鼠輸卵管炎癥模型是成功而可行的。苯酚為常用的消毒劑的主要成分之一，使蛋白質(zhì)變性，對黏膜等具有強(qiáng)烈的腐蝕性，可對輸卵管黏膜形成損傷，破壞黏膜的防御功能，從而使定植于泄殖腔的條件性致病微生物侵染而造成輸卵管炎。而自然發(fā)病的蛋雞輸卵管炎亦是蛋雞因產(chǎn)蛋頻繁，輸卵管分泌長期處于旺盛狀態(tài)，當(dāng)身體條件特別是溫度、濕度、營養(yǎng)等因素發(fā)生變化時，部分敏感雞只出現(xiàn)與上述相似情況，條件致病微生物突破黏膜屏障，造成炎癥反應(yīng)。

歐陽紫婷等[10]以大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌按2∶1∶1比例配制成濃度約為3×109 cfu/mL的混合菌，從外陰道插入直達(dá)子宮底部注射，對70只大鼠進(jìn)行輸卵管炎的造模，結(jié)果顯示有50只大鼠造模成功。而禽類與哺乳動物不同，其消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和排泄系統(tǒng)在泄殖腔泄殖道匯合，產(chǎn)卵頻繁造成輸卵管口無法完全閉合，幾乎完全開放于泄殖腔，泄殖腔中常在微生物群落復(fù)雜、豐富，可以隨時進(jìn)入輸卵管中，其中大腸桿菌數(shù)量較多，因此，在黏膜屏障狀態(tài)良好時導(dǎo)入混合菌液無法造成相應(yīng)的效果，因此單純導(dǎo)入混合菌液無法建立炎癥模型。

炎癥在病原體入侵或組織損傷后被激活，在生理上起著保護(hù)宿主正常功能的作用，炎性細(xì)胞因子是指參與炎癥反應(yīng)的各種細(xì)胞因子，主要的炎性細(xì)胞因子包括IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ[11，12]。TNF-α和IFN-γ是在機(jī)體免疫網(wǎng)絡(luò)中起調(diào)節(jié)作用的重要因子，IL-2和IL-6含量可反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱[13]。姬曉琪[6]用25%的苯酚膠漿注射進(jìn)入蛋雞子宮部，觀察發(fā)現(xiàn)蛋雞坐立不安，疼痛，產(chǎn)出帶血跡的蛋，通過檢測炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量發(fā)現(xiàn)顯著高于未造模組，輸卵管病理切片發(fā)現(xiàn)有中性細(xì)胞浸潤，說明用苯酚膠漿可以成功建立蛋雞輸卵管模型。

5 結(jié)論

30%苯酚混合明膠、甘油導(dǎo)入輸卵管子宮部可以建立良好的輸卵管炎模型，優(yōu)于大腸桿菌和沙門氏菌的混合菌液模型。30%苯酚膠漿法造?？梢鸬半u輸卵管的炎癥反應(yīng)，是一種可靠的蛋雞輸卵管炎造模方法。

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Screening and Verification of Modeling Methods for Layer Salpingitis

ZHU Yongming1，3，4，WANG Qian1，3，SONG Yuzhuo1，4，XI Yanju1，3，4*，GUO Yonghong1，3，4，F(xiàn)AN Kai5

（1.Hebei Weierli Animal Pharmaceutical Group Company Ltd， Shijiazhuang Hebei? ?050227， China;

2.College of Life Sciences， Hebei Agricultural University， Baoding Hebei? ?071001， China; 3.Hebei Province Functional Feed Additive Technology Innovation Center，Shijiazhuang Hebei 050227， China;

4.Shijiazhuang Animal Functional Additive Engineering Technology Research Center， Shijiazhuang Hebei? ?050200， China;

5.China Agricultural University，Beijing? ?100193， China）

Abstract： In order to screen the methods of modeling salpingitis in laying hens， 30% phenol glue and mixed bacterial liquid of Escherichia coli and Salmonella were used to model healthy laying hens. The effect of modeling was evaluated by observing the mental state of laying hens， pathological sections of fallopian tubes， and detecting the content of inflammatory factors IL-2， IL-6， TNF-α， IFN-γ by enzyme-linked immunosorbent assay.The results showed that injection of 30% phenol mixed gelatin and glycerin into the uterus of laying hens could cause salpingitis， which manifested as restlessness， lying down， not standing straight， messy coat， difficulty in laying eggs， and increased yellow and white secretions;There were blood stains on the surface of the eggshell， which fulled of particles of varying sizes; the fallopian tube were thickened by the epithelium， infiltrated by neutrophils， and had a tendency to diffuse;The content of IL-2， IL-6， TNF-α and IFN-γ in the serum were significantly higher than the control group（P<0.05）， However， the mixed bacterial solution of Escherichia coli and Salmonella did not cause salpingitis， and there was no difference compared with the control group. The results of this test showed that the introduction of 30% phenol glue into the uterus of the fallopian tube could establish a good salpingitis model， which was better than the mixed bacterial liquid model of Escherichia coli and Salmonella.

Keywords： Laying hen; Salpingitis; Modeling; Verification