響應面法優化提取仿刺參中海參皂苷工藝

劉桂英，王旭達，葛 坤，胡超魁，吳金浩，李 愛，鄭 杰，周遵春

( 1.遼寧省海洋水產科學研究院，遼寧 大連 116023； 2.大連海洋學校，遼寧 大連 116023 )

仿刺參(Apostichopusjaponicus)是食用海參中經濟價值較高的海參之一，具有多種藥理活性成分。研究表明，海參皂苷是主要的活性物質[1]，自1952年Nigrelli等[2]報道了一種從海參體內的居維氏管中分離得到的毒素——海參皂苷以來，已發現并確定結構的海參皂苷有100多種。海參皂苷在體外被證實具有不同程度的抗真菌作用、溶血作用、細胞毒作用、抑制新生血管、調節生長發育等生物活性[3-8]，可作為新型藥物的候選化合物和先導化合物，具有巨大的開發應用價值。

海參皂苷的提取方法有索氏提取法、溶劑浸提法、水煮法、超聲波提取法[9]等。于林芳等[10]通過60%乙醇加熱回流提取海參皂苷，需要3～5 h完成提取；利用大孔吸附樹脂對革皮氏海參(Pearsonothriagraeffei)中總皂苷進行吸附、解吸試驗，經過樹脂的純化，得到較高純度的總皂苷[11]。叢日山等[12]采用水煮法提取海參皂苷，提取時間較長。傳統的提取方法在提取率、耗時、耗能等方面具有很大的改進和提升空間。微波輔助提取法是近年來新興的提取方法，具有加熱速度快，提取時間較短，提取效率高等優點。趙麗蓉等[13]采用微波輔助萃取提取黃精藥材中的總皂苷，提取條件為：乙醇體積分數為50%，料液體積比為1∶16，提取時間為40 s。蘭艷素等[14]采用微波輔助萃取提取廣豆根中的總黃酮，提取時間僅需3 min，提取率較高。微波輔助萃取技術主要應用于中草藥中皂苷的提取，尚未見采用微波萃取技術提取仿刺參中海參皂苷的研究報道。因此，筆者結合微波輻射所具有的特點，采用單因素與響應面優化相結合的方法[15]對海參皂苷提取工藝進行優化，考察微波萃取的最佳提取條件，建立仿刺參中海參皂苷的提取工藝，為仿刺參資源的開發和利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

仿刺參取自遼寧省海洋水產科學研究院引育種中心，均為3齡參。乙醇、甲醇(分析純，國藥集團)；甲醇、乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；固相萃取柱(美國Waters公司，Oasis HLB，6 cc，500 mg)；皂苷標準品Cladoloside A(CA)由本實驗室提供。

1.2 儀器設備

Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)、配有二極管陣列檢測器(DAD)、氮吹濃縮儀(天津市恒奧科技發展有限公司)、Milli-Q超純水儀(美國Milliopore公司)、微波萃取儀(美國CEM公司)、超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、高速組織搗碎機(德國IKA公司，T18 digital)、固相萃取儀(美國色譜科公司)、真空冷凍干燥機(德國Marin Christ公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品液的制備

取3～5頭仿刺參置于冰盤中，取出內臟，將體壁切成小塊，放入真空冷凍干燥機，冷凍干燥48 h。取出搗碎成粉末, 取粉末約0.5 g，加入體積分數70%的乙醇溶液25 mL，微波輔助萃取儀萃取，萃取時間為10 min，爬坡時間為5 min，溫度為45 ℃，萃取功率為400 W，微波萃取3次，將萃取液合并，50 ℃真空旋轉蒸發至無乙醇味，加水至10 mL，將含有皂苷的待測溶液全部轉入活化后的固相萃取柱(活化過程為先用2.0 mL甲醇活化，再用5.0 mL純凈水平衡，保持濕潤)，保證2滴/s的流速，抽干小柱，用體積分數為10%的甲醇溶液5.0 mL進行淋洗，最后用純甲醇5.0 mL作為洗脫劑進行洗脫，抽干小柱，收集全部流出液，50 ℃水浴濃縮，氮吹儀氮吹至液面高度恒定，用甲醇定容1.0 mL，上清液經有機相濾膜0.22 μm過濾至進樣瓶中，進行高效液相色譜分析。

1.3.2 色譜條件

根據文獻[16]及試驗結果，確定如下液相色譜儀的色譜條件。色譜柱：Zobax SB-CN色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；波長：205 nm；柱溫：30 ℃；流動相：A為純凈水，B為乙腈；流速：1.0 mL/min；梯度洗脫程序：起初1～5 min為70% A，5～30 min為50% A，35 min為70% A；進樣體積：10 μL。

1.3.3 標準溶液配制

準確稱取適量海參皂苷CA(精確至2.0 mg)標準品，用色譜純乙腈溶解，配制質量濃度為2 mg/mL的標準儲備液，4 ℃保存，臨用時稀釋成所需用量。

1.3.4 單因素試驗設計

在相同條件下，選用微波萃取儀對同一樣品設置不同功率進行提取，微波功率的設置為400、600、800 W。通過試驗發現，相同條件下，600 W和800 W的功率較高，樣品經過萃取之后，海參皂苷基本被破壞，未檢出皂苷含量。這是由于隨著微波功率的增大，電磁波發射出的頻率越大，物質內部產生的熱能越大，提取率逐漸增大；而功率過高，有效成分破壞，提取率減小；因此，選擇微波功率為400 W。

參照文獻[17-19]以及預試驗，最終確定考察乙醇體積分數，溶劑體積、時間、溫度4個因素，按上述條件進行樣品制備：(1)固定時間為10 min、微波功率為400 W、溶劑體積為25 mL、溫度為45 ℃，設置乙醇體積分數50%、60%、70%、80%、90% 5個水平；(2)固定提取時間為10 min、微波功率為400 W、溶劑體積為25 mL、乙醇體積分數為70%，設置提取溫度為35、45、55、65、75、85 ℃ 6個水平；(3)固定乙醇體積分數為70%、微波功率為400 W、溶劑體積為25 mL、溫度為45 ℃，設置時間為5、10、15、 20、25 min 5個水平；(4)固定乙醇體積分數為70%、微波功率為400 W、時間為10 min、溫度為45 ℃，設置溶劑體積為10、15、20、25、30 mL 5個水平。

1.3.5 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，用Design-Expert 8.0.6進行響應面中心組合試驗設計，以時間(A)、溫度(B)、乙醇體積分數(C)3個因素為自變量，海參皂苷CA提取率為因變量，海參皂苷CA含量為響應值，設計三因素三水平的響應面試驗，以優化海參皂苷CA的提取方法。因素水平見表1。

表1 Box-Behnken 試驗設計因素與水平

1.3.6 海參皂苷得率的計算方法

樣品中總皂苷含有量以海參皂苷CA計。海參皂苷CA為本實驗室自制，利用液相色譜質譜聯用儀、紅外光譜以及核磁共振儀確定其化學結構，經高效液相法檢測，確定純度大于95%。海參皂苷CA自仿刺參體壁提取純化獲得，含量較高，具有一定的代表性，因此，選擇海參皂苷CA提取率為評價指標，計算公式如下：

式中，wCA為海參皂苷CA提取率(‰)，m1為提取海參皂苷CA質量(mg)，m為仿刺參樣品質量(mg)。

1.4 驗證試驗

稱取仿刺參樣品粉末約0.5 g，按響應面法優化的提取方法進行海參皂苷CA的提取測定，平行3次，以驗證提取方法的可行性及重現性。稱取不同規格的雌、雄仿刺參樣品進行海參皂苷的測定，以驗證方法的準確性，并進一步討論海參皂苷提取率在不同規格仿刺參中的變化。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜檢測方法的建立

精密吸取標準儲備液(1.3.3)若干體積，用色譜純甲醇配制成質量濃度為0.005、0.015、0.050、0.150、0.500、1.000 mg/mL的系列標準溶液，以質量濃度(x，mg/mL)為橫坐標、峰面積(y)為縱坐標繪制標準曲線，得到目標化合物的線性回歸方程y=1264x+2.917和相關系數r=0.9990。結果表明，海參皂苷CA在0.005～1.000 mg/mL質量濃度內呈良好的線性關系，以3倍和10倍信噪比確定該化合物的儀器檢出限和定量限，分別為0.0015 mg/mL和0.005 mg/mL。向樣品中分別添加10、20、50 μg/g的海參皂苷CA，每個水平測定5份平行樣品，考察方法的回收率和精密度，平均回收率分別為63.7%、89.3%和94.4%，精密度分別達到3.5%、1.3%和2.2%。

2.2 單因素試驗結果與分析

按照1.3.1中樣品的制備方法，通過加標回收率考察萃取溶劑體積分數、溫度、時間和溶劑體積等因素對海參皂苷CA提取率的影響，結果見圖1。采用體積分數70%乙醇提取海參皂苷CA，海參皂苷CA提取率較高。隨著乙醇體積分數的升高，海參皂苷CA的提取率逐漸降低，由于海參皂苷CA的極性較大，根據相似相溶的原理，海參皂苷CA的溶解率降低，因此選擇體積分數70%乙醇作為提取溶劑為最佳。由于微波萃取罐的最大體積為30 mL，由10 mL逐漸增加溶劑體積，直至30 mL。當溶劑體積為25 mL時，海參皂苷CA的提取率較高。當時間為10 min的時候，海參皂苷CA的提取率較高，繼續延長提取時間，海參皂苷CA提取率反而降低，但在25 min時，提取率升至10 min時的水平，這可能是提取時間長，部分皂苷發生了降解，生成了海參皂苷CA的緣故，但不是仿刺參體內的已有海參皂苷，因此選用10 min較為合適。微波設置溫度在35～85 ℃內，45 ℃時，海參皂苷CA提取率較高，隨著溫度的升高，提取率逐漸下降，可能是溫度高，海參皂苷發生了降解的緣故，選擇45 ℃為最佳提取溫度。

圖1 單因素試驗設計結果Fig.1 The results of single factor experiment

2.3 響應面法試驗結果與分析

根據單因素試驗結果，選取時間(A)、溫度(B)、乙醇體積分數(C)3個因素進行Box-Benhken響應面優化。其中1～12組試驗為析因設計，13～17組試驗為中心設計；零點試驗共設計5組，用以估算試驗誤差；響應面設計以A、B、C為自變量，以海參皂苷CA提取率(y)為因變量，設計方案見表2。

表2 微波提取海參皂苷CA的響應面分析方案與結果

通過對表2中的數據進行回歸分析，得出回歸方程為：y=15.08+0.65A-0.20B-1.65C-1.10AB+0.30AC-3.00BC-4.19A2-2.94B2-3.34C2，并作出響應面圖和等值線圖，對該模型進行響應面分析，得出二次響應回歸模型的方差分析，分析結果見表3。

響應曲面三維圖能夠直觀地反映各因素對響應值的影響程度和因素間交互作用的強弱。等高線的形狀反映出交互作用影響效應的強弱與大小[24]。采用Design-Expert 8.0.6軟件對結果進行響應面分析，結果見圖2。當乙醇體積分數固定時，海參皂苷CA提取率隨著時間的延長和溫度的升高而增加(圖2)。提取時間由5 min增至15 min，海參皂苷CA的提取率增加。隨著時間的延長，海參皂苷CA提取率先升后降。微波使細胞壁破裂，增加了海參皂苷CA的溶解度，而溫度過高，海參皂苷CA發生降解，導致提取率降低。當溫度固定時(圖3)，隨著乙醇體積分數的增加，海參皂苷CA提取率明顯增大，但時間較短或較長均導致海參皂苷CA的提取率降低。當時間固定時，隨著乙醇體積分數和溫度的升高，海參皂苷CA提取率提高至最大值，但隨著乙醇體積分數的增大和溫度的升高，海參皂苷CA提取率有所降低(圖4)。因此，模型顯示，在適當條件下，海參皂苷CA的提取率最高。

圖4 微波提取溫度和乙醇體積分數對海參皂苷CA提取率交互作用的響應面立體圖和等高線圖Fig.4 Response surface stereogram and contour map of the interaction between microwave temperature and different concentration of ethanol on sea cucumber saponin CA yield

2.4 模型驗證試驗

根據所得到的模型，經Design-Expert 8.0.6軟件處理的最優工藝條件：微波功率400 W，溶劑為體積分數70%乙醇，溫度為45 ℃，次數為3次，時間為10 min。在此條件下，海參皂苷CA理論上的含量達150.8 μg/g，實際進行3組驗證試驗，結果分別為153.6、149.5、152.3 μg/g，取其平均值為151.8 μg/g，與理論值較為接近，表明數學模型對優化海參皂苷CA的提取工藝可行。

通過本試驗建立的優化方法對不同規格的雌、雄仿刺參進行海參皂苷的測定，進一步驗證試驗的準確性，其結果見表5。雌、雄仿刺參體壁海參皂苷CA含量相似，大規格海參皂苷CA含量變化不大。

表5 仿刺參不同規格海參皂苷CA的含量

3 討 論

3.1 方法學討論

方法學考察的結果表明，當海參皂苷CA質量濃度為0.005～1.000 mg/mL，標準對照品線性關系良好，儀器和樣品溶液的精密度和重復性較高，且加樣回收率較佳，所優選的高效液相色譜測定皂苷成分的色譜條件和提取方法符合試驗要求。

3.2 提取方法的比較

為了考察不同提取方法對提取效果的影響，筆者分別采用微波輔助提取法、索氏提取法和超聲波提取法進行比較，結果顯示，索氏提取法和微波輔助提取法的提取率相當，但是索氏提取法消耗時間長，每批次檢測樣品量少。相同條件下，超聲波提取法的提取率較低。微波輔助萃取法采用了微波的輻射功能，增加了溶劑的穿透力，加深了需提取成分在溶液中的釋放擴散，提高了物質的提取速度和工作效率，具有高效性和強選擇性，且適合大批量樣品提取分析。因此，本試驗選擇微波輔助提取法進行提取。

3.3 響應面優化討論

采用單因素法對皂苷微波輔助提取方法中、乙醇體積分數和體積、溫度和時間進行優化，并在此基礎上采用Box-Benhken試驗設計和響應面分析法進一步優化，以提高海參皂苷CA的提取率。響應面法是集試驗設計、數學統計和計算機科學為一身的優化方法，不僅可以搜尋出各因素的最優水平區域，而且可以考察各因素對響應值及各因素之間的交互作用，其為全局性優化，試驗點數少，試驗信息量大，已廣泛應用于化工、醫藥、生物和農業等研究領域的工藝優化[25-29]。采用Box-Benhken試驗設計方法，以較少的試驗次數獲得提取條件與海參皂苷CA成分之間的相關信息，多元二次回歸分析模型及響應曲面能較好地描述提取條件與海參皂苷CA提取率之間的相關性以及提取條件之間的交互作用。通過響應面分析，優化了海參皂苷的提取工藝，試驗值與模型理論預測值僅相差0.1%。因此采用響應面分析優化得到的提取條件參數準確可靠，可用于實際操作。王琴等[30]用該方法對金柚幼果總黃酮進行提取優化，蘭艷素等[14]用該方法對廣豆根中總黃酮進行了優化，均獲得了較高的提取率，說明該方法切實可行。

4 結 論

采用響應面法分析優化微波輔助萃取法，以海參皂苷CA的含量為評價指標，在單因素試驗基礎上，確定時間、溫度和溶劑體積分數3個自變量，建立了微波輔助提取仿刺參中海參皂苷CA的提取率與影響因素之間的模型關系，并最終確立微波輔助提取海參皂苷CA的最佳工藝條件：在微波功率為400 W的條件下，采用70%乙醇25 mL對樣品進行提取，微波加熱時間為10 min，溫度為45 ℃，在此條件下的海參皂苷的提取含量可達到151.8 μg/g。試驗結果可為該技術的應用提供參考和依據，為合理開發利用仿刺參提供科學依據。