飼料投喂、饑餓與活餌再投喂對鱖幼魚糖代謝的影響

馬晨夕，趙金良，曾萌冬，宋銀都，周云紅

( 上海海洋大學，農業農村部淡水水產種質資源重點實驗室，水產動物遺傳育種中心上海市協同創新中心，水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306 )

糖代謝是動物體內的重要生理代謝過程，糖可為機體生長代謝提供所需能源和碳源，滿足機體生命活動的基本需求。糖代謝主要包括糖異生、糖酵解、戊糖磷酸等代謝途徑，魚類糖代謝基本過程與哺乳動物相似。在機體內糖原是葡萄糖的儲存形式，在血液中的運輸形式是葡萄糖，血糖水平可反映機體內糖代謝狀況[1]。血糖水平主要受胰島素和胰高血糖素的調節[2]。對于養殖魚類，飼料中淀粉是體外糖的主要來源，攝入后經淀粉酶消化成單糖，吸收后經血液運輸到各組織中進行合成代謝和分解代謝。研究表明，魚類對糖的利用能力較低，表現在高血糖的不耐受性和低血糖的耐受性[3]，肉食性魚類對碳水化合物利用能力更低，與草食性和雜食性魚類相比，當攝入葡萄糖后，肉食性魚類的糖酵解效能弱而糖異生效能強是糖利用率低的主要原因[4]。盡管如此，魚體內仍有完善的葡萄糖感知、吸收與代謝調控機制[5]。

鱖魚(Sinipercachuatsi)為肉食性養殖魚類，養殖時主要投喂活魚餌。魚苗階段，當餌料魚供應不足時，鱖魚苗表現為耐饑餓能力差，常會發生自相殘殺，影響魚苗產量[10]，饑餓狀態下，魚類糖代謝會發生變化。另一方面，為擺脫鱖魚養殖對活魚餌的嚴重依賴，20世紀80年代后期起，國內學者開展了大量的飼料馴化和配合飼料中營養需求研究[11-12]。目前認為，鱖魚對蛋白質的需求量很高，能耐受較高的脂肪水平，而對碳水化合物的利用較差[13-14]，但碳水化合物對魚類生長是必不可少的。筆者對鱖幼魚進行了人工飼料投喂、饑餓與活餌再投喂處理，分析對其肝體指數、肝肌糖原含量和血糖濃度、激素含量及代謝酶活性的影響，探究不同營養水平下鱖幼魚糖代謝的變化，以期為鱖幼魚營養生理學提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鱖幼魚購自湖州市某家庭農場，于上海海洋大學新場養殖基地室內水泥池中暫養。取鱖幼魚600尾，平均體長(44±1.02) mm，平均體質量(1.94±0.15) g，進行飼料馴化，采用“活餌→活餌加死餌→死餌加冰鮮餌→冰鮮加軟顆粒飼料→軟顆粒飼料”方式逐步過渡馴化，馴化從2019年6月1日開始，馴化時間為17 d，直至鱖幼魚完全攝食飼料；另取鱖幼魚300尾，平均體長(43±1.36) mm，平均體質量(1.89±0.12) g，采用活魚餌投喂。飼料投喂、饑餓與活餌再投喂與飼料馴化的試驗環境一致，水深2.0 m，水溫(23±0.5) ℃，溶解氧≥8.0 mg/L，pH 7.5～8.0。鱖魚粉料購自浙江某生物科技有限公司，投喂前30 min，粉料與水按7∶3(質量比)均勻混合，擠壓成粒徑0.3 cm×0.7 cm的飼料。餌料魚為鯽魚(Carassiusauratus)苗，全長2 cm，購自上海市松江水產良種場。

1.2 試驗方法

1.2.1 飼料養殖試驗

自飼料馴化成功的鱖幼魚中隨機挑選45尾測量體質量，作為飼料組的初始值，平均體質量(3.27±0.63) g；自活餌投喂中挑選規格相近45尾測量體質量，作為活餌組的初始值，平均體質量(3.54±0.52) g。飼料組和活餌組各設3個平行，每個平行15尾，置于1 m×1 m×1.5 m網箱中進行養殖試驗。飼料組每日表觀飽食投喂2次(8:00和16:00)，活餌組足量投喂活鯽魚苗，試驗周期為3周。

1.2.2 饑餓與再投喂試驗

從投喂活餌的鱖幼魚中挑選健康狀況良好、規格整齊的135尾，平均初始體長(81.06±2.58) mm，平均初始體質量(8.14±1.38) g，隨機分成3組：正常投喂組、饑餓組、饑餓后再投喂組，每組各設3個平行，每個平行15尾。正常投喂組連續投喂活鯽魚苗3周，饑餓組3周內均不投餌，饑餓后再投喂組為饑餓2周、再投喂活鯽魚苗1周，其他試驗條件同上，試驗周期為3周。

1.2.3 樣品采集

取樣前，各組試驗魚均禁食1 d，放入間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽麻醉液(400 mg/L)中完全麻醉后，擦干水分，稱量體質量、測體長。每組隨機取10尾，每尾斷尾取血約0.1 mL，置于肝素鈉處理過的離心管中，12 000 r/min(離心半徑12 cm)離心5 min，取血清，置于-80 ℃保存，待測血糖濃度。隨后，于冰塊上迅速取肝臟和背部肌肉稱量質量，置于-80 ℃下保存待測。

1.2.4 生化測定

酶活性測定：在冰水浴上取各組試驗魚肝臟，用預冷的磷酸緩沖鹽溶液(0.01 mol/L，pH 7.4)沖洗組織，去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果)，稱量0.06 g組織，剪碎，按1∶9(m/V)的比例加入磷酸緩沖鹽溶液540 μL，用玻璃勻漿器在冰水浴中勻漿，勻漿混合液4 ℃、5000 r/min(離心半徑12 cm)離心8 min，吸取離心上清液于(25±1) ℃條件下使用酶標儀(Synergy H1，美國伯騰儀器有限公司)在450 nm下分別測定葡萄糖激酶、己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶、果糖-1,6-二磷酸酶、葡萄糖脫氫酶、糖原合成酶、糖原磷酸化酶以及胰島素、胰高血糖素吸光度值。所用試劑購自上海酶聯生物科技有限公司，具體操作步驟和試驗結果計算按說明書進行。

由于吸收塔的空塔流速一般在3～4m/s，而濕電內部的電場風速為2～3m/s，所以濕電殼體的直徑往往大于下部吸收塔的直徑，這對濕電和吸收塔的結構設計提出了更為苛刻的要求。如不能解決結構設計問題，那么一體式濕電無疑就是“空中樓閣”。

血糖測定采用葡萄糖氧化酶法[15]，肝、肌糖原的測定采用蒽酮顯色法[16]，所用試劑購自南京建成生物科技有限公司，具體方法按說明書操作步驟進行。

1.2.5 相關統計分析

在Excel 2019中對原始數據進行整理，運用SPSS 19.0軟件對每組數據統計分析，用單因子方差分析和LSD多重比較法進行差異顯著性檢驗，每組數據均以平均值±標準誤表示，顯著性水平為0.05。

RLGR/%=(Lt-L0)/L0×100%

wWGR/%=(mt-m0)/m0×100%

wLWGR/%=(mht-mh0)/mh0×100%

wLI/%=mh/m×100%

式中，RLGR為體長增長率；wWGR為體質量增加率；wLWGR為肝質量增加率；wLI為肝指數；Lt、L0分別代表試驗魚的平均終末體長、平均初始體長(mm)；mt、m0分別代表試驗魚的平均終末體質量、平均初始體質量(g)；mht、mh0分別代表試驗魚的平均終末肝質量、平均初始肝質量(g)；t表示試驗天數(d)；mh、m分別代表試驗魚的肝臟質量、體質量(g)。

2 結 果

在飼料養殖試驗中，經過3周投喂配合飼料和活餌對鱖幼魚生長影響顯著。活餌組與飼料組的體長、體質量、肝質量終末值與初始值相比均顯著增加(P<0.05)(表1)。且活餌組體長、體質量、肝質量終末值與飼料組終末值相比均顯著增加(P<0.05)。活餌組體長增長率、體質量增加率、肝質量增加率均顯著高于飼料組。總體來看，飼料組生長速度顯著慢于活餌組，而飼料組的肝指數顯著高于活餌組(P<0.05)。

表1 飼料養殖試驗鱖幼魚各組生長指標的變化

在饑餓與再投喂試驗中，與正常投喂組相比，饑餓組體長、體質量、肝質量與肝指數均顯著下降(P<0.05)(表2)，其中體質量顯著下降57%，肝質量顯著下降70.83%，肝指數顯著下降；再投喂組體長、體質量、肝質量和肝指數均有恢復。

在飼料養殖試驗中，飼料組、活餌組肝糖原含量和血糖濃度與各組初始值差異不顯著，飼料組與活餌組肌糖原含量均顯著高于各組初始值(P<0.05)，飼料組肝糖原、肌糖原含量和血糖濃度與活餌組間差異不顯著(表3)。飼料組葡萄糖激酶、己糖激酶活性與活餌組間未見顯著差異，與其初始值差異也不顯著，而飼料組磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶活性顯著高于活餌組(P<0.05)。飼料組糖異生代謝酶磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶、果糖-1,6-二磷酸活性與活餌組間差異不顯著；戊糖磷酸途徑代謝酶葡萄糖脫氫酶活性與活餌組差異也不顯著。飼料組與活餌組糖原合成酶、糖原磷酸化酶活性差異不顯著，胰島素含量、胰高血糖素質量濃度差異不顯著，且與各初始值間無顯著變化。

表2 饑餓與再投喂試驗鱖幼魚各組生長指標的變化

表3 飼料養殖試驗各組糖代謝相關指標的變化比較

在饑餓與再投喂試驗中，與正常投喂組相比，饑餓組肝糖原、肌糖原含量和血糖濃度均顯著下降(P<0.05)(表4)，其中肝糖原含量顯著下降74.32%，肌糖原含量顯著下降44.19%，血糖濃度也顯著下降37.70%；再投喂組肝糖原含量顯著恢復(P<0.05)，肌糖原含量有一定水平恢復，血糖濃度基本恢復到最初水平。與正常投喂組相比，饑餓組糖酵解酶活性均有不同程度下降，其中，磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶活性顯著性下降(P<0.05)；再投喂組糖酵解各代謝酶活性無顯著變化。與正常投喂組相比，饑餓組糖異生途徑中磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶、果糖-1,6-二磷酸活性基本無變化，戊糖磷酸途徑中葡萄糖脫氫酶活性顯著下降(P<0.05)；再投喂組糖異生代謝酶活性差異不顯著，而戊糖磷酸途徑葡萄糖脫氫酶差異顯著(P<0.05)。與正常投喂組相比，饑餓組糖原合成酶活性顯著下降(P<0.05)，糖原磷酸化酶活性顯著升高(P<0.05)，胰島素含量顯著下降，胰高血糖素質量濃度顯著上升；饑餓后再投喂組糖原合成酶、糖原磷酸化酶活性恢復，胰島素含量、胰高血糖素質量濃度恢復到正常水平。

表4 饑餓與再投喂試驗各組糖代謝相關指標的變化比較

3 討 論

3.1 飼料投喂對鱖幼魚糖代謝的影響

目前認為，鱖幼魚配合飼料中蛋白質最適含量為44.7%～45.8%[13]，脂質最適含量為7%～12%[11]，本試驗中所用飼料基本符合，能滿足鱖幼魚的生長需求。與活餌投喂相比，飼料投喂對鱖幼魚生長仍有一定影響，具體表現為飼料組體長增長率、體質量增加率均顯著低于活餌組，這一結果與雜交鱘(Acipenserschrenckii♀ ×A.baeri♂)仔魚[17]和點帶石斑魚(Epinepheluscoioides)幼魚[18]飼料投喂后生長結果基本一致。分析認為，人工飼料中可能因缺乏生物活餌料中的某些微量活性物質，使蛋白酶分泌減少[19]，因此，活餌投喂比飼料投喂更利于促進魚體對食物的消化利用。由于鱖魚飼料中各種營養物質組成含量與活餌間存在差異，因此，也在一定程度上影響鱖幼魚攝食與生長。

對南方鲇(Silurusmeridionalis)[20]和虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[21]研究發現，飼料中過多的糖可轉化成糖原儲存在肝臟中，導致肝指數增大。對烏鱧(Channaargus)[22]研究發現，肝指數的增大與肝臟脂肪含量有關。本試驗中，飼料組與活餌組在肝糖原含量上并無顯著差異，飼料組肝指數高于活餌組，可能由于飼料制作過程中某些必需營養素(如維生素)被破壞[23-24]，部分營養物質的不平衡造成肝臟脂肪代謝緩慢，轉運失調，導致脂肪肝形成，肝組織有一定程度增大[25]。飼料中脂肪含量高可引起魚類脂肪肝[26]，本試驗中，飼料的粗脂肪含量顯著高于活魚餌，可能為飼料組肝指數高的原因。飼料中合理的營養配比不僅有利于魚體生長，對魚體健康也至關重要。

本試驗中，活餌與飼料喂食3周，飼料組血糖濃度、糖原含量、胰島素含量和胰高血糖素質量濃度與活餌組間均無顯著差異。除飼料組糖酵解代謝酶磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶活性顯著高于活餌組外，其他糖代謝途徑中代謝酶活性并無顯著差異。一般來說，當飼料淀粉含量增加時，在一定程度上會促進糖酵解過程，表現為糖酵解酶活性增強，以減少血液中的葡萄糖濃度，維持內穩態的平衡，這在歐洲鱸(Dicentrarchuslabrax)[27]和河鱸(Percafluviatilis)[28]的不同碳水化合物水平對肝糖代謝影響研究中得到證實。另有研究報道，不同的糖脂比影響糖酵解酶活性，且糖的來源[29]及魚的種類不同時，糖酵解發生變化的關鍵酶亦會出現不同變化[30]。本試驗中，飼料與活餌的糖脂比分別為71.25%、23.81%。在飼料喂食條件下，糖酵解磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶活性表現增強，推測可能為飼料與活餌中糖脂比不同引起的，且飼料的糖脂比高于活餌。

3.2 饑餓與再投喂對鱖幼魚糖代謝的影響

當面臨饑餓脅迫時，魚類和其他動物一樣，也會動用儲能物質(如糖原、脂類和蛋白質)來提供能量，且魚類更傾向優先動用脂類和蛋白質供能[31-32]。本試驗中，饑餓組與正常投喂組相比，體質量、肝質量、肝指數顯著下降，肝糖原含量、肌糖原含量、血糖水平也顯著下降。肝臟是主要的儲能場所，肝臟中貯存大量肝糖原，肝糖原可分解維持血糖水平，使魚體在饑餓狀態下維持一定的血糖濃度[33]。肝指數下降與肝糖原含量下降，說明在饑餓過程中鱖幼魚動用了肝糖原來提供能量，這在南方鲇幼魚[34]的糖代謝研究中也有相似結果。肌肉是體質量的主要組成部分，糖在肌肉組織中以肌糖原形式儲存，在特定生理饑餓狀態下，即肝糖原消耗到一定程度時，機體也會動用肌糖原協助提供能量維持生存需要[35]。本試驗中，從體質量的下降程度來看，饑餓狀態下除糖原分解外，鱖幼魚體內蛋白質和脂肪也應有消耗，兩者通過糖異生作用生成葡萄糖，與肝糖原分解共同維持血糖濃度。這在食蚊魚(Gambusiaaffinis)和唐魚(Tanichthysalbonubes)幼魚饑餓狀態下主要能量物質消耗研究[36]中有過報道。

本試驗中，饑餓對鱖幼魚胰島素含量和胰高血糖素質量濃度影響顯著。饑餓狀態下，鱖幼魚胰島素含量顯著下降，胰高血糖素質量濃度顯著上升，說明鱖幼魚體內胰島素和胰高血糖素參與體內血糖濃度調控。饑餓狀態下，胰島素含量降低和糖原合成酶活性下降的結果證明胰島素與它促進合成代謝的特性相適應[37-38]。胰高血糖素質量濃度升高可促進體內肝糖原的分解和非糖物質(蛋白質、脂質等)的轉化來快速升高血糖。

本試驗中，與正常投喂組相比，鱖幼魚饑餓組戊糖磷酸途徑中葡萄糖脫氫酶活性下降幅度最大，糖酵解途徑磷酸果糖激酶次之，相比之下，糖異生途徑的磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶、果糖-1,6-二磷酸活性下降較小。正常生理狀態下，戊糖磷酸途徑可為魚體內脂肪合成提供所需的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，當處于饑餓狀態時，推測鱖幼魚體內戊糖磷酸途徑可能減弱或受到抑制，即通過抑制脂肪合成作用，減少其他代謝對葡萄糖的消耗來維持血糖濃度，滿足生命活動基本需求。饑餓狀態下，隨著血糖濃度的持續降低，鱖幼魚磷酸果糖激酶活性下降，表明糖酵解途徑隨血糖水平相應減弱。饑餓狀態下盡可能減少葡萄糖的消耗維持血糖濃度，這是魚體面對饑餓脅迫時的生理對策[39]。這也與草魚在饑餓狀態下糖酵解酶活性變化[37]相似。從肝糖原的耗竭程度來看，通過糖異生作用由非糖物質蛋白質和脂肪生成葡萄糖是提供葡萄糖能量的重要途徑，磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶、果糖-1,6-二磷酸活性降低最少，表明鱖幼魚在肝糖原顯著耗竭時，糖異生作用對維持體內葡萄糖水平更為重要。

有研究表明，短期饑餓后再投喂可使魚類機體生理功能恢復到正常水平，或出現補償生長作用[40-41]。本試驗中，鱖幼魚饑餓再投喂后肝質量、肝指數、血糖濃度能恢復正常投喂組水平，但在體長、體質量、肝糖原、肌糖原各指標方面仍與正常投喂組有差異(P<0.05)。不同指標具有不同的恢復速度，可能與再投喂時間相對較短、葡萄糖補充量時間不足以及不同代謝過程有關。隨著葡萄糖補充水平的增加，各項指標將得到相應的最大恢復，甚至會出現補償生長。

4 結 論

本試驗中，飼料組鱖幼魚生長速度顯著慢于活餌組，兩組體內糖代謝途徑無明顯差異。饑餓與活餌再投喂對鱖幼魚體內的糖代謝影響較為顯著，具體體現在血糖、肝糖原、肌糖原、戊糖磷酸途徑代謝酶葡萄糖脫氫酶、糖酵解代謝酶磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶、糖原合成酶、糖原磷酸化酶、胰島素及胰高血糖素水平變化顯著，再投喂后不同指標恢復速度不同。