絮體粒徑對生物絮團系統中硝化作用的影響

陳曉慶，羅國芝,2,3，譚洪新,2,3，吳慧芳，蒙浩焱，黎 爽

( 1.上海海洋大學，上海水產養殖工程技術研究中心，上海 201306； 2.上海海洋大學，農業農村部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306； 3.上海海洋大學，水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306 )

集約化生產方式使水產養殖的放養密度和高蛋白飼料的投放量明顯增加。氨氮是蛋白質代謝的最終產物之一。據估算，氨氮產生量約為投喂飼料蛋白質的9.2%[1]。氨氮的積累會直接抑制養殖動物的生長，降低其存活率[2]。水體中氮素的去除主要是通過硝化作用和反硝化作用[3-5]。在生物絮團—水產養殖系統中，硝化現象普遍發生[6]。水體中的硝化作用受一系列因素影響，如環境因子、生態因素、生物因子等[7]。硝化過程通常發生在有機物濃度較低的環境中[8]，硝化效率在一定范圍內隨著碳氮比的增加而降低[9]。生物絮團主要由浮游生物、細菌、原生動物和顆粒有機體等組成[10]；絮體形狀不規則，可壓縮性強，具有高度滲透性(超過99%的穿透力)，且隨液體滲透而不固定[3,11-17]。絮團的絮體粒徑變化區間大，從幾微米到幾百微米甚至數千微米，高度多孔，比表面積為20～100 cm2/mL。通常認為，生物絮團—水產養殖系統中穩定的生物絮團大小為50～1000 μm[12]。這些物理和生物特性，使生物絮凝技術反應器具有吸附、絮凝固體顆粒物并對其進一步利用的潛能。在生物絮團—水產養殖系統中，生物絮團的絮體粒徑可能與培養對象對絮團的攝取能力、消化率以及營養價值有關[3]。

隨著對生物絮團的深入研究，已有生物絮團影響因素碳源、碳氮比、水體混合強度、水力停留時間、pH、溶解氧、溫度、堿度、鹽度和反應器結構及活性污泥粒徑等方面的報道，但對生物絮團絮體粒徑的相關研究還較少。筆者從絮體本身出發，以50 μm粒徑濾膜截留絮團附著細菌，未被50 μm粒徑濾膜截留的非附著細菌，再采用0.22 μm粒徑濾膜截留[4,18]，運用高通量測序技術，揭示絮體內部微生物多樣性，為進一步研究生物絮團各反應階段的微生物組成比例變化提供數據基礎，對探究生物絮團硝化作用具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 試驗裝置及材料

試驗于上海海洋大學循環水養殖工程與技術實驗室進行。生物絮團反應器為9個7 L有機玻璃圓錐體反應器，全高30 cm，錐高4 cm，內徑18.5 cm，外徑20 cm，有效容積5 L。選用的氣泵功率為138 W、曝氣量為100 L/min，通過分接器和軟管在每個反應器中設置2個曝氣頭(直徑3 cm、高3.5 cm的石英砂聚合氣石)，為水體提供氧氣和攪拌。

1.2 試驗設計

試驗開始前50 d，在3個150 L養殖水桶培養穩定良好的絮體(圖1)[19]。各水桶中投入150 g磨碎后的寶石鱸魚飼料，初始總懸浮固體物質量濃度1000 mg/L。通過添加碳酸氫鈉調控堿度保持在150 mg/L(以碳酸鈣計，下同)。試驗期間除了補充因蒸發而損失的水分外，不換水。一臺羅茨鼓風機供氧(型號HG-750，浙江森森集團股份有限公司)，采用間歇式曝氣方式(曝氣8 h，停止16 h)將系統進行悶曝72 h后開始添加碳源[20]。試驗開始時一次性投入足夠的葡萄糖，使系統中碳氮比為15。

圖1 試驗設計圖[21]Fig.1 Experiment design

待水體中氨氮、亞硝態氮降至最低值，視為系統穩定構建，取3個空桶標記A、B、C。A桶為未分級絮體組；將前期培養絮體過300目篩網，經篩網濾過的絮體分入B桶；截留在篩網上的絮體分入C桶，C桶水體取自原絮體靜置5 h后的上清液。3個桶經充分曝氣后，分別取15 L注入9個有效容積為5 L的反應器中培養不同粒徑生物絮團。試驗分3組，每組3個平行：A組為未分級絮體組，B組為<50 μm絮體組，C組為>50 μm絮體組。反應器中分別以氯化銨和葡萄糖作為氮源和碳源，以碳氮比為15分別加入0.19 g氯化銨和1.88 g葡萄糖進行10 mg/L氨氮轉化試驗。取試驗初始水樣(A、B、C組各3個)和氨氮轉化結束水樣(A、B、C組各3個)各50 mL，經0.22 μm孔徑濾膜抽濾后將濾膜于-80 ℃冰箱保存,試驗結束后送至上海美吉生物科技有限公司進行高通量測序。

1.3 試驗指標與測定方法

1.3.1 水質指標的測定

每隔1 d檢測水體的溫度、pH、溶解氧，并測定水體總氮、總氨氮、亞硝態氮、硝態氮和溶解性有機碳。總氮采用過硫酸鉀氧化—紫外分光光度法(型號UV2000，上海尤尼柯，中國，下同)測定。水樣經0.45 μm孔徑濾膜抽濾后測定三態氮及溶解性有機碳。其中亞硝態氮采用N-(1-萘基)-乙二胺比色法測定，硝態氮含量采用紫外分光光度法測定，總氨氮含量測定采用鈉氏試劑法，溶解性有機碳含量使用多功能碳氮元素分析儀(Multi N/C 2100，德國)測定。

1.3.2 絮團成分指標的測定

總固體懸浮顆粒物采用稱量質量法測定；絮團經65 ℃烘干后使用碳氮元素分析儀測定絮團中的碳元素和氮元素含量，將氮元素由粗蛋白平均系數6.25換算成粗蛋白含量。

1.3.3 生物絮團微生物樣品的測定

按照Omega Water DNA Kit (Omega,USA)的說明，提取水體中的DNA。將提取得到的細菌總DNA通過微量紫外分光光度計(Nano Drop?ND-1000,美國)測定DNA質量濃度和純度。采用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGA-GGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGG-GTWTCTAAT-3′)對絮團細菌16S rRNA基因的V3～V4區擴增,修飾后的通用引物含有不同的Tag標簽用以區分不同樣品。PCR擴增體系為20 μL：5×Fast Pfu Buffer 4 μL、2.5 mmol/L d NTPs 2 μL、Forward Primer(5 μmol/L) 0.8 μL、Reverse Primer(5 μmol/L) 0.8 μL、Fast Pfu Polymerase 0.4 μL、DNA模板10 ng，補雙蒸水至20 μL。PCR擴增的反應條件：94 ℃，5 min；30×(94 ℃，30 s，54 ℃，30 s，72 ℃，45 s)；72 ℃，10 min。每個樣品3個平行，利用上海美吉生物醫藥科技有限公司的MiSeq PE300測序儀(Illumina Inc，美國)完成序列測定。

Miseq文庫構建及Miseq測序：(1)通過PCR將Illumina官方接頭序列添加至目標區域外端；(2)使用凝膠回收試劑盒TruSeqTM DNA Sample Prep Kit切膠回收PCR產物；(3) Tris-HCl緩沖液洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測；(4)氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段。檢測合格文庫后，采用Miseq進行測序。

數據分析處理：采用Mothur軟件將得到的16S rDNA基因序列在RDP數據庫中進行嵌合體檢驗，充分去除嵌合體序列。為得到每個運算分類單元(OUT)對應的物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的運算分類單元代表序列進行分類學分析，用Mothur軟件構建稀釋性曲線[15]。

1.4 去除效率計算公式

總氨氮去除效率(R,%)計算公式：

R=(ρ1-ρ2)/ρ1×100%

式中，ρ1為初始總氨氮質量濃度(mg/L)；ρ2為終末總氨氮質量濃度(mg/L)。

1.5 數據分析

試驗數據采用Excel軟件進行結果統計，由Origin、Adobe Illustrator軟件進行相關圖表的繪制。試驗數值用平均值±標準差形式表示，采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 絮體培養階段水質及三態氮的動態變化

試驗前50 d穩定絮體培養階段的三態氮及總氮變化趨勢見圖2。生物絮團在第43天亞硝態氮降至最低并趨于穩定，絮體基本形成。試驗期間，各組溫度18.4～28.4 ℃，溶解氧7.5～9.6 mg/L、pH 7.7～9.0，因前期絮體培養階段加入少許鹽，水體鹽度7.1～7.7，各組環境指標組間差異不顯著(P>0.05)。3個處理組的堿度均維持在155～240 mg/L。

圖2 絮體培養階段三態氮及總氮的動態變化Fig.2 Dynamics of total ammonia-N, nitrite-N, nitrate-N and total nitrogen in the water in the 3 different groups

2.2 氨氮的轉化

溶解性有機碳質量濃度及總氨氮質量濃度計算見圖3。3組反應器中溶解性有機碳含量與總氨氮含量的初始比值分別為16.24、15.01、14.07。試驗期間，pH、溶解氧、溫度等水質指標見表1，各組溫度22.0～23.5 ℃、溶解氧8.2～8.7、pH 8.2～8.6，各組環境指標組間差異不顯著(P>0.05)。3個處理組的堿度均維持在250 mg/L，氨氮快速轉化期間3個處理組堿度波動范圍差異不顯著(P>0.05)。

3組反應器初始氨氮質量濃度分別為(8.43±0.13)、(9.71±0.07)、(10.52±0.44) mg/L，在第2 h，3組氨氮均達到峰值，分別為(16.46±1.34)、(17.93±1.91)、(18.62±1.19) mg/L，下降后均有回升，最后趨于穩定快速下降。3組反應器均在12 h基本將10 mg/L總氨氮同化去除完畢，氨氮去除率分別達97.33%、95.28%和95.09%(圖3a)；總體上看，3組反應器對氨氮的同化去除速度是一樣的，3個處理組的氨氮變化差異不顯著(P>0.05)。反應過程中亞硝態氮有反復出現小幅度“先升后降”的趨勢，3組間差異不顯著(P>0.05)(圖3b)。3組反應器硝態氮含量升降起伏明顯，均有少量增加后降低趨勢，并低于初始值，3組反應器硝態氮變化差異不顯著(P>0.05)(圖3c)。到反應結束，未額外產生亞硝態氮和硝態氮，與已有的研究結果[1]相符。溶解性有機碳質量濃度呈持續下降趨勢(圖3d)，不同絮體粒徑組溶解性有機碳變化差異不顯著(P>0.05)。

圖3 10 mg/L氨氮快速轉化期間3個處理組中總氨氮(a)、亞硝態氮(b)、硝態氮(c)及溶解性有機碳(d)的動態變化Fig.3 Dynamics of total ammonia-N (a), nitrite-N (b), nitrate-N (c) and dissolved organic carbon (d) in the water in the 3 different groups during rapid conversion of 10 mg/L ammonia-N

表1 10 mg/L氨氮快速轉化期間3個處理組中各水質指標的平均值、最小值和最大值

2.3 絮團總固體懸浮物及粗蛋白

每組反應器取3個樣品進行總懸浮固體物測定，以確定初始的總懸浮固體物質量濃度。10 mg/L氨氮快速轉化試驗中，3組初始總懸浮固體物分別為(720.33±52.21)、(693±58.28) mg/L和(753.67±59.55) mg/L。3組的總懸浮固體物質量濃度在12 h內的變化均有所升高，同時段不同粒徑處理組之間總懸浮固體物質量濃度差異不顯著(P>0.05)(圖4)。由表2可見，不同粒徑處理組對絮體粗蛋白含量差異不顯著(P>0.05)。

圖4 氨氮快速轉化期間3個處理組絮團中總固體懸浮物含量Fig.4 Contents of total suspended solids in the 3 different biofloc treatment groups during the rapid ammonia-N transformation period

2.4 微生物序列數目和多樣性

分別取初始0 h時間段與終末12 h時間段絮團進行高通量測序多樣性分析，絮體細菌原核16S序列數目和平均長度見表3。初始絮團更能準確反映不同粒徑的微生物群落豐度、多樣性差異。通過比較sobs、ace和chao指數分析可知，初始微生物豐度由大到小排序為：<50 μm絮體組，>50 μm絮體組，未分級絮體組；由表3可見，初始微生物多樣性由大到小排序為：未分級絮體組，>50 μm絮體組，<50 μm絮體組；3個組處理組Shannon值差異不顯著(P>0.05)。終末時段各組微生物群落多樣性相對初始時段均有所降低。

表3 不同絮體粒徑組絮團微生物群落豐富度和多樣性指數

2.5 微生物群落組成分析

10 mg/L氨氮快速轉化期間，在門水平上，3組絮團樣品中微生物群落結構組成情況相似，但各種微生物所占比例略有差異(圖5a)。樣品中微生物主要隸屬于12個門，初始時段絮團最能客觀反映不同粒徑絮團中生物群落組成差異。試驗初始0 h時，變形菌門(未分級絮體組36.69%，<50 μm絮體組28.19%，>50 μm絮體組31.02%)和放線菌門(未分級絮體組28.30%，<50 μm絮體組23.98%，>50 μm絮體組29.60%)占主要優勢，其他優勢菌門分別為擬桿菌門(未分級絮體組11.66%，<50 μm絮體組10.15%，>50 μm絮體組10.38%)、厚壁菌門(未分級絮體組6.26%，<50 μm絮體組20.57%，>50 μm絮體組8.53%)，綠彎菌門(4.49%～5.81%)、浮霉菌門(2.44%～2.75%)、芽單胞菌門(1.22%～1.73%)和疣微菌門(1.02%～1.99%)等。<50 μm絮體組厚壁菌門豐度顯著高于未分級絮體組和>50 μm絮體組(P<0.05)，其余菌門細菌差異不顯著(P>0.05)。12 h后，3組絮體樣本的變形菌門和放線菌門的細菌數量均有所增加，變形菌門(未分級絮體組51.88%，<50 μm絮體組44.85%，>50 μm絮體組44.91%)成為主要優勢菌，其次是放線菌門(未分級絮體組32.39%，<50 μm絮體組29.62%，>50 μm絮體組34.31%)，其余菌群在數量上均有所減少。各組微生物在門水平上的組成分布與本試驗之前的研究結果[20]一致。

圖5 氨氮快速轉化不同時間點3組粒徑絮體在門(a)、綱(b)、屬(c)水平上群落結構組成分布Fig.5 The composition and distribution of community structure at different time on the phylum(a), class(b) and genus(c) levels in the three different treatment groups throughout the rapid ammonia nitrogen conversion periodA.未分級絮體組； B.<50 μm絮體組; C.>50 μm絮體組.A.flocs without screening; B.<50 μm of flocs; C.>50 μm of flocs.

綱的分類水平上，3組絮體主要菌綱有放線菌綱(未分級絮體組28.30%，<50 μm絮體組23.98%，>50 μm絮體組29.60%)、α-變形菌綱(未分級絮體組14.70%，<50 μm絮體組11.81%，>50 μm絮體組11.85%)、γ-變形菌綱(未分級絮體組9.91%，<50 μm絮體組8.03%，>50 μm絮體組9.87%)、β-變形菌綱(未分級絮體組8.03%，<50 μm絮體組5.63%，>50 μm絮體組6.08%)和芽孢桿菌綱(未分級絮體組5.51%，<50 μm絮體組19.55%，>50 μm絮體組7.78%)，<50 μm絮體組芽孢桿菌綱顯著高于未分級絮體組和>50 μm絮體組(P<0.05)(圖5b)。鞘脂桿菌綱、噬纖維菌綱、δ變形菌綱、黃桿菌綱、暖繩菌綱、芽單胞菌綱、藍細菌、梭菌綱等豐度均低于5%，且不同粒徑絮團差異不顯著(P>0.05)。

屬的分類水平上，將相對比例小于0.5%的歸為其他，占21.37%～24.51%(圖5c)。未分級絮體組和>50 μm絮體組優勢菌屬包括紅球菌屬(Rhodococcus)(未分級絮體組16.45%，>50 μm絮體組17.84%，<50 μm絮體組11.58%)、微桿菌屬(Microbacterium)(未分級絮體組8.91%，>50 μm絮體組8.86%，<50 μm絮體組9.69%)和噬氫菌屬(Hydrogenophaga)(未分級絮體組6.50%，>50 μm絮體組4.41%，<50 μm絮體組4.89%)；此外，<50 μm絮體組中芽孢桿菌屬(Bacillus)(<50 μm絮體組19.49%，未分級絮體組5.40%，>50 μm絮體組7.71%)顯著高于其他兩組(P<0.05)。其余菌屬副球菌屬(Paracoccus)、Caldilineaceaenorank、假單胞菌屬(Pseudomonas)、柔發菌屬(Flexithrix)、水單胞菌屬(Aquimonas)、申氏桿菌屬(Shinella)、Gemmobacter、Algoriphagus、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)、分支桿菌屬(Mycobacterium)、Arenibacter、絲狀菌屬(Candidatus_Alysiosphaera)、突柄桿菌屬(Prosthecobacter)及不知名屬等均低于5%。

3 討 論

3.1 不同絮體粒徑對氮素轉化的影響

Yang等[22]研究發現，當水體中氨氮的質量濃度大于10 mg/L時，水體中硝化細菌的硝化反應將會受到抑制。本試驗中氨氮轉化監測發現，試驗前2 h氨氮質量濃度先升后降，亞硝態氮、硝態氮均有小幅下降再回升，可能是此時段硝化反應提速。而后，在碳源充足的條件下，生物絮團異養細菌的同化作用快于水體中硝化細菌的硝化作用。8 h后，氨氮持續降低，亞硝態氮、硝態氮開始上升，說明此時絮團進行硝化過程。

3.2 不同絮體粒徑絮團的營養成分和微生物群落組成

本試驗中，生物絮團中粗蛋白水平分別為(31.91±1.58)%、(34.40±0.39)%、(34.67±1.59)%，與Emerenciano等[23]在圣保羅對蝦(Farfantepenaeuspaulensis)養殖系統中用蔗糖和麥麩作為碳源，Xu等[24]在凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)養殖系統以蔗糖作為碳源，其所培養生物絮團中粗蛋白水平一致，說明生物絮團是一種水產動物潛在的重要食物來源。在生物絮團系統中添加碳源可以提高微生物群落的多樣性、穩定性和緩沖性[25-27]。本試驗結果顯示，隨著碳源的添加，生物絮團異養微生物的生物代謝率遠高于硝化細菌的生物代謝率，生物絮團微生物群落結構轉變成以變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門為優勢菌的結構。已有研究證實了生物絮團系統微生物群落結構的變化情況[6,27]。隨著溶解性有機碳的降低，微生物群落多樣性降低。本次試驗絮體檢測后均發現，<50 μm絮體組中芽孢桿菌屬為主要優勢菌屬，且顯著高于其他兩組，說明粒徑對厚壁菌門

芽孢桿菌的含量影響顯著。

3.3 不同絮體粒徑對絮團功能的影響

組成生物絮團的細菌群落是復雜多樣的，需要借助功能基因的研究來揭示細菌群體感應的影響機制和作用機理。異養細菌是生物絮團系統中總氨氮去除的主要力量[28]。本試驗結果顯示，在兩次氨氮快速轉化過程中均發現變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、綠彎菌門、浮霉菌門和芽單胞菌門等異養細菌，其中放線菌和擬桿菌是常見的益生菌[29]。變形菌門細菌的功能主要是清除水中有機物[30-31]，變形菌門占據優勢菌群，對有效調節水質起到至關重要的作用。浮霉菌門的細菌具有介導參與厭氧氨氧化，使亞硝態氮和氨氮直接轉化成氮氣的能力[32]。厚壁菌門為革蘭氏陽性、低G+C含量的一類原核微生物[33]。芽孢桿菌綱和梭菌綱構成了厚壁菌門的主體。其中芽孢桿菌綱內的物種由于大多可形成抗逆性極強的芽孢，因而具有極強的環境適應性。迄今為止，已篩選出的異養硝化—好氧反硝化菌主要集中于副球菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬(Acinetobacter)與芽孢桿菌屬等。本試驗中，氨氮快速轉化絮團中均檢測到芽孢桿菌，芽孢桿菌是一類重要的產絮菌[34-35]，具有異養硝化—好氧反硝化能力[36]，能改善養殖用水水質[37]，作為飼料添加劑使用時可促進養殖動物生長，提高機體免疫及抗病能力[38-40]。本試驗在絮團中均檢測到芽孢桿菌屬，分析菌群豐度可知，芽孢桿菌屬在<50 μm絮體組中為主要優勢菌，豐度顯著高于其他兩組。

4 結 論

本試驗結果顯示，3組不同粒徑絮體組對氨氮的同化去除速度相同，對水體中氨氮快速轉化效果差異不顯著。高通量測序技術檢測結果表明，不同粒徑絮體組在門、綱、屬水平上的微生物群落組成基本相似，生物絮團培養過程中主要生物類群隸屬于6個綱即放線菌綱、α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱、芽孢桿菌綱和鞘脂桿菌綱。在屬水平上，紅球菌屬、微桿菌屬、噬氫菌屬和芽孢桿菌屬為優勢菌屬，其余為副球菌屬、假單孢菌屬、水單胞菌屬、分支桿菌屬、絲狀菌屬等多個菌屬和一些未知菌屬。氨氮快速轉化絮團檢測結果顯示，<50 μm絮體組厚壁菌門(芽孢桿菌屬)菌群豐度顯著高于其余兩組，粒徑對厚壁菌門(芽孢桿菌屬)的含量影響差異性顯著；碳源添加可以提高微生物群的多樣性、穩定性，隨著溶解性有機碳的降低，微生物多樣性降低。由試驗結果可知，控制生物絮團—水產養殖中絮體粒徑<50 μm的絮團占主要地位，有利于芽孢桿菌的富集生長，對調控同化作用和硝化作用的競爭關系起至關重要的作用。