鯉皰疹病毒Ⅱ型檢測技術的研究進展

郭寶琴，魏 暢，李 強

( 1.大連海洋大學 水產與生命學院，遼寧 大連 116023； 2.鹽城工學院 海洋與生物工程學院，江蘇 鹽城 224051 )

鯉皰疹病毒Ⅱ型(CyprinidherpesvirusⅡ,CyHV-2)，又稱為皰疹造血器官壞死病毒(或金魚造血器官壞死病毒)，屬皰疹病毒目、皰疹病毒科、鯉皰疹病毒屬(Cyprinivirus)。由于是第二個分離自鯉科魚類的皰疹病毒，該病毒被國際病毒系統分類委員會命名為鯉皰疹病毒Ⅱ型[1-2]。該病毒為雙鏈DNA病毒，無囊膜包被的核衣殼呈六角形或球形，囊膜包被下的病毒粒子成橢圓形，大小為175～200 nm[3]。該病毒在中國、日本、美國、澳大利亞、新西蘭及歐洲一些國家均有報道，可造成養殖鯽魚(Carassiusauratus)和金魚大量死亡。現階段針對鯉皰疹病毒Ⅱ型的感染尚無有效的防控措施，不能有效地控制該病的暴發，因此，早診斷、早隔離、早防控是控制該病蔓延的有效手段。筆者基于國內外的相關研究進展，就鯉皰疹病毒Ⅱ型的免疫學檢測、分子生物學檢測、細胞培養分離等檢測技術進行了詳細的分析與梳理，以期為鯉皰疹病毒Ⅱ型的及早診斷及防控提供借鑒和思路。

1 研究機構分布

隨著鯉皰疹病毒Ⅱ型在世界范圍內傳播，并對金魚、鯽魚養殖業造成重大經濟損失，國內外研究人員對鯉皰疹病毒Ⅱ型的檢測技術開展了多方面的研究，以期做到病毒的早診斷、早隔離、早防控。目前國內外關于鯉皰疹病毒Ⅱ型檢測方法的相關報道共有60余篇，國內授權相關發明專利10余項。國內的研究機構主要有上海海洋大學、中國水產科學研究院、四川農業大學、蘇州大學、華中農業大學、南京師范大學、西南大學、南京農業大學、甘肅農業大學等(圖1、表1)。世界范圍內，除我國外，日本、美國、德國、英國、捷克、法國、波蘭、意大利、澳大利亞以及印度等對鯉皰疹病毒Ⅱ型的檢測方法也進行了相關研究(圖2)。

圖1 國內研究鯉皰疹病毒Ⅱ型檢測技術研究機構分布(以發表論文數量進行統計)Fig.1 Distribution of research institutions which have investigated CyHV-2 detection technology in domestic (based on the number of published papers)

表1 國內研究鯉皰疹病毒Ⅱ型檢測技術研究機構分布(以授權的發明專利進行統計)

圖2 國內外關于鯉皰疹病毒Ⅱ型檢測技術相關論文發表統計Fig.2 Statistics of the number of published papers on CyHV-2 detection technology in the worldwide

2 免疫學檢測方法

2.1 酶聯免疫吸附測定技術

酶聯免疫吸附測定(ELISA)技術是利用抗原抗體特異性結合進行免疫反應的定性和定量檢測方法，是免疫學中的經典檢測技術，具有靈敏度高、特異性強、操作簡單、適用于基層等優點。目前，已建立的鯉皰疹病毒Ⅱ型的酶聯免疫吸附測定檢測技術主要有兩種：雙抗夾心酶聯免疫吸附測定和間接酶聯免疫吸附測定。徐曄等[4]以抗ORF90單克隆抗體作為捕獲抗體，酶標抗ORF90多克隆抗體為檢測抗體，建立了鯉皰疹病毒Ⅱ型雙抗夾心酶聯免疫吸附測定檢測技術。該檢測方法具有良好的特異性，與鯉春病毒血癥病毒、流行性造血器官壞死病毒、傳染性造血器官壞死癥病毒、錦鯉皰疹病毒、傳染性胰腺壞死病毒、鮭魚傳染性貧血病毒、草魚出血病病毒等無交叉反應；檢測靈敏度高，對40份無臨床癥狀的樣本檢測發現，夾心酶聯免疫吸附測定方法的陽性檢出率為45%，而PCR技術的陽性檢出率僅為37.5%。此外，以抗ORF25單克隆抗體為檢測抗體，以酶標羊抗鼠IgG為二抗，建立了鯉皰疹病毒Ⅱ型間接酶聯免疫吸附測定檢測技術。利用該技術對無感染和感染鯉皰疹病毒Ⅱ型銀鯽(Carassiusauratusgibelio)的脾臟、鰓、腎臟的總蛋白進行檢測，發現鯉皰疹病毒Ⅱ型感染魚的脾臟、鰓和頭腎樣品中，酶聯免疫吸附測定結果為陽性(P/N值>2.1)，而未感染鯉皰疹病毒Ⅱ型魚組織檢測為陰性(P/N值<2.1)[5]。

2.2 免疫熒光檢測技術

3 分子生物學檢測方法

3.1 普通PCR檢測技術

3.2 雙重PCR檢測技術

雙重PCR是指在同一PCR反應體系里加上兩對引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，其反應原理、反應試劑和操作過程與普通PCR相同，但更為高效、快捷和準確。羅丹等[17]針對鯉皰疹病毒Ⅱ型三聯體蛋白基因的兩段保守序列作為擴增靶標合成引物，建立了雙重PCR檢測技術，可特異性擴增出218 bp和369 bp兩條目的片段，對鯉皰疹病毒Ⅱ型最低檢測限為3×102拷貝/μL，與基于相同基因而建立的普通PCR檢測技術(檢測限為2×104拷貝/μL)[14]相比，雙重PCR檢測的靈敏度更高。謝亞君等[18]針對鯉皰疹病毒Ⅱ型解旋酶基因建立的雙重PCR檢測技術，可特異性擴增出800 bp和250 bp兩條目的片段，對鯉皰疹病毒Ⅱ型的檢測限為1.4×104拷貝/μL。對不同地區采集的54尾異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)組織樣本進行鯉皰疹病毒Ⅱ型檢測，檢出率為72.2%。由此可見，鯉皰疹病毒Ⅱ型三聯體蛋白基因保守序列更適合作為雙重PCR檢測技術的擴增標靶。

3.3 巢式PCR檢測技術

3.4 實時熒光定量PCR技術

3.5 環介導等溫擴增檢測技術

環介導等溫擴增法是一種新穎的恒溫核酸擴增方法，是指針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件保溫30～60 min，完成核酸擴增反應。環介導等溫擴增是一種全新的核酸擴增方法，具有簡單、快速、特異性強的特點，檢測成本遠低于熒光定量PCR。目前，已建立的鯉皰疹病毒Ⅱ型環介導等溫擴增檢測技術主要聚焦于病毒基因序列中較為保守的解旋酶基因[32-36]，不同學者建立的方法、檢測時間和靈敏度有所不同，其檢測時間最短可在30 min內完成[33-34]，檢測靈敏度最高可達10-3拷貝/μL[35]。此外，還建立了針對鯉皰疹病毒Ⅱ型末端酶基因、DNA聚合酶基因和三聯體蛋白基因的環介導等溫擴增技術，經驗證均具有良好的特異性和靈敏度[18,37-39]。Li等[40]針對鯉皰疹病毒Ⅱ型建立了一種環介導等溫擴增與橫向流動試紙條相結合的一種新穎的檢測技術。該檢測需在64 ℃下反應60 min，最低的檢測限為4.93×104拷貝/μL；特異性強，對鯉皰疹病毒Ⅰ型、錦鯉皰疹病毒、傳染性脾腎壞死病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒、對蝦白斑綜合征病毒以及青蟹呼腸孤病毒等多種病毒無交叉反應。該方法耗時相對較長，且靈敏度相對不高，但操作簡單，可實現養殖生產中的現場操作。郝貴杰等[41]也建立了一種結合環介導等溫擴增和核酸橫向測流的檢測方法，經驗證，此方法對低拷貝病毒樣本、保存條件較差的鯉皰疹病毒Ⅱ型DNA也有良好的檢測效果，對凍融次數多達20次的帶毒樣本依然具有100%的檢出率。

3.6 其他分子檢測技術

Ding等[42]針對鯉皰疹病毒Ⅱ型建立了基于寡核苷酸探針的鯉皰疹病毒Ⅱ型熒光原位雜交(FISH)檢測技術，此技術具有良好的特異性，經驗證在43 ℃時熒光強度最大，探針質量濃度在5 ng/μL時獲得足夠特異的熒光，但探針質量濃度過高(50 ng/μL)，會導致熒光強度增高而特異性降低。Wang等[43]通過制備鯉皰疹病毒Ⅱ型感染魚樣品的外周血細胞涂片，建立了原位雜交技術(ISH)，發現探針與感染鯉皰疹病毒Ⅱ型的魚樣品相結合呈藍色反應，而與未感染魚樣品不結合。Yang等[44]根據GenBank中公布的鯉皰疹病毒Ⅱ型和鯉春病毒血癥病毒的核苷酸序列信息設計引物，建立了可同時檢測鯉皰疹病毒Ⅱ型和鯉春病毒血癥病毒的實時熒光定量PCR技術，此方法對兩種病毒的最低檢測限約為88個拷貝，且具有良好的特異性。齊立斐等[45]以鯉皰疹病毒Ⅱ型基因保守區域片段為靶序列設計特異性引物，建立了一種集核酸快速提取和競爭性互補介導核酸恒溫擴增(CAMP)微流控芯片于一體的檢測方法，其對鯉皰疹病毒Ⅱ型最低檢測限為10 拷貝/μL，與鯉皰疹病毒Ⅲ型無特異性擴增，特異性良好，對89批次樣本進行檢測，檢出率為100%。郝中香等[46-47]分別通過設計合成ORF6基因和DNA聚合酶基因特異性引物及TaqMan探針，建立了鯉皰疹病毒Ⅱ型微滴式數字PCR(ddPCR)檢測技術，對鯉皰疹病毒Ⅱ型最低檢測限為3.77拷貝/μL。徐進等[48]根據鯉皰疹病毒Ⅱ型的helicase基因編碼序列設計交叉引物，建立了一種交叉引物擴增檢測技術，此技術對鯉皰疹病毒Ⅱ型具有良好的特異性；最低檢測限為10 拷貝/μL。Wang等[49]針對鯉皰疹病毒Ⅱ型建立了一種基于重組酶聚合酶擴增(RPA)技術與側向流動免疫層析(LFD)技術相結合的檢測方法。此方法在38 ℃水浴中反應10 min，通過肉眼便可觀察到檢測結果，對鯉皰疹病毒Ⅱ型的檢測限高達5 pg，比常規PCR技術靈敏度高近百倍，且均不與傳染性皮下及造血組織壞死病毒、對蝦白斑綜合征病毒、草魚出血病病毒、鯉春病毒血癥病毒、錦鯉皰疹病毒等水生病毒發生反應，具有良好的特異性。此外，利用終點PCR技術和重組酶介導擴增(RAA)技術對鯉皰疹病毒Ⅱ型檢測，也表現出良好的特異性和靈敏度[50-53]。

4 細胞培養分離技術

5 展 望

眾所周知，鯉皰疹病毒Ⅱ型為引起金魚和鯽魚造血器官壞死病的病原，此病原給我國鯽魚養殖產業帶來巨大的經濟損失。目前，針對鯉皰疹病毒Ⅱ型的檢測國內外建立了免疫學檢測技術、分子生物學檢測技術、細胞培養分離技術等，這些技術均具有較好的靈敏度和特異性，但需要昂貴的儀器設備以及熟練的技能，比較適用于高技能的實驗人員操作，對養殖場等公開場合具有一定的局限性，因此急需建立操作簡單、檢測快速、適用于現場檢測的方法。膠體金免疫層析檢測試紙條(CGIS)是一種具有檢測速度快、穩定性好、操作簡單以及用肉眼即可判斷出檢測結果的檢測方法，其在水生動物多種病原檢測中已表現出良好的優越性，但目前仍未有關于鯉皰疹病毒Ⅱ型膠體金免疫層析試紙條相關的技術報道，下一步本實驗室將致力于鯉皰疹病毒Ⅱ型膠體金免疫層析試紙條的開發。