基于代謝組學分析工夫紅茶發酵過程中代謝物的變化

宮連瑾，薄佳慧，杜哲儒，李 瑾，孫紅玉，陳義琴，裴若云，肖力爭,3,*

（1.湖南農業大學茶學教育部重點實驗室，湖南長沙 410128；2.湖南農業大學國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南長沙 410128；3.湖南農業大學植物功能成分利用省部共建協同創新中心，湖南長沙 410128）

工夫紅茶是我國特有的傳統茶類，具有滋味甘甜醇厚、香氣優雅高長、湯色明亮的典型特征[1]。工夫紅茶的初制過程為萎凋、揉捻、發酵（氧化）和干燥，其中發酵過程是其色、香、味形成的關鍵工序[2]。因此，探索工夫紅茶發酵過程中內含物質的變化，是了解工夫紅茶品質形成的重要途徑。然而，由于分析方法的限制，對于復雜的發酵過程往往不能進行全面的研究。

如今，隨著科學技術的發展，檢測茶葉各方面指標的方法也開始增多，其中代謝組學技術已被廣泛應用于茶葉研究[3]。代謝組學研究主要采用氣相色譜質譜聯用、高效液相色譜質譜聯用、核磁共振、毛細血管電泳技術等方法，闡明茶葉加工過程中的化學變化，更加全面的展現了茶葉從種植到加工過程中內含物質的動態變化規律，從而揭示茶葉特殊風味的形成原理[4?6]。例如，研究證明，運用GC-MS（氣相色譜質譜聯用）可分離和鑒定紅茶中微量和芳香活性成分[7]。鄭起帆等[8]通過研究不同山頭普洱生茶的差異代謝物，運用1H-NMR（核磁共振）方法為普洱茶的品質評價找到新思路。戴宇樵等[9]采用HPLC-MS（超高相液相色譜/質譜聯用技術）探究云南大葉種“云抗10 號”曬青茶加工過程中代謝產物的變化，確定了影響曬青茶品質形成的標志性代謝物。

保靖黃金茶產于湖南湘西，其內含物質豐富、氨基酸含量高，所制綠茶“香、綠、爽、濃”，紅茶則“湯色紅艷、香高味濃”[10?11]。目前，關于黃金茶工夫紅茶的各方面研究都相對較少，探究其品質形成原因的研究更為稀少。基于此，本研究采用黃金茶為原料制作成工夫紅茶，利用代謝組學的液質聯用技術（LCMS/MS）探究其發酵過程中代謝產物的變化，以期為湖南工夫紅茶加工過程中的品質調控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮葉原料 均采自湖南湘西妙古金茶葉公司茶園，品種為保靖黃金茶，原料等級為一芽二葉，采摘時間為2020 年8 月上旬；甲醇、醋酸銨 色譜級，Thermo 公司；水 Merck 公司；甲酸 Fisher 公司。

Q Exactive? HF-X 質譜儀、Vanquish UHPLC色譜儀 Thermo 公司； Hypesil Gold column C18（100 mm×2.1 mm, 1.9 μm）色譜柱 Thermo Fisher 公司；D3024R 低溫離心機 Scilogex 公司；涼青架、涼青篩、55 型揉捻機 福建佳友公司；鏈板式烘干機 四川省農副產品加工技術開發公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品加工工藝 萎凋：準確稱取25 kg 鮮葉，進行室內萎凋（鮮葉薄攤2～3 cm，平均氣溫20 ℃）；揉捻：待萎凋至鮮葉含水量為62%～63%時，將萎凋葉轉入55 型揉捻機進行揉捻（不加壓5 min、輕壓10 min、重壓10 min、輕壓5 min、重壓10 min、輕壓5 min）；發酵：將揉捻葉轉入發酵室進行發酵（環境溫度28 ℃、相對濕度90%以上，發酵4 h）；干燥：發酵后，采用鏈板式烘干機進行干燥（毛火溫度120 ℃、足火溫度100 ℃，干燥至成品茶含水量為4%～5%止）。取樣：工夫紅茶發酵過程中，于發酵0、2、4 h 分別取樣，記為FJ0h、FJ2h、FJ4h；隨后將樣品迅速用液氮固定、置于-80 ℃儲存待進一步分析。每組樣品包含3 個生物學重復。

1.2.2 代謝物提取 取100 mg 液氮研磨的組織樣本，置于EP 管中，加入500 μL 含0.1%甲酸的80%甲醇水溶液，渦旋振蕩，冰浴靜置5 min，15000 r/min、4 ℃離心10 min，取一定量的上清液加質譜級水稀釋至甲醇含量為53%，并置于離心管中，15000 r/min、4 ℃離心10 min，收集上清液，進樣LC-MS 進行分析[12]。

質控（QC）樣本：每組待測樣本中的三個生物學重復樣品分別取等體積的樣本混勻制成QC 樣本，每組茶葉樣品均獨立制備質控樣品，用于平衡色譜-質譜系統和監測儀器狀態，在整個實驗過程中對系統穩定性進行評價。

空白（blank）樣本：含0.1%甲酸的53%甲醇水溶液代替實驗樣本，前處理過程與實驗樣本相同，主要用于去除背景離子。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Hypesil Gold column C18（100 mm×2.1 mm,1.9 μm）、柱溫：40 ℃、流速：0.2 mL/min、正離子模式：流動相A：0.1%甲酸、流動相B：甲醇；負離子模式：流動相A：5 mol/L 醋酸銨，pH9.0；流動相B：甲醇，洗脫條件如表1 所示。

表1 色譜梯度洗脫程序Table 1 Chromatographic gradient elution procedure

1.2.4 質譜條件 掃描范圍選擇m/z 70～1050；ESI 源的設置如下：噴霧電壓：3.2 kV；鞘層氣體流速：40 arb；輔助氣體流量率：10 arb；毛細管溫度：320 ℃；極性：正，負；MS/MS，二級掃描為數據相關掃描。

1.3 數據處理

下機原始數據使用CD3.1 軟件根據保留時間、質荷比等參數進行數據預處理。對于不同樣本，根據保留時間偏差和質量偏差（Part per million, ppm）進行峰對齊；隨后根據設置的ppm、信噪比（Signal-tonoise ratio, S/N）、加合離子等信息進行峰提取，并對峰面積進行定量。然后比對高分辨二級譜圖數據庫mzCloud、mzVault 以及MassList 一級數據庫檢索（數據庫由北京諾禾致源生物科技股份有限公司提供），進行代謝物鑒定。用Blank 樣本去除背景離子，并對定量結果進行歸一化，最后得到數據的鑒定和定量結果。保留QC 樣本中變異系數（Coefficient of Variance, CV）小于30%的代謝物作為最終的鑒定結果，進行后續分析[13]。主成分分析采用SIMCA 14.1軟件進行分析，數據分析采用Excel 2019 及SPSS 22.0 軟件，熱圖繪制使用TBtools 軟件。

2 結果與分析

2.1 主成分分析

以三個樣品組（正離子模式和負離子模式檢測結果合并）的代謝物進行主成分分析，根據離散度分析樣品重復性及差異性，判斷儀器穩定性和數據有效性。若樣品離散度小，則儀器穩定，檢測結果可靠。如圖1 所示，三個樣品組明顯分開，插入的QC 樣本可以很好的重疊，說明儀器具有較好的穩定性。且樣品組內生物學重復樣品離散度小，表明生物學重復樣品的重復性好，具有代表性，為后續代謝物分析結果的準確提供了依據。另外，由圖1 可知，工夫紅茶發酵過程中代謝物逐漸變化。發酵0 h 樣品與發酵2、4 h 樣品距離較遠，而發酵2 h 與發酵4 h 樣品組較為接近。由此可見，發酵前期物質變化明顯，提示發酵前期是工夫紅茶品質形成的關鍵階段。

圖1 工夫紅茶發酵過程中代謝物主成分分析得分圖Fig.1 Principal component analysis scores of metabolites during the congou black tea fermentation

2.2 差異代謝物分析

本次實驗共檢測到1415 種代謝物（正離子模式和負離子模式檢測結果合并），參考岳文杰等[14]、Yue 等[15]的數據處理方法，利用SPSS 軟件，以1415個代謝物的響應強度（峰面積）為指標，進行單因素方差分析，以獲得每個代謝物的P值，并以P<0.05（Bonferroni 校正）篩選工夫紅茶發酵過程中的差異代謝物，共篩選到493 個差異代謝物。對獲得的所有差異代謝物進行層次聚類分析，這些差異代謝物在發酵過程中的變化規律如圖2 所示。在發酵過程中，493 個差異代謝物的含量變化趨勢主要分為四個類型：第一類呈現“較高→高→較低”的變化趨勢，這類代謝物在發酵前期含量較高，隨著發酵的進行逐漸降低；第二類呈現“較高→低→較低”的變化趨勢，在發酵前期的含量最高，而隨著發酵的進行，含量不斷下降，特別是發酵至4 h 時，含量出現比較明顯的下降趨勢；第三類呈現“較低→高→較高”的變化趨勢，這類代謝物在發酵前期的含量低，而發酵至2 h 時含量明顯上升，直至發酵結束；第四類呈現“較低→低→較高”的變化趨勢，這類代謝物直至發酵后期，即發酵至4 h，含量才明顯上升。此外還對兩組間的差異代謝物進行統計分析，如表2 所示。結果顯示，FJ2 h vs FJ0 h、FJ4 h vs FJ0 h、FJ4 h vs FJ2 h 分別篩選到206、482、112 個差異代謝物，其中上調表達的分別有175、368、81 個，下調表達的分別有31、114、31 個。綜上所述，工夫紅茶發酵過程中，差異代謝物變化趨勢明顯，且發酵過程中上調的差異代謝物數量均大于下調的差異代謝物數量；發酵2 h 后代謝物明顯差異于發酵0 h；發酵前期差異代謝物數量多于發酵后期，物質代謝更加活躍。

表2 各組間代謝物差異篩選結果Table 2 Screening results of metabolite differences among groups

圖2 工夫紅茶發酵過程中總差異代謝物的變化熱圖Fig.2 Heat map of changes in total differential metabolites during the fermentation of congou black tea

2.3 不同類別差異代謝物的鑒定與分析

以上述493 種差異代謝物進行定性分析，共鑒定到90 個代謝物，包括15 種兒茶素及其聚合物、22 種氨基酸、10 種有機酸、3 種核苷、20 種黃酮醇及其糖苷、12 種生物堿、8 種可溶性糖。

2.3.1 兒茶素及其聚合物類物質的變化分析 如圖3 所示，15 種鑒定到的具有差異變化的兒茶素及其聚合物：（-）-EGC（（-）-Epigallocatechin）、CG（Catechin gallate）、（-）-EGCG（（-）-Epigallocatechin gallate）、EC（Epicatechin）、ECG（Epicatechin-3-Ogallate）、ETFGg（Epitheaflagallin 3-O-gallate）、（-）-GC（（-）-Gallocatechin）、C（Catechin）、（-）-CG（（-）-Catechin Gallate）、EGC（Epigallocatechin）、茶黃素-3,3'-雙沒食子酸酯（Theaflavine-3,3-digallate）、茶黃素-3-沒食子酸酯（Theaflavin monogallate）、原花青素A2（Procyanidin A2）、原花青素B2（Procyanidin B2）、原花青素B1（Procyanidin B1）。在發酵過程中，這15 種物質表現為兩種變化趨勢，第一種：兒茶素類與原花青素類物質呈明顯下調趨勢；第二種：茶黃素類物質呈顯著上調趨勢，這與前人的研究結果一致[16?18]。茶黃素是紅茶特有的代謝物，對紅茶茶湯滋味和色澤品質起著決定性的作用，在紅茶發酵時，兒茶素與酶結合發生酶促氧化生成大量茶黃素類物質[19]，故在此過程中可觀察到兒茶素類物質的大幅度下降以及茶黃素類物質的明顯增加。原花青素是以兒茶素單體為結構單元構成的一種二聚體化合物，廣泛存在于自然界的眾多植物中。茶葉不同的加工方式會導致其含量發生明顯變化，其中以綠茶中原花青素含量最高，紅茶和黑茶最低[20?22]，表明原花青素含量隨茶葉的發酵程度的加深而減少，這在本實驗中得到了證實。原花青素含量在紅茶發酵過程中逐漸降低，初步推斷可能是原花青素在紅茶發酵環境下發生了氧化導致其含量下降，但其氧化機理有待進一步解析。

圖3 工夫紅茶發酵過程中兒茶素及其聚合物的變化Fig.3 Changes of catechins and their polymers during the fermentation of congou black tea

2.3.2 氨基酸類物質的變化分析 氨基酸作為茶葉中重要的化學成分，與茶葉的品質和營養價值密切相關。目前，從茶葉中已鑒定出的氨基酸共有26 種。按照滋味特征劃分，茶葉中的氨基酸主要包括鮮甜的茶氨酸，鮮酸的谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺，甜味的甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸，苦味的精氨酸[23?24]。其中茶氨酸是茶葉中含量最高的氨基酸，也是茶葉的特有成分[25]。茶葉的風味口感主要由谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、茶氨酸等鮮味和鮮爽類的氨基酸決定[26]。此外，高溫條件下氨基酸可脫水釋放烘烤香，也可在高溫低濕條件下與糖類發生美拉德反應，產生焦糖香[23]。

如圖4 所示，在發酵工序中，鑒定到的22 種差異表達的氨基酸，除L-蘇氨酸呈現波動變化外，其余氨基酸都呈極顯著變化，產生大幅度下調，這與從前關于氨基酸變化規律的研究結果相似[27?28]。有研究指出，紅茶加工過程中，氨基酸含量的下降可能是由于其轉化成了其他物質，并認為有兩種可能的途徑可以將游離氨基酸轉化為茶葉香氣化合物或揮發性化合物。一是氨基酸與兒茶素氧化產物—鄰醌結合，二是一些氨基酸，如苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸等，部分轉化為醛、醇等物質[27,29?30]。

圖4 工夫紅茶發酵過程中氨基酸類物質的變化Fig.4 Changes of amino acids during the fermentation of congou black tea

2.3.3 黃酮醇及其糖苷類物質的變化分析 黃酮類化合物是茶葉中一類低分子量的酚類化合物，分為黃酮、黃酮醇。紅茶中的黃酮類物質主要是異黃酮、黃烷酮和黃酮醇等[31]。大多數情況下，黃酮醇常與糖結合成糖苷以碳糖基的形式存在，茶葉中黃酮醇類主要以槲皮素（苷）和山奈素（苷）和楊梅素（苷）的形式存在[32?33]。據報道，在紅茶茶湯中，除了兒茶素外，一系列的黃酮-3-醇吡喃糖苷也是影響紅茶口感的重要因素[34?35]。這類黃酮-3-醇苷在極低的閾值濃度下不僅能產生天鵝絨般的苦澀感，還能通過增強咖啡堿的苦味強度促進紅茶茶湯的苦味。

如圖5 所示在本研究的工夫紅茶發酵過程樣中共鑒定到20 種差異表達的黃酮及其糖苷物質，包括15 種黃酮醇：車前草苷、蕓香柚皮苷、新橙皮苷二氫查爾酮、高麗槐素、槲皮素、異鼠李素、二氫槲皮素、異丹葉大黃素、二氫楊梅素、楊梅素、異甘草苷、山奈酚、橙皮素、矢車菊素、熊果苷；5 種黃酮醇糖苷：楊梅素3-O-β-D-半乳糖苷、花青素鼠李葡糖苷、槲皮素-3-D-木糖甙、槲皮素-3,4’-O-D-β-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷。工夫紅茶發酵過程中，這20 種物質的變化趨勢分為三種類型，第一類：發酵2 h 后下調表達（二氫槲皮素、二氫楊梅素、楊梅素、異甘草苷、矢車菊素、楊梅素3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-D-木糖甙、槲皮素-3,4’-O-D-β-葡萄糖苷）；第二類：發酵2 h 后上調表達（車前草苷、蕓香柚皮苷、新橙皮苷二氫查爾酮、高麗槐素、槲皮素、異丹葉大黃素、橙皮素、熊果苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷）；第三類：發酵2 h 后上調表達，發酵4 h 后下調表達（異鼠李素、山奈酚、花青素鼠李葡糖苷）。Guo 等[36]進行了PPO+POD 處理黃酮糖苷的體外研究，驗證了PPO、POD 能促進茶葉中黃酮糖苷的轉化，從而導致其含量的下降。但目前針對茶葉加工過程中黃酮醇及其糖苷物質變化的研究較少，因此，對于工夫紅茶發酵過程中黃酮醇及其糖苷類物質具體的變化機理還需做進一步探索。

圖5 工夫紅茶發酵過程中黃酮醇及其糖苷類物質的變化Fig.5 Changes of Flavonols and their glycosides during the fermentation of congou black tea

2.3.4 生物堿類物質的變化分析 茶葉中的生物堿以嘌呤類為主，其中，含量最多的是咖啡堿（2%～5%）[37]。咖啡堿是一種結構為1,3,7-三甲基黃嘌呤的生物堿，是茶葉中重要的生物活性成分和呈味物質，一般茶葉品質越好，咖啡堿含量越高[38]。咖啡堿呈苦味，且閾值較低，據研究表明，多酚類物質可增強其苦味強度，而氨基酸則能減弱其苦味強度[39]。茶湯中含有豐富復雜的化合物種類，既存在氨基酸，也包括多酚類物質，會對茶湯中咖啡堿的呈味產生綜合影響[40]。

如圖6 所示本次研究共鑒定到12 種差異表達的生物堿，前人重點研究關注的咖啡堿、可可堿、茶堿也包括其中。咖啡堿在發酵過程中呈現先上調后下調的變化趨勢，而可可堿和茶堿則是表現先下調后上調的變化趨勢。這與先前的研究結果略有出入，初步推斷，這可能與茶葉加工工藝及品種不同有關[41?42]。其余生物堿，除大麥芽新堿與山蠟梅堿外，均是上調表達。

圖6 工夫紅茶發酵過程中生物堿類物質的變化Fig.6 Changes of alkaloids during the fermentation of congou black tea

2.3.5 其他類物質的變化分析 此外，還鑒定到了10 種有機酸、3 種核苷以及8 種可溶性糖。可溶性糖是茶葉中主要的水溶性碳水化合物[43]，其主要包括三類，可溶于水的單糖（果糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、核糖、木酮糖和阿拉伯糖等）和雙糖（蔗糖、乳糖、麥芽糖、棉子糖等），以及不溶于水的多糖（淀粉、纖維素、半纖維素、木質素和果膠），單糖和雙糖均具有甜味[37]，一定程度上能削弱茶湯的苦澀[44]，是構成茶湯甜醇滋味的物質基礎之一。在本實驗中，D-阿拉伯糖、蔗糖、水蘇糖、纖維三糖、D（-）-來蘇糖、L（-）巖藻糖、D-木糖、D（-）-果糖是主要差異表達的可溶性糖類，且變化趨勢為總體上調，這對工夫紅茶甜醇滋味的品質形成具有重要意義。

如圖7 所示10 種鑒定到的有機酸在工夫紅茶發酵過程中均上調表達，3 種核苷在發酵2 h 時上調表達，發酵4 h 后下調表達。有機酸是構成茶葉香氣和滋味的主要成分之一,占茶葉干物質總量的3%左右[45]。前人的研究表明，在紅茶加工中，有機酸代謝對于紅茶香氣的形成及轉化具有重要影響[46]，基于此，猜測有機酸類物質在發酵階段的上調表達有利于紅茶香氣物質在加工后期的積累。

圖7 工夫紅茶發酵過程中其他類物質的變化Fig.7 Changes of other substances during the fermentation of congou black tea

3 結論

發酵是工夫紅茶加工過程中的關鍵工序，在發酵過程中，豐富的內含物質發生著復雜的化學變化，為形成工夫紅茶特有的品質特征奠定基礎[47]。前期的研究主要集中在工夫紅茶發酵工藝的改善及品質化學分析方面，對于發酵過程中眾多小分子代謝產物的變化規律仍不清晰[48?49]。

本實驗采用基于代謝組學的液質聯用技術（LCMS/MS）對工夫紅茶發酵過程中的代謝物進行鑒定分析，實現了對發酵各個階段的明顯區分，同時發現，在發酵過程中，工夫紅茶的代謝物含量變化以發酵2 h 和發酵4 h 為時間節點，分為發酵前期（0～2 h）和發酵后期（2～4 h）。在這兩個不同的發酵階段，上調的差異代謝物數量均大于下調的差異代謝物數量；發酵2 h 后代謝物明顯差異于發酵0 h；發酵前期差異代謝物數量多于發酵后期，物質代謝更加活躍，暗示發酵前期是工夫紅茶品質形成的關鍵階段；此外，還對鑒定到的差異表達的代謝物進行了分析鑒定，結果顯示，在整個發酵過程中，呈澀味代謝物下調表達，可溶性糖、茶黃素類呈甜醇、鮮爽滋味的代謝物明顯上調表達。綜上，此研究的分析結果不僅為探索發酵時間與滋味品質形成的關系提供了理論依據，同時也可以利用這些代謝物的變化規律為生產某些高含量成分的工夫紅茶產品提供參考，對湖南省工夫紅茶的生產實踐具有一定的指導意義。但由于未采用精確定量的樣品檢測方法，且實驗品種過于單一，本研究工作還存在許多不足。接下來應采取絕對定量的方法以及選取豐富的紅茶適制品種進行研究，以期能全面解析工夫紅茶發酵過程中具體物質的變化機理。