傳統(tǒng)牦牛酸奶源高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌特性及發(fā)酵性能

降初祝瑪，陳煉紅，張 巖

（西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041）

傳統(tǒng)的牦牛奶是藏區(qū)農(nóng)牧民必不可少的飲品，牦牛奶中含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且含量高于普通牛奶，牦牛奶經(jīng)發(fā)酵后，具有抗氧化、降膽固醇等保健功能[1]，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也隨之發(fā)生變化，具有較為豐富的微生物菌相，是獲取具有優(yōu)良發(fā)酵性能乳酸菌的主要來源[2]。乳酸菌（Lactic acid bacteria, LAB）是公認(rèn)的安全的食品級(jí)微生物[3]，其次級(jí)代謝產(chǎn)物胞外多糖（Exopolysaccharide, EPS）是乳酸菌在生長(zhǎng)過程代謝中分泌到細(xì)胞壁外或滲入培養(yǎng)基中的一種多糖及其混合物[4]，本身具有保護(hù)菌體[5]、抑制癌細(xì)胞增殖[6]、調(diào)節(jié)免疫能力等生理功能[7]。此外，研究表明EPS乳酸菌對(duì)酸奶流變學(xué)特性[8]，組織狀態(tài)、質(zhì)地和黏稠度等有益[9?10]。

近年來,胞外多糖乳酸菌可用于食品工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域，具有潛在的開發(fā)價(jià)值，其發(fā)酵性能也是研究的熱點(diǎn)[11]。目前我國(guó)對(duì)牦牛乳源高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌研究不多，局限于對(duì)其篩選鑒定和益生功能與耐受力的探討，如唐超群等[12]從牧民自制的牦牛乳制品（奶渣）中分離得到胞外多糖乳酸菌。王翔宇等[13]研究了傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳中2 株高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌在模擬消化道中耐受力。從未對(duì)川西高原發(fā)酵牦牛酸乳中篩選出的高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌進(jìn)行其菌株特性和發(fā)酵性能的研究。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用培養(yǎng)高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌菌株在其生長(zhǎng)達(dá)到最佳收獲時(shí)間，獲得菌體，對(duì)菌株進(jìn)行耐不良環(huán)境能力的實(shí)驗(yàn)，再利用菌體發(fā)酵酸奶，測(cè)定酸奶的發(fā)酵性能。本研究對(duì)于開發(fā)青藏高原極端環(huán)境條件下的發(fā)酵劑種質(zhì)資源，生產(chǎn)功能性乳制品、豐富現(xiàn)有乳制品種類、提高乳制品的附加值將具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

6 株高產(chǎn)EPS 乳酸菌 均分離自四川藏區(qū)傳統(tǒng)牦牛酸奶，經(jīng)過16S rDNA 測(cè)序鑒定，其鑒定結(jié)果和來源地如表1。由西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院保藏。

表1 菌株來源Table 1 Source of strains

巴氏殺菌鮮奶、蔗糖 購(gòu)買于沃爾瑪超市；M17 固體培養(yǎng)基、MRS 肉湯培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；氯化鈉、牛膽鹽、鹽酸、十六烷、二甲苯、氫氧化鈉、三氯乙酸、鄰苯二胺 均為分析純，成都康迪生物技術(shù)有限公司；酚酞指示劑、雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)液、碘液、PBS 磷酸緩沖鹽溶液 成都創(chuàng)諾飛生物科技有限公司。

PYX﹣DHS﹣50X65﹣BS﹣Ⅱ型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京中科蘭澤科技有限公司；PHS-3C 型pH 計(jì) 上海雷磁儀器廠；HC-2062 型高速離心機(jī)安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；UV-2100 型分光光度計(jì) 尤尼柯儀器有限公司；HH-數(shù)顯恒溫水浴鍋

國(guó)華電器有限公司；PL303 型分析天平 梅特勒托利多儀器有限公司；TA-XT.Plus 質(zhì)構(gòu)分析儀 英國(guó)Stable Micro Systems 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株特性

1.2.1.1 菌株的生長(zhǎng)曲線 將冷凍保存的六株高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌菌株進(jìn)行解凍，混勻后吸取100 μL菌液置于5 mL 液體培養(yǎng)基中傳三代進(jìn)行活化，使得菌種充分恢復(fù)活性，最后按照3%的接種量接種在MRS 液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)。

乳酸菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：將充分活化的菌株按3%的接種量接入5 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，在0 h 開始取樣，每隔2 h 取樣，用沒有接過菌種的MRS 液體培養(yǎng)基作為空白調(diào)零，測(cè)定OD600值，三組平行求平均值[14]。

1.2.1.2 菌株的耐酸性 用鹽酸調(diào)節(jié)MRS 液體培養(yǎng)基pH 為1.5、2.5、3.5、4.5、5.5，接上3%的菌株培養(yǎng)液，37 ℃厭氧培養(yǎng)，在24 h 時(shí)取樣，用沒有接過菌液的對(duì)應(yīng)pH 的MRS 液體培養(yǎng)基作為空白調(diào)零，測(cè)定OD600值，三組平行求平均值[15]。

1.2.1.3 菌株的耐膽鹽 按菌株3%的接種量分別接到牛膽鹽濃度分別為0.05%、0.1%、0.5%、1.0%、1.5%已滅菌MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)，在24 h 時(shí)取樣，用沒有接過菌液相對(duì)應(yīng)的牛膽鹽濃度MRS 液體培養(yǎng)基作為空白調(diào)零，測(cè)定OD600值，三組平行求平均值[16]。

1.2.1.4 菌株的耐滲透壓 按菌株3%的接種量分別接到NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3%、4%、5%、6%、7%已滅菌 MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)，在24 h 時(shí)取樣，用沒有接過菌液相對(duì)應(yīng) NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)MRS 液體培養(yǎng)基作為空白調(diào)零，測(cè)定OD600值，三組平行求平均值[17]。

1.2.1.5 菌株的細(xì)胞表面疏水性 PBS（磷酸鹽緩沖液）：0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O 18.5 mL+ 0.2 mol/L NaH2PO4·2H2O 81.5 mL，用蒸餾水稀釋1 倍，PBS pH=6.2±0.2。

菌體重懸液的制備：將六株乳酸菌的菌株培養(yǎng)液分別在6000 r/min，4 ℃條件下離心10 min，得到菌體，用PBS 洗滌菌體2 次，10 mL/次[18]。PBS 為空白對(duì)照，并用PBS 調(diào)整菌液的濃度，用分光光度計(jì)測(cè)定OD600值為0.6±0.02。

菌體表面疏水性的測(cè)定：取每管為5 mL 的菌體重懸液到試管中，再往試管中分別加入200 μL 的十六烷和二甲苯，對(duì)照組不加，該兩相體系通過渦旋徹底混合1 min，靜置15 min 分層。取水相，PBS 為空白對(duì)照，測(cè)量OD600值并記錄。每組平行做5 管，分別記錄OD 值，并進(jìn)行3 次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)[17]。通過以下公式計(jì)算：

表面疏水性（%）=（對(duì)照組OD600?實(shí)驗(yàn)組 OD600）/對(duì)照組 OD600×100

1.2.2 菌株的發(fā)酵性能

1.2.2.1 凝乳時(shí)間 用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的生鮮牛奶，加入白砂糖，高壓均質(zhì)化，巴氏滅菌30 min，冷卻到42 ℃，按照3%比例接種六株乳酸菌的菌體，在42 ℃溫度下發(fā)酵酸奶至凝乳狀態(tài)（當(dāng)發(fā)酵到液體全部轉(zhuǎn)化成凝固狀，輕微搖晃不改變固體形狀時(shí)，停止發(fā)酵），確定發(fā)酵時(shí)間，酸奶凝乳后，4 ℃冷藏保存[19]。

1.2.2.2 持水力測(cè)定 取發(fā)酵酸奶樣品10 g 裝入離心管中，在5500 r/min 轉(zhuǎn)速下，低溫離心30 min，倒掉上清液，倒置10 min,讓上清液充分流出，最后立即稱量沉淀的質(zhì)量[20]。計(jì)算公式如下：

持水力（%）=離心后沉淀質(zhì)量/樣品質(zhì)量×100

1.2.2.3 酸化能力 將六株乳酸菌的菌體培養(yǎng)液分別按3%的比例接種到牛奶中，在42 ℃條件下發(fā)酵。在發(fā)酵過程中2 h 取一次樣,測(cè)定酸奶的滴定酸度。

1.2.2.4 后酸化能力 六株乳酸菌的菌體培養(yǎng)液分別按3%的比例接種到牛奶后，經(jīng)42 ℃條件發(fā)酵至凝固后放入4 ℃環(huán)境中貯藏。測(cè)定酸奶在冷藏1、3、5、10、15 d 后的滴定酸度，根據(jù)酸奶在貯藏期間滴定酸度的增加量來判斷后酸化能力的高低。

1.2.2.5 冷藏期間活菌數(shù)的變化 采用稀釋平板計(jì)數(shù)法，在無菌條件下，分別取1 mL 4 ℃冷藏1、3、5、10、15 d 的酸奶樣品，在9 mL 的0.9%的NaCl溶液中進(jìn)行10 倍的梯度稀釋，使其混勻后，分別吸取1 mL 10-5、10-6、10-7的樣品稀釋液于滅菌的培養(yǎng)皿中，倒入20 mL 已滅菌并冷卻至45～50 ℃的MRS瓊脂培養(yǎng)基，將樣品稀釋液涂布于凝固后的MRS 瓊脂培養(yǎng)基。等培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基冷卻凝固后，將培養(yǎng)皿倒置放入（36±1）℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)18～24 h。測(cè)定酸奶冷藏期間活菌數(shù)的變化[19]。

1.2.2.6 發(fā)酵酸奶的乙醛含量測(cè)定 將8%的TCA溶液與酸奶樣品按比例混勻，在5500 r/min 轉(zhuǎn)速下，低溫離心10 min，取5 mL 過濾后的上清液，加入1 mL濃度為1%的 NaHSO3溶液振蕩搖勻，在室溫環(huán)境下放置60 min，然后加入0.5 mL 的1%淀粉溶液，用0.1 mol/L 的碘標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，快接近終點(diǎn)時(shí)換0.01 mol/L 的碘標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定到為初滴定終點(diǎn)，（溶液變?yōu)榈{(lán)色，30 s 不褪色），不計(jì)數(shù)。再加入10 mL的1 mol/L NaHCO3，搖勻到溶液顏色消失，最后用0.01 mol/L 的碘標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定到終點(diǎn)，記錄消耗的碘標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，同時(shí)做空白對(duì)照試驗(yàn)[21]，三組平行求平均值。

1.2.2.7 發(fā)酵酸奶的雙乙酰含量測(cè)定 參考呂嘉櫪等[22]的方法，用0.5%的鄰苯二胺與不同濃度的雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)生成2,3-二甲基并吡嗪，在波長(zhǎng)為325 nm時(shí)有最大吸收值，可對(duì)雙乙酰含量進(jìn)行定量測(cè)定。三組平行求平均值。

1.2.2.8 酸奶的質(zhì)構(gòu)（TPA）測(cè)定 質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定樣品，重復(fù)測(cè)定3 次，求其平均值。質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定設(shè)置參數(shù)：探頭：A/BE35；測(cè)試距離：25.00 mm；測(cè)定前探頭速度：2.00 mm/s；測(cè)定時(shí)探頭速度：2.00 mm/s；測(cè)定后探頭速度：2.00 mm/s；感應(yīng)力：Auto-10.0 g[23?24]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2013 和SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，每個(gè)試驗(yàn)做三個(gè)重復(fù)，顯著差異水平取P<0.05。

2 結(jié)果分析

2.1 生長(zhǎng)曲線

由圖1 可知，六株乳酸菌菌株的生長(zhǎng)在前2 h 內(nèi)生長(zhǎng)量均沒有明顯變化，經(jīng)過短時(shí)間的遲緩期后，從4 h 開始到了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，隨后菌數(shù)呈指數(shù)上升。218、276、266 在14 h 進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)穩(wěn)定期，271、285、231 在16 h 進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)穩(wěn)定期。其中編號(hào)218 的菌株生長(zhǎng)在14 h 時(shí)OD 值為2.188，是六株菌株中生長(zhǎng)量最高的。

圖1 乳酸菌在生長(zhǎng)期間OD 值的變化曲線Fig.1 The curve of OD value of lactic acid bacteria during growth

2.2 耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 耐酸實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析 人體正常胃酸pH 在3.0 左右，空腹與食用酸性食品時(shí)pH 達(dá)1.5，而食用堿性食物時(shí)，其pH 一般為4.0～5.0[25]。因此，具有較強(qiáng)耐酸能力的乳酸菌才能夠順利通過胃酸屏障，并到達(dá)腸道內(nèi)發(fā)揮其益生作用。由表2 可知，隨著介質(zhì)pH 的增大，6 株胞外多糖乳酸菌生長(zhǎng)繁殖能力增強(qiáng)，來自酸的抑制作用減弱。當(dāng)培養(yǎng)介質(zhì)pH 在2.5～5.5時(shí)，同種乳酸菌OD 值有顯著差異（P<0.05），說明pH對(duì)菌株的生長(zhǎng)影響較大；當(dāng)培養(yǎng)介質(zhì)pH 在1.5 時(shí)，菌株生長(zhǎng)被抑制，但仍能夠存活和生長(zhǎng)，其中編號(hào)為276 的菌株OD 值最大（P<0.05），說明該菌株具有良好的耐酸能力。

表2 乳酸菌在不同pH 下OD 值的變化Table 2 The change of OD value of lactic acid bacteria under different pH

2.2.2 耐膽鹽的結(jié)果分析 人體小腸內(nèi)膽鹽的含量一般在0.03%～0.3%范圍內(nèi)波動(dòng)[26]，食物通過腸道的時(shí)間一般是4～16 h，乳酸菌的耐膽鹽能力也是乳酸菌能否在腸道存活的重要條件。由表3 可知，六株菌株在膽鹽濃度為0.05%～0.5%時(shí)，生長(zhǎng)狀態(tài)均良好，說明六株菌株在正常人體的膽鹽范圍內(nèi)可以存活；六株菌株均在0.5%的濃度下生長(zhǎng)達(dá)到最高值，其中編號(hào)266、218、231 的菌株生長(zhǎng)量最優(yōu)（P<0.05），表現(xiàn)出對(duì)高濃度膽鹽的耐受性較強(qiáng)；膽鹽濃度在1%～1.5%時(shí)，六株菌株生長(zhǎng)受到抑制，說明這六株菌株不耐高膽鹽環(huán)境。

表3 乳酸菌在不同膽鹽濃度下OD 值的變化Table 3 The change of OD value of lactic acid bacteria under different bile salt concentration

2.2.3 耐滲透壓的結(jié)果分析 NaCl 在人體內(nèi)的含量約為1%～4%[27]，高鹽會(huì)導(dǎo)致高滲透壓，當(dāng)滲透壓濃度突然變化時(shí)，會(huì)影響到乳酸菌的生長(zhǎng)代謝，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致乳酸菌的死亡。由表4 可知，6 株乳酸菌OD 值均隨著NaCl 濃度的增大而降低。6 株菌株在較低NaCl 濃度（3%、4%）時(shí)，生長(zhǎng)狀態(tài)均良好，表明均具有較好的耐滲透壓的能力；當(dāng)添加5% NaCl 濃度時(shí)，285 菌株的生長(zhǎng)量為最高值（P<0.05），表明菌株285 對(duì)高滲透壓的耐受性較強(qiáng)。六株菌株在較高NaCl 濃度（6%、7%）時(shí)，六株菌株生長(zhǎng)均被抑制，菌體處于低生存狀態(tài)，基本不生長(zhǎng)繁殖。

表4 乳酸菌在不同NaCl 濃度下OD 值的變化Table 4 The change of OD value of lactic acid bacteria under different NaCl concentration

2.2.4 細(xì)菌表面疏水性的結(jié)果分析 對(duì)腸道黏附能力是乳酸菌在人體內(nèi)發(fā)揮益生作用的前提，而細(xì)菌的表面疏水性與黏附能力呈正相關(guān)，因此根據(jù)疏水性的大小可篩選出潛在的高粘附性菌株[28]。由圖2 可知，通過十六烷和二甲苯處理，不同菌株間的疏水性差異顯著（P<0.05），菌株285 和218 在兩種有機(jī)試劑中的疏水性均顯著（P<0.05）高于其他菌株，且與十六烷的結(jié)合效果較好。其中編號(hào)266 的菌株在十六烷中表面疏水性最低為2.3%。六株乳酸菌的菌株表面疏水性的大小排序?yàn)椋?85>218>231>276>271>266。

圖2 乳酸菌的表面疏水性Fig.2 The surface hydrophobicity of lactic acid bacteria

2.3 發(fā)酵性能

2.3.1 凝乳時(shí)間的結(jié)果分析 在生產(chǎn)酸奶的過程中，凝乳時(shí)間太短不利于酸奶中芳香物質(zhì)的形成，使酸奶不香，同時(shí)還可能使酸奶凝乳狀態(tài)不佳；而凝乳時(shí)間太長(zhǎng)不利于酸奶的工廠生產(chǎn)，成本過高，同時(shí)還容易導(dǎo)致產(chǎn)品的污染。六株乳酸菌的菌株發(fā)酵酸奶都在6～8 h 內(nèi)凝固。

2.3.2 持水力的結(jié)果分析 酸奶離心后所截留的水分稱為持水力（WHC），多為凝膠中大分子物質(zhì)結(jié)合較緊密的水分[29]，WHC 越高，該體系中的大分子結(jié)合水分子的作用力越強(qiáng)，穩(wěn)定性也越好。由圖3 可知，1～5 d 內(nèi)，六株菌株的持水力緩慢上升，其中218、231、276 在第5 d 開始迅速上升，在第15 d 達(dá)到最高值。菌株218 發(fā)酵的酸奶持水力最強(qiáng)，達(dá)到了60.98%。這可能是由于產(chǎn)EPS 的乳酸菌發(fā)酵乳中含有微孔，EPS 在這些微孔里使蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)形成更厚更濃密的蛋白質(zhì)凝膠通道，這種結(jié)構(gòu)更有利于防止發(fā)酵乳乳清析出[30]，從而增加了發(fā)酵乳的持水力。

圖3 冷藏期間持水力的變化Fig.3 The change in water holding capacity during cold storage

2.3.3 酸化能力的結(jié)果分析 產(chǎn)酸能力是乳酸菌的重要性能，產(chǎn)酸快的乳酸菌有利于生產(chǎn)時(shí)發(fā)酵時(shí)間的縮短，可以提升生產(chǎn)效率，但當(dāng)產(chǎn)酸過多，酸度增加會(huì)破壞酸奶的滋味和凝乳狀態(tài)，而且高濃度的酸會(huì)阻礙乳酸菌的生長(zhǎng)，也會(huì)影響酸奶的組織結(jié)構(gòu)和品質(zhì)。由圖4 可知，在整個(gè)發(fā)酵時(shí)期，六種酸奶的酸度增長(zhǎng)較快，發(fā)酵期結(jié)束時(shí)，6 種酸奶的酸度均已達(dá)到70 °T，均符合國(guó)標(biāo)GB 19302-2010 中的對(duì)發(fā)酵乳中酸度要求（>70 °T）[31]，其中編號(hào)218 的菌株的酸度最高，為83 °T。

圖4 發(fā)酵期間滴定酸度的變化Fig.4 The changes in titration of acidity during fermentation

2.3.4 后酸化能力的結(jié)果分析 后酸化是指酸奶在4 ℃條件下低溫貯藏，乳酸菌仍具有活力，繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，酸度會(huì)發(fā)生變化[32]。酸奶酸度增加過高會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品口感、品質(zhì)下降。由圖5 可知，在酸乳貯藏的1～10 d 期間里，6 株菌株發(fā)酵的酸乳皆呈現(xiàn)出酸度升高的現(xiàn)象，編號(hào)276、266 的菌株酸度增加明顯；在貯存后期，編號(hào)276、266 的菌株滴定酸度趨于平緩，說明這兩株菌株沒有增強(qiáng)發(fā)酵乳的后酸化的能力。其余4 株的酸度迅速上升，可能是利用胞外多糖發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，使得酸度繼續(xù)升高。

圖5 冷藏期間滴定酸度的變化Fig.5 The changes in titration of acidity during the cold storage

2.3.5 冷藏期間活菌數(shù)變化的結(jié)果分析 酸奶中含有大量活菌是體現(xiàn)酸奶具有益生功能的指標(biāo)。由圖6可知，在冷藏期間，6 株菌株發(fā)酵的酸奶的活菌數(shù)均大于107CFU/mL，符合發(fā)酵劑的標(biāo)準(zhǔn)（>106CFU/mL）；其中菌株271 發(fā)酵的酸乳活菌數(shù)整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；其余5 種發(fā)酵乳的活菌數(shù)隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，總體上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在第10 d 到最大值，以編號(hào)276 的菌株最高為3.22×106CFU/mL，其次為編號(hào)218，為3.15×106CFU/mL。冷藏前期，乳酸菌仍在生長(zhǎng)代謝，導(dǎo)致活菌數(shù)增加；在貯藏過程中，新陳代謝產(chǎn)生的雜物積攢以及高濃度的酸都可能抑制活菌的生長(zhǎng)。

圖6 冷藏期間活菌數(shù)的變化Fig.6 The changes in viable counts during cold storage

2.3.6 發(fā)酵酸奶的產(chǎn)香能力的結(jié)果分析 乙醛和雙乙酰是構(gòu)成酸乳典型風(fēng)味的重要化合物，可以依據(jù)二者的含量判斷菌株的產(chǎn)香能力。此外，形成香味物質(zhì)的高峰一般在發(fā)酵結(jié)束后，需要12～24 h 才能完成其產(chǎn)香過程[33]，所以本實(shí)驗(yàn)樣品分別冷藏12、24、36 h時(shí)測(cè)定二者的含量。試驗(yàn)所得雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=0.0313x+0.0009，R2=0.9991，線性良好。二者測(cè)定結(jié)果見圖7 和圖8。

圖7 冷藏期間乙醛含量的變化Fig.7 The changes in acetaldehyde content during cold storage

圖8 冷藏期間雙乙酰含量的變化Fig.8 The changes in diacetyl content during cold storage

由圖7 可知，六株菌株發(fā)酵的酸奶在貯藏期間乙醛含量的變化總體呈上升趨勢(shì)，范疇在18～30 μg/mL 之間；其中編號(hào)276 的菌株發(fā)酵的酸奶中乙醛的含量最高，在27～29 μg/mL 之間；其次為編號(hào)231 菌株，在24～26 μg/mL 之間。編號(hào)271 的菌株發(fā)酵的酸奶在貯藏期間內(nèi)乙醛含量的變化很穩(wěn)定；并且產(chǎn)生的乙醛含量符合劉寧寧等[34]研究的產(chǎn)香最佳濃度：5～30 μg/mL。

由圖8 可知，六株菌株貯藏期間雙乙酰含量的變化范疇在1.58～3.73 μg/mL 之間；編號(hào)266、218的菌株發(fā)酵的酸奶在貯藏期間雙乙酰的含量先下降后上升，可能是由于產(chǎn)品中乳酸與胞外多糖的綜合作用所引起的；其余4 株的乙醛含量變化總體呈下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)殡p乙酰為散發(fā)性物質(zhì)，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)揮發(fā)掉一部分。有研究表明，產(chǎn)香味物質(zhì)能力強(qiáng)的菌株, 產(chǎn)雙乙酰的能力較弱，因此建議選擇雙乙酰產(chǎn)量較小的酸奶發(fā)酵菌株[35]。

因此，綜合比較乙醛和雙乙酰含量，產(chǎn)香能力最強(qiáng)的為編號(hào)為231 的菌株。

2.3.7 發(fā)酵酸奶的質(zhì)構(gòu)特性 質(zhì)構(gòu)性質(zhì)包括硬度、稠度、凝聚性、黏度指數(shù)等，對(duì)于酸奶品質(zhì)的評(píng)價(jià)有著極其重要的作用[36]。由圖9 可知，六株菌株發(fā)酵酸奶的測(cè)定質(zhì)構(gòu)結(jié)果分析，編號(hào)218 的菌株發(fā)酵酸奶的硬度為70.54 g，稠度為266.51 gsec，凝聚性為12.54 g，黏度指數(shù)為20.89 gsec，是六株菌株中質(zhì)構(gòu)測(cè)定結(jié)果是最好的；編號(hào)231 的菌株發(fā)酵的酸奶其次；編號(hào)271 的菌株發(fā)酵的酸奶的硬度為34.27 g，稠度為158.43 gsec，凝聚性為10.81 g，黏度指數(shù)為8.97 gsec，是測(cè)定質(zhì)構(gòu)結(jié)果是最低的。綜合六株菌株發(fā)酵的酸奶測(cè)定質(zhì)構(gòu)結(jié)果從高到低排序：218>231>285>276>266>271。

圖9 發(fā)酵完成后的酸奶質(zhì)構(gòu)Fig.9 The yogurt texture after fermentation

3 結(jié)論

菌株的生長(zhǎng)曲線表明，6 株菌株分別在14 h（218、276、266）、16 h（271、285、231）進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)穩(wěn)定期，其中編號(hào)218 的菌株生長(zhǎng)量最高。

耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6 株乳酸菌菌株的耐酸能力、耐膽鹽能力、耐滲透壓能力和疏水性各不相同，其中菌株276 對(duì)酸性環(huán)境的耐受性最好（P<0.05），菌株266、218、231 的耐膽鹽的能力最強(qiáng)，285 對(duì)高滲透壓的耐受性較強(qiáng)，菌株285 和218 的疏水性較高，且與十六烷的結(jié)合效果較好（P<0.05）。

發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果表明，6 株菌株所發(fā)酵酸奶均在6～8 h 內(nèi)凝固，冷藏期間，活菌數(shù)均保持在107CFU/mL以上，均符合發(fā)酵劑的標(biāo)準(zhǔn)，其中菌株276 的最高為3.22×106CFU/mL；菌株218 發(fā)酵制得的酸奶質(zhì)構(gòu)特性較好，持水力和酸化能力較其余菌株均最強(qiáng)，分別為60.98%和83 °T；菌株276、266 抗后酸化能力較好；菌株231 產(chǎn)香性能最優(yōu)，乙醛含量為24～26 μg/mL，雙乙酰含量為1.58～3.73 μg/mL，能夠明顯改善酸奶的風(fēng)味。

通過綜合比較6 株高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌特性及發(fā)酵性能，菌株218 為一株性能良好、具有良好穩(wěn)定性的菌株，可作為乳酸菌發(fā)酵劑且具有一定的應(yīng)用潛力。