響應面法優化川芎蛋白提取工藝及抗氧化活性研究

謝 丹，魯延杰，李佳璇，阮婧華，唐東昕，辛加敏，查 鑫，范東生

（1.貴州中醫藥大學藥學院，貴州貴陽 550025；2.貴州中醫藥大學第一附屬醫院，貴州貴陽 550001）

川芎（Ligusticum chuanxiongHort.）為傘形科植物川芎的干燥根莖，性味辛溫，歸肝、膽、心包經，具活血行氣、祛風止痛的功效[1]。首載于《神農本草經》，為著名的川產道地藥材。目前對川芎所含成分的研究，主要集中于小分子成分，對川芎大分子成分的研究甚少[2]。前期研究初步表明[3]，川芎中含有豐富的蛋白質，且具有較好的抗氧化能力。天然蛋白質因其來源豐富、可生物降解、環境友好性和高生物活性等特點，近年來成為天然抗氧化劑的研究熱點。

氧自由基對生物大分子、氨基酸、DNA、脂類和蛋白質等造成氧化損傷且與癌癥、動脈粥樣硬化、冠心病、糖尿病、神經功能障礙和免疫系統減弱等慢性疾病的發生有關[4]。經研究發現，植物源蛋白質具有抗凝血、抗腫瘤、抗氧化和抗真菌等生物活性，如石斛蛋白提取液、葛根蛋白、豌豆蛋白、黑豆蛋白等均具有較好的抗氧化活性[5?8]，對羥基自由基和DPPH 自由基有良好的清除效果，大豆蛋白具有較強的DPPH 自由基清除能力[9]。目前，川芎蛋白（LCP）抗氧化能力的相關研究未見報道，本研究旨在通過Box-Behnken響應面法確定其最佳提取條件；以DPPH 自由基清除、羥自由基清除和超氧陰離子自由基清除率為指標，以抗壞血酸為陽性對照進行分析，考察LCP 的抗氧化活性，同時為LCP 的開發提供可靠的數據資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

川芎 貴陽濟仁堂藥業有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、考馬斯亮藍R250、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate,SDS）、Maker、抗壞血酸標準品（VC） 北京索萊寶科技有限公司；DPPH 自由基清除能力試劑盒、羥自由基清除能力試劑盒、超氧陰離子清除能力試劑盒 蘇州格銳思生物科技有限公司。

PHS-3C pH 計 上海儀電科學儀器股份有限公司；TU-1810 紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；AL204 電子天平 美國梅特勒托利多公司；FD 冷凍干燥機 上海拓紛機械設備有限公司；Multiskan FC 酶標儀 賽默飛（上海）世爾儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白濃度測定 分別吸取5 mg/mL 的標準溶液 4、6、8、10、12、14、16、18、20 μL 于96 孔板中，并用蒸餾水補足至 20 μL。分別加入 200 μL BCA工作液（BCA 試劑與銅試液50:1）混勻，室溫靜置l0 min，于650 nm 下檢測不同濃度牛血清蛋白溶液的吸光值A，以蛋白質量濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程為：y=2.2706x+0.0402（R2=0.9993）。川芎提取物中LCP 濃度根據上述回歸方程求得。

1.2.2 單因素實驗 基于前期研究[10?11]，以LCP 得率為檢測指標，分別以pH、提取時間、料液比為影響因素以設計單因素實驗。

1.2.2.1 川芎藥材前處理 取干燥潔凈的川芎藥材，粉碎，過3 號篩（50 目）。稱取適量過篩后的川芎藥材粉末置于圓底燒瓶中，加4 倍量沸程為30～60 ℃石油醚水浴回流脫脂1 h，靜置后過濾，將川芎藥材粉末于通風櫥自然晾干，備用。

1.2.2.2 LCP 的提取 精密稱取川芎藥材粉末3 g，平行三份，加入Tris-HCl（68 mmol/L，0.5% SDS，5%甘油，10%β-巰基乙醇）溶液，置于4 ℃ 冰箱浸提1.5 h。5000 r/min 離心10 min，收集上清，加入3 倍量10%TCA-丙酮，置?20 ℃冰箱沉淀1.5 h，5000 r/min 離心10 min，收集沉淀，分別用丙酮及80%丙酮洗滌3 次，5000 r/min 離心10 min，收集沉淀，冷凍干燥即得LCP，按公式（1）計算得率。

式中：M1表示川芎蛋白凍干粉的質量，g；M2表示川芎藥材的質量，g。

1.2.2.3 不同pH 對LCP 得率的影響 按“1.2.2.2”項下操作，固定提取時間為1.5 h，料液比為1:15 g/mL，研究提取液pH（3、4、5、6、7、8、9）對LCP 得率的影響。

1.2.2.4 料液比對LCP 得率的影響 按“1.2.2.2”項下操作，固定提取時間為1.5 h，提取液pH 為6，研究料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）對LCP 得率的影響。

1.2.2.5 提取時間對LCP 得率的影響 按“1.2.2.2”項下操作，固定料液比為1:20 g/mL，提取液pH 為6，研究提取時間（0.5、1、1.5、2、2.5 h）對LCP 得率的影響。

1.2.3 LCP 提取條件的響應面試驗設計 為選擇最佳實驗條件，以提取時間 、B 料液比 、C 提取溶劑pH 為獨立變量，蛋白得率為響應變量，采用Design Export 8.0.6 的Box-Behnken 響應面方法（RSM）[12]優化過程。各組平行3 次，響應面試驗因素和水平見表1。

表1 響應面優化試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface optimization

1.2.4 SDS-PAGE 凝膠電泳 采用賀小燕等[13]試驗方法，以4.5%的濃縮膠和12.5%的分離凝膠進行SDS-PAGE 電泳，濃縮膠電壓80 V 電泳20 min，分離膠電泳120 V 電泳80 min，指示劑到達分離膠底部約1 cm 處停止電泳，考馬斯亮藍R250 染色，脫色液脫色至條帶清晰。

1.2.5 LCP 等電點測定 取10 支潔凈離心管，稱重。根據表2，分別加入不同體積LCP 溶液（50 mg/mL），再分別加入不同濃度、不同體積的乙酸溶液或去離子水，混合，測定pH。于4 ℃靜置1 h 后，5000 r/min離心15 min。完全除去上清液后，將帶有沉淀物的離心管稱重，通過減重法計算沉淀質量。由于蛋白質在pI 處沉淀最多，即可測定川芎的pI[14?15]。

表2 等電點測定Table 2 Isoelectric point measurement

1.2.6 LCP 溶解度的測定 將50 mg 樣品懸浮在10 mL 蒸餾水中，并使用1 mol/mL 的 HCl 或NaOH溶液將懸浮液的pH 調節至2～12。將懸浮液在22 ℃下連續攪拌1 h，并在5000 r/min 離心15 min，BCA 試劑盒測定上清液中蛋白質的量。溶解度按公式（2）計算。

式中：M1：懸浮液中加入的蛋白總量，mg，M2：離心后上清液蛋白的量，mg。

1.2.7 LCP 抗氧化能力的測定

1.2.7.1 羥自由基清除能力的測定 取不同濃度的LCP 溶液各0.125 mL，按試劑盒加入反應試劑一、試劑二、試劑三各0.125 mL 和0.5 mL 的蒸餾水，混勻，即為測定組。取等體積蒸餾水，依法制備空白組。取不同濃度的LCP 溶液液各0.125 mL，加入反應試劑一、試劑二各0.125 mL 和0.625 mL 的蒸餾水，混勻，即為對照組。于37 ℃反應20 min，轉移至玻璃比色皿中，蒸餾水調零，510 nm 讀取各組吸光度值A，平行測定3 次，以VC為陽性對照組，公式（3）計算清除率。

式中：A1：空白組吸光度值，A2：測定組吸光度值，A3：對照組吸光度值。

1.2.7.2 超氧陰離子自由基清除能力的測定 取不同濃度的LCP 溶液液各0.04 mL，按試劑盒加入反應試劑一0.26 mL、試劑二0.32 mL、試劑三0.04 mL、試劑四0.06 mL，混勻，即為測定組。取等體積蒸餾水，同法制備對照組。依上述方法，不加試劑三，加蒸餾水補足體積，混勻，即為空白組。于37 ℃反應10 min，轉移至玻璃比色皿中，蒸餾水調零，570 nm讀取各組吸光度值A，平行測定3 次，以VC為陽性對照組，如下公式（4）計算清除率。

式中：A1：對照組吸光度值，A2：測定組吸光度值，A3：空白組吸光度值。

1.2.7.3 DPPH 自由基清除能力的測定 分別吸取1.47 mg/mL 的 LCP 溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，加80%甲醇補足至1 mL，備用。取上述不同濃度的LCP 溶液0.4 mL，按試劑盒加入0.6 mL 工作液制，混勻，即得測定組。取0.4 mL 不同濃度的LCP 溶液與0.6 mL 80% 甲醇溶液為對照組。取0.4 mL 80% 甲醇溶液與0.6 mL 工作液，充分混勻，即得空白組。室溫避光靜置30 min 使之充分反應，無水乙醇調零，于517 nm 讀取吸光度值A，每個濃度的樣品重復測定3 次，取均值，以VC為陽性對照組，按公式（5）計算清除率[16]。

式中：A1：測定組吸光度值，A2：對照組吸光度值，A3：空白組吸光度值。

1.3 數據處理

實驗結果用平均值±標準差表示，采用 DesignExpert 8.0.6 進行響應面實驗數據優化，用SPSS 26.0軟件進行方差分析，以P<0.05 表示有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

實驗結果見圖1（a），LCP 得率先隨pH 的增大而增大。推測在一定范圍內，增大pH，因形成羧基離子和去質子胺，蛋白質分子中含有更高的負電荷排斥力，使蛋白質和水分子之間的相互作用增加[17?18]，而增加LCP 的溶解度；亦可能是因偏離LCP 的等電點，而增加LCP 的溶解度，最終使LCP 得率增大。pH6 時LCP 的得率為（2.23%±0.05%），而后LCP 得率隨pH 增大而減小。推測較高pH 水平下提取樣品時，因增加淀粉及其他雜質物質的溶出[15，19]，而稀釋LCP 的濃度。且在堿性條件下，酚類化合物易從藥材中釋放并與蛋白質共價結合而后快速氧化，導致提取物的顏色呈褐色[20]。經方差分析，P=0.002<0.01，表明pH 對LCP 得率的影響有極顯著性。綜合考慮，選取提取液pH5～7 進行響應面法優化試驗。

圖1 pH（a）、料液比（b）與時間（c）對LCP 得率的影響Fig.1 Influence of pH（a）, liquid（b）and time（c）on the extraction yield of LCP

從圖1（b）可發現，蛋白質得率因料液比的不同而差異明顯。料液比在1:5～1:15（g/mL）范圍內，蛋白質得率逐漸增加，這是由于隨著料液比的增大，溶液中分子擴散和碰撞速率加快，促進蛋白質分子的溶解。當料液比在1:15～1:25（g/mL）范圍內，得率逐漸下降，推測是由于料液比增大而致蛋白質分子分散性加大，不易酸沉獲得蛋白質，同時一些可溶性雜質溶解阻礙蛋白質溶出，且不利于獲得純度較好的蛋白質[21]。經方差分析，P=0.032<0.05，表明料液比對LCP 得率的影響具有顯著性。綜合考慮，選取料液比1:10～1:20（g/mL）進行響應面法優化試驗。

在特定條件下，蛋白質浸出需要一定時間達到平衡狀態；時間較短，分子擴散效率一定，蛋白質溶出量有限；延長浸提時間蛋白質得率呈下降趨勢，可能是由于蛋白質長時間在堿性環境中會發生輕微水解和變性，而且時間延長也會增加非蛋白物質浸出，影響蛋白質進一步沉淀和蛋白制品的純度[22]，且與同類豆類如豌豆、大豆和蠶豆相比，川芎富含不同的多糖，多糖與蛋白質的相互作用可能導致川芎中提取蛋白的價值降低[23?24]。經方差分析，P=0.023<0.05，表明提取時間對LCP 得率的影響具有顯著性。綜合考慮，選取提取時間1～2 h 進行響應面法優化試驗。

2.2 響應面分析LCP 提取工藝試驗結果

2.2.1 響應面法優化實驗設計及結果 每組樣品平行測定3 次，取平均值，并進行數據散點圖和統計分析。Design Expert 8.0.6 軟件進行響應面設計及結果分析。結果如表3 所示，得擬合方程為：y=2.28+0.18A+0.21B+0.19C?0.055AB+0.078AC+0.13BC?0.47A2?0.34B2?0.54C2。

表3 響應面試驗方案與結果Table 3 Response surface test scheme and results

2.2.2 方差分析結果 如表4 所示，模型F=40.23，Pr>F<0.01，說明此回歸模型是極顯著的。方程失擬項F=0.89，Pr>F>0.05，失擬項相對于純誤差影響不顯著，說明回歸模型與實測值擬合度較好，適用性高，可以使用該回歸方程代替試驗真實點分析試驗結果。各因素的影響大小為：提取時間<提取溶劑pH<料液比。通過F檢驗來判定，概率P（F>Fα）的值越小，則相應變量的顯著程度越高，對試驗指標的影響越大，PA、PB、PC均小于0.01，說明提取時間、料液比、提取溶劑pH 對LCP 得率的影響極顯著。R2=0.9810，R2Adj=0.9566，表示所建立的模型能夠很好地反映獨立變量和響應變量之間的關系。

表4 響應面試驗方差分析Table 4 Response surface test variance analysis

2.2.3 因素交互作用 利用Design Expert 8.0.6，根據回歸方程，生成等高線和響應面圖，并考察擬合響應曲面的形狀，分析pH、料液比、提取時間對LCP得率的影響。在響應面圖中，曲線變化越陡峭，說明交互影響越顯著。從圖2～圖4 可見，三個因素在所選范圍內存在極值，即等高線中最小橢圓的中心點。結果表明，BC 交互作用顯著，與F值結果一致。

圖2 提取時間與料液比相互作用的等高線圖與響應面圖Fig.2 Contour map and response surface map of the interaction between extraction time and liquid-solid ratio

圖3 提取時間與pH 相互作用的等高線圖與響應面圖Fig.3 Contour map and response surface map of the interaction between extraction time and pH

圖4 料液比與pH 相互作用的等高線圖與響應面圖Fig.4 Contour map and response surface map of the interaction between liquid-solid ratio and pH

2.2.4 驗證試驗 經軟件分析，該模型得到的最優條件為：料液比1:15.65（g/mL）、提取時間1.58 h、pH6.23。且預測LCP 得率理論值為2.35%。考慮到實際操作的可能性，將試驗條件修正為：料液比為1:15（g/mL）、提取時間1.5 h、pH6。在該修正條件下進行3 次提取試驗，平均蛋白質得率為（2.36%±0.13%），接近理論值。表明該數學模型可用于優化LCP 質提取過程。

2.3 SDS-PAGE 凝膠電泳

實驗結果如圖5 所示，Tris-HCl 所提LCP 的分子量分布在17～48 kDa 之間，較之月見草蛋白[21]（16～200 kDa）、榴蓮蛋白[25]（20～100 kDa）、向日葵蛋白[26]（300～350 kDa）、扁豆蛋白[19]（50～80 kDa），LCP 分子量較小。有研究提取不同蘑菇中的蛋白質并進行抗氧化研究，結果表明分子量較小的蛋白質抗氧化能力較強[27]。活性氧自由基可以誘導蛋白質[28]發生過氧化反應，因其易與蛋白質或蛋白質衍生化合物相關的反應可能發生在含有組氨酸的側鏈上，使蛋白質分子具有抗氧化活性。

圖5 LCP SDS-PAGE 凝膠電泳Fig.5 LCP SDS-PAGE gel electrophoresis

2.4 等電點測定

在等電pH 條件下，蛋白質分子上的電荷缺失降低了蛋白質分子之間的排斥力，從而促進了蛋白質與蛋白質之間的相互作用，蛋白質沉淀，溶解性降低，最終降低其他功能特性。試驗中制備的LCP 提取物在pH 為3.88 時沉淀最多，如圖6 所示，pH3.88 與其余pH 的蛋白沉淀量之間存在顯著差異（P<0.05），因此pH3.88 可能是LCP 的pI，這可以為分離和純化中選擇離子交換劑或凝膠色譜試劑及后續研究提供基礎[29]，因等電點附近加熱可以更好地控制蛋白質的溶解度，可通過加熱控制蛋白質變性和聚集的程度來增強蛋白質的功能。

圖6 LCP 等電點測定Fig.6 Measurement of LCP isoelectric point

2.5 溶解度

蛋白質溶解度是蛋白質變性和結構改變程度的指標，也是蛋白質功能的良好指標。pH 為8（圖7）時，LCP 的溶解度為96%。LCP 在pH 3～4 之間溶解度最小，當pH 偏離pI 時，蛋白溶解度增大。在pH8 下觀察到較高的溶解度，可能是由于高pH 條件下LCP 部分水解導致末端殘基增多[30]，這些殘基有利于蛋白質分子與水的親水性相互作用，如氫鍵和靜電相互作用[19]。

圖7 LCP 溶解度Fig.7 LCP solubility

2.6 LCP 體外抗氧化試驗

由圖8（a）可知，在0.3～1.5 mg/mL 范圍內，LCP 的羥自由基清除能力隨著濃度的增大而增強，當其濃度達到1.5 mg/mL 時，羥自由基清除率為60%。陽性對照組 VC的IC50值為0.72 mg/mL，計算得到LCP 清除羥自由基的IC50值為1.18 mg/mL，由此可知，雖清除效果弱于陽性對照組，LCP 具有一定的羥自由基清除能力。

由圖8（b）可知，LCP 對超氧陰離子自由基的清除能力在0.3～1.5 mg/mL 的濃度范圍內隨著濃度的增大而增強，呈現較為明顯的量效關系，當其濃度達到1.5 mg/mL 時，超氧陰離子自由基清除率達到78%，清除能力與1.5 mg/mL VC相當。通過計算可知LCP 清除超氧陰離子自由基的IC50值為 0.57 mg/mL，VC的IC50值0.26 mg/mL。由實驗結果可知，LCP具有良好的超氧陰離子清除能力，并呈劑量依賴性，活性隨蛋白質濃度的增加而增加，但不呈線性關系，推測是蛋白質不完全溶解所致。而超氧自由基能間接誘導脂質氧化而促進動脈粥樣硬化斑塊的發展和生長[31]。推測LCP 可作為一種潛在的預防心血管疾病的天然抗氧化劑進一步研究。

由圖8（c）可知，隨著濃度的增加，LCP 的DPPH自由基清除率逐漸增大，二者呈正相關性，當濃度為1.5 mg/mL 時，DPPH 自由基清除率達到最大值58.3%。但與陽性對照組VC（IC50值為0.16 mg/mL）相比，LCP（IC50值為 1.31 mg/mL）清除羥自由基的能力較弱，推測LCP 可能含有較高疏水氨基酸所致[32?33]。

圖8 LCP 對羥自由基（a）、超氧陰離子自由基（b）、DPPH 自由基（c）的清除率Fig.8 Scavenging rates of（a）hydroxyl radical,（b）superoxide anion radical and（c）DPPH radical by LCP

LCP 顯示出良好的抗氧化活性，可能是由于LCP 中含的氨基酸部分水解，能夠向自由基提供質子，從而顯示出抗氧化能力[30]；在適當的pH 條件下提取的LCP，屬小分子量的蛋白質，亦可能是增強抗氧化活性的一個原因[34]。

3 結論

蛋白來源豐富，種類繁多，在食品及醫療行業的應用廣泛。天然蛋白質是動植物體內的重要大分子物質，具有維持細胞表面或細胞內識別、細胞粘附、蛋白質的加工和轉移等生物活性功能和生物活性[35]。本研究首次從中藥川芎中分離蛋白質，單因素結合響應面法優化LCP 提取工藝結果表明，在pH6、料液比1:15、提取1.5 h 條件下提取LCP，得率為（2.36%±0.13%），Tris-HCl 法可以用于LCP 提取。同時對其理化特性進行了研究，SDS-PAGE 電泳表明，LCP 的分子量分布在17～48 kDa 之間。LCP 的pI 約為pH3.88；pH 為8 時，LCP 的溶解度為96%。通過探索的LCP 的分子量、等電點、溶解度等功能特性，可為其進一步研究提供一定的研究基礎，為其在食品工業等領域的應用提供理論依據。

機體細胞的癌變，衰老及其它疾病都與機體內自由基的過量產生有直接的密切聯系[36]。本研究結果顯示，LCP 具有良好的抗氧化活性，羥自由基清除能力IC50為1.18 mg/mL、超氧陰離子自由基清除能力IC50為0.57 mg/mL、1，1-二苯基-2-苦基肼基（DPPH）自由基清除能力IC50為1.31 mg/mL。且屬于天然產物，具有比較高的安全性，可作為一種潛在的天然抗氧化劑源。本研究為川芎合理開發和應用提供了一些基礎資料，也為開發植物源的天然抗氧劑奠定了良好的基礎。