單叢茶HS-SPME/GC-MS 指紋圖譜的構建

盧丹敏，唐俊偉，張天天，歐陽建，葉漢鐘，林鎮填，劉仲華,*，黃建安,*

（1.湖南農業大學茶學教育部重點實驗室，湖南長沙 410128；2.國家植物功能成分工程技術研究中心，湖南長沙 410128；3.植物功能成分利用省部共建協同創新中心，湖南長沙 410128；4.宋凰生態茶業有限公司，廣東潮州 521000；5.潮州市天羽茶業有限公司，廣東潮州 521000）

單叢茶（鳳凰單叢、嶺頭單叢）是一種傳統名茶，產自廣東潮州，以濃郁多變的花果蜜香和濃醇的滋味品質著稱。它是用2～4 葉、芽葉完整的對夾葉，經過采摘、曬青、攤涼、碰青、殺青、揉捻、烘焙等工藝加工而成[1?2]。單叢茶葉因其品種和工藝參數不同，其品質特點也不盡相同。根據香型可分為黃枝香、芝蘭香、玉蘭香、蜜蘭香、杏仁香、姜花香、肉桂香、桂花香、夜來香、茉莉香、柚花香、橙花香、楊梅香等十幾種產品[3?4]。

目前有多種方式可對茶葉中的揮發性物質進行提取，包括同時蒸餾萃取法[5]、超臨界流體萃取法[6]、頂空固相微萃取法[5,7]和溶劑輔助風味蒸發法[8?9]等。由于頂空固相微萃取法具有需樣量較小、處理時間較短、能收集樣品中絕大部分揮發性成分等優點[10?11]，現已成為茶葉揮發性提取的常用方法。目前，指紋圖譜借鑒了法醫學的概念，在重視個體差異性的基礎上，強調重視群體的共性，以期綜合反映各物質成分含量的真實性、穩定性和均一性[12]。現階段，茶葉指紋圖譜主要利用各種色譜、光譜、波譜等手段構建，包括氣相色譜法[13]、紫外光譜法[14]、紅外光譜法[15?16]、核磁共振法[17?18]、高效液相色譜法（HPLC）[12,19?21]和氣質聯用法[22?23]等。在揮發性物質方面，與氣相指紋圖譜相比，氣質聯用技術指紋圖譜具有靈敏度更高、準確度更高和重現性更好等優點，近年來也被廣泛應用于茶葉鑒定和質量控制中。WU 等[22]利用GC-MS 指紋圖譜，結合主成分、聚類分析方法和指紋相似度分析，成功區分和識別來自云南省兩個茶山的普洱茶。LONG 等[23]通過判別分析，可以將樣品分為7 個不同的組，建立了七個不同等級的信陽毛尖香氣成分的GC-MS 指紋圖譜，為信陽毛尖等級判別提供了一種新方法。

目前，在單叢茶揮發性物質指紋圖譜方面還未有相關研究。另一方面，單叢茶鑒別的方法仍依賴于評茶師的經驗及其個人感受，依國標[24]或行標[3?4,25]進行評判，這種方法受個人喜好及身體狀況的影響，一定程度上導致市面上的單叢茶魚龍混雜。因此，本文對單叢茶進行頂空固相微萃取的條件優化研究，并對各個樣品進行GC-MS 檢測和分析。嘗試為單叢的揮發性物質檢測提供操作方便、準確率高的萃取方法；建立單叢茶揮發性物質指紋圖譜以及建立基于指紋圖譜數據的地區判別函數，為單叢茶的產地判別及真偽鑒別等提供科學的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

22 個單叢茶樣（D1～D22）均為2019 年茶葉出自潮州當地饒平和鳳凰兩個地區，D1～D8 為饒平地區茶葉，D9～D22 為鳳凰茶區茶葉。樣品收集后于陰涼干燥處保存；氯化鈉 國藥集團化學試劑有限公司；癸酸乙酯 美國 Sigma-Aldrich 試劑公司；C8～C40 偶數正構烷烴標準品 美國 o2si 公司。

樣品瓶15 mL 上海安譜科學儀器有限公司；EPFO-984TA7CHSEUA 數顯型磁力加熱攪拌器美國 Talboys 公司；7890B-5977A 氣相色譜質譜聯用儀 美國 Agilent 公司；固相微萃取手動進樣手柄、PDMS/DVB 固相微萃取頭65 μm 美國Supelco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 采用五點取樣法對茶樣進行取樣、合并和磨碎，而后在每個茶樣中各取3.0 g 磨碎樣進行混合作為條件優化試驗樣本QC，置于干燥器中常溫保存。

1.2.2 頂空固相微萃取條件 采用單因素逐步優化的方法對鳳凰單叢茶揮發性成分頂空固相微萃取條件進行優化。在萃取溫度為80 ℃和茶水比0.75 :5 g/mL 的條件下，分別萃取30、40、50 和60 min以此考察萃取時間對萃取效果的影響；在萃取時間為40 min 和茶水比0.75 : 5 g/mL 的條件下，分別在60、80、90 和100 ℃的電子磁力加熱攪拌器上萃取，以此考察萃取溫度對萃取效果的影響；在萃取時間40 min 和萃取溫度80 ℃的條件下，考察茶水比0.5:5、0.75:5、1:5、1.25:5 g/mL 對萃取效果的影響，通過比較因素中各水平的總峰面積和峰個數衡量萃取效果，最終確定最優萃取參數。

1.2.3 萃取過程 在放有QC 樣本和磁力轉子的15 mL樣品瓶中，迅速加入帶有10 μL 癸酸乙酯內標（8.64 mg/L）和0.5 g 氯化鈉的5 mL 沸水，用帶有聚四氟乙烯隔墊的瓶蓋擰緊，搖勻，然后置于一定溫度和轉速（600 r/min）的磁力攪拌加熱器上，攪拌加熱。5 min 平衡后將老化過的萃取纖維頭推出，纖維頭距離液面0.5 cm，進行揮發性物質萃取。一定時間后收回纖維頭，迅速插入進樣口中進行解析，每個條件重復3 次。

1.2.4 GC/MS 分析條件 參考李永迪、肖凌等[7?8]分析茶葉揮發性成分的方法，適當調整后的條件如下：

GC 條件：色譜柱HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣（純度>99.999%），進樣口溫度250 ℃，柱流速1 mL/min，進樣方式為脈沖不分流；升溫程序：40 ℃（6 ℃/min 上升）→80 ℃（1.5 ℃/min上升）→100 ℃（6 ℃/min 上升，保持1 min）→130 ℃（6 ℃/min 上升）→150 ℃（3 ℃/min 上升）→165 ℃（15 ℃/min 上升）→230 ℃（保持2 min），溶劑延遲3 min。所有樣品重復3 次

MS 條件：離子源EI，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，EI 源能量70 eV，四級桿溫度150 ℃，掃描方式為全掃描模式（scan）：掃描范圍35～450 u。譜庫: NIST 17。

1.3 數據處理

對GC-MS 檢測得到的數據進行解譜，與NIST17標準譜庫比對，篩選出匹配度大于75%的物質；為了得到揮發性化合物的保留指數RI 值，在相同條件下檢測正構烷烴（C8～C40）。保留指數計算公式如下：

式中：RI 為揮發性化合物的保留指數；n 為該化合物前一碳標的原子數；RTx 為該化合物的保留時間；RTn 為該化合物前一碳標的保留時間；RTn+1 為該化合物后一碳標的保留時間。計算后保留指數RI，查找和比對相關質譜資料中對應物質的保留指數，最終確定物質成分。

以內標峰癸酸乙酯的峰面積和保留時間作為參照，計算各共有峰的相對峰面積和相對保留時間。

本研究應用Excel 和IBM SPSS Statistics 23.0進行數據處理、相似度分析和判別分析，并由Origin 2018 軟件繪圖完成。

2 結果與分析

2.1 萃取條件優化

2.1.1 萃取時間的選擇 在同一萃取溫度和茶水比的條件下，分別萃取30、40、50 和60 min，結果如圖1（A）所示。增加頂空固相微萃取的時間，單叢茶揮發性成分的總峰面積和峰個數呈先增加后減少的趨勢。萃取時間30 min 的總峰面積顯著（P<0.05）少于萃取40 min 的總峰面積，而萃取40 min 的總峰面積顯著（P<0.05）少于50 min，萃取60 min 的總峰面積和40、50 min 無顯著性差異（P<0.05）。當萃取時間從30 min 增加至40～60 min，整個過程峰個數均無顯著差異（P<0.05）。這說明萃取在50 min 時，纖維頭吸附與解吸基本達到平衡。而隨著萃取時間的延長，更多大分子物質著附在纖維頭上，這使得纖維頭上小分子物質的種類和濃度會有所降低[26]。故綜合單叢揮發性物質含量和種類的檢測結果，選擇萃取時間為50 min 進行萃取比較合適。

圖1 萃取時間、溫度及茶水比對單叢茶揮發性物質萃取的影響Fig.1 Effects of extraction time, temperature and tea-water ratio on volatile components extraction of Dancong tea

2.1.2 萃取溫度的選擇 在同一萃取時間和茶水比的條件下，分別在60、80、90 和100 ℃的電子磁力加熱攪拌器上萃取，結果如圖1（B）所示。在萃取溫度為60～100 ℃的范圍內，隨著萃取溫度的上升，單叢揮發性成分的總峰面積呈先增加后減少的趨勢，而峰種類在上升到一定數量后趨于穩定。從60 ℃升至80 ℃或者從80 ℃升至90 ℃時，總峰面積增加但差異不顯著（P<0.05），峰個數顯著（P<0.05）增加。90 ℃的總峰面積高于100 ℃，而90 ℃的峰個數少于100 ℃，但這兩個萃取溫度之間的差異不顯著（P<0.05）。萃取溫度能直接影響纖維頭對揮發性物質的吸附。溫度過低則會加長纖維頭吸附解吸達到平衡的時間，溫度過高則會使樣品瓶中分子熱運動加快，從而減少小分子物質的吸附濃度，且溫度過高會加快揮發性物質的氧化[27]。故綜合單叢揮發性物質含量和種類的檢測結果，選擇萃取溫度為90 ℃進行萃取比較合適。

2.1.3 茶水比的選擇 在15 mL 樣品瓶中分別加入0.5、0.75、1 和1.25 g 的QC 樣品，加入5 mL 沸水及轉子，在同一萃取溫度和時間的條件下萃取，結果如圖1（C）所示。隨著茶水比的增加，單叢揮發性成分的總峰面積和峰個數呈先增加后減少的趨勢。在茶水比為0.75:5 g/mL 時，總峰面積和峰個數達到最高，它與茶水比為0.5:5 g/mL 的結果無顯著性差異（P<0.05）；茶水比為0.75:5 g/mL 的峰面積顯著（P<0.05）高于茶水比為1:5 g/mL，峰個數二者差異不顯著（P<0.05）。茶水比為1:5 g/mL 與茶水比為1.25:5 g/mL 樣品量的峰面積和峰個數結果無顯著性差異（P<0.05）。合適的樣品量能使纖維頭在樣品瓶中有最大的吸附量，若磨碎樣品量過少則多余的水會使液面上方的頂空體積減小，而量過多，則會有一部分沒有被水浸沒，覆蓋在充分浸濕的樣品上，影響揮發性物質的揮發。故選擇樣品量為0.75 g，加入5 mL 沸水進行萃取比較合適。

按照上述萃取條件優化的結果，對各個單叢樣品進行GC-MS 分析，共檢測出73 個揮發性化合物，主要包括醇類、酮類、醛類、酯類、酚類、碳氫化合物、含氮化合物、雜氧化合物等八類化合物。

2.2 共有峰確認及相對峰面積

按照優化后的HS-SPME/GC-MS 條件對22 個單叢茶揮發性成分進行檢測，鑒定各樣本色譜圖中的揮發性物質后進行比對篩選。最終篩選出20 個具有相同保留時間且鑒定為同一物質的色譜峰作為共有峰（x1～x20）。按保留時間先后順序依次為1-辛烯-3-醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮、（E,E）-2,4-庚二烯醛、α-松油烯、3-異丙基甲苯、氧化芳樟醇I、芳樟醇、脫氫芳樟醇、α-松油醇、水楊酸甲酯、臧紅花醛、癸醛、β-環檸檬醛、香葉醇、吲哚、α-紫羅酮、香葉基丙酮、β-紫羅酮、雪松醇、鄰苯二甲酸二異丁酯，如表1 所示。這些物質大多都具有明顯的花果香特性，區別于其他茶類主要揮發性物質[28]，構成了單叢茶香氣的基本特點。

各共有峰的相對保留時間偏差較小，表明它們在GC-MS 色譜圖中具有相對穩定性（見表1）；通過各共有峰的相對峰面積制作揮發性物質熱度圖（圖2），通過該圖，可以更直觀的看出各共有的揮發性成分間的差異以及樣品間的差異。總體來說，峰面積較大的揮發性共有物質為脫氫芳樟醇、芳樟醇、氧化芳樟醇I、吲哚和香葉醇；1-辛烯-3-醇、α-紫羅酮、α-松油烯、鄰苯二甲酸二異丁酯的峰面積則較小。

圖2 共有揮發性物質含量在各單叢樣品間的熱度圖Fig.2 Heat map of the common volatile substances across each sampleof Dancong tea

各樣本非共有峰面積占比在36.7%～58.6%之間，平均占比為45.6%，占比較大，其原因在于單叢香型多變，各樣本揮發性成分種類多且雜，在某些特殊香型單叢中無法檢測到一些峰面積較大的物質，這也是造成共有物質種類較少的原因。

2.3 相似度分析

以模擬的數字化指紋圖譜（表1）做為參照，采用夾角余弦法和皮爾遜相關系數法對各色譜圖進行相似度分析，結果如表2 所示。其中有D16 和D21 為姜花香、桂花香品種茶葉，其揮發性成分含量與多數樣品差異明顯。茶葉揮發性物質組成復雜，不同香型的單叢茶具有相同的主成分，但是各成分比例卻不盡相同，造成了千變萬化的鳳凰單叢香型。相比蜜蘭香、黃枝香等單叢茶，這兩種香型的單叢茶為小產量品種茶。若除去這兩個樣本，其余20 個圖譜的夾角余弦法結果在0.917～0.995 之間，皮爾遜相關系數法的結果在0.905～0.996 之間，兩種算法所得相似度結果較為一致，均大于0.9，符合指紋圖譜的要求。據此建立了單叢茶揮發性物質的GC-MS 指紋圖譜（圖3）。

圖3 單叢茶揮發性物質GC-MS 指紋圖譜Fig.3 GC-MS fingerprints of volatile components for Dancong tea

表1 單叢揮發性共有物質數字化指紋圖譜Table 1 Digitalvolatile common componentsfingerprint chromatogram of Dancong tea

表2 單叢茶揮發性物質指紋圖譜的相似度分析Table 2 Similarity analysis of the volatile substancesfingerprint chromatogram for Dancong tea

2.4 判別分析

將單叢茶揮發性成分中的20 個共有峰相對峰面積作為特征，將單叢總樣本按3:1 的比例隨機分為分析組和驗證組。其中分析組17 個樣本，用于構建地區判別模型；驗證組5 個樣本，用于對所建模型的檢驗（表3）。以17 個樣本的20 個共有峰的相對峰面積為原始數據，建立典型判別函數如下：

F=0.556x1?15.633x2+6.298x3?10.964x4+10.763 x5+15.865x6?1.169x7+3.269x8?4.015x9?7.864x10+10.653x11?2.477x12?7.188x13+9.845x14?7.323x18

由于變量x15、x16、x17、x19和x20與判別函數之間的相關性較大，因而不納入到該典型判別式函數，該函數F 的特征值為100.562，貢獻率為100%。

用自身驗證法、外源驗證法和交互驗證法對該典型函數判別模型的準確性進行檢驗（表3）。自身驗證法和交叉驗證法的準確率均達100%。將5 個驗證組樣本代入判別函數F中進行檢驗，有1 個饒平地區茶樣被錯判，鳳凰地區茶樣判對率100%，外部驗證正確分類率為80%，表明應用該判別模型將兩個地區茶葉分開來是可行的。

表3 不同地區單叢茶判別驗證結果Table 3 Results obtained for Dancong tea classification in different regions by discrimination analysis

3 結論

據報道HS-SPME 提取揮發性物質，主要受到樣品中揮發性物質濃度、萃取時間和溫度等因素的影響，這三者均通過影響分子物質的揮發及在萃取纖維頭的著附情況影響萃取結果[10?11]。本文采用單因素研究方法對這三方面單叢茶頂空固相微萃取的條件進行優化研究，最終發現采用萃取時間為50 min、萃取溫度為90 ℃、茶水比為0.75:5 g/mL 的條件進行萃取，單叢茶揮發性物質含量和種類萃取效果最好。利用頂空固相微萃取結合GC-MS 方法檢測單叢茶揮發性物質，操作方便、靈敏度高，分析速度快、準確率高，具有一定的可行性和優越性，為單叢茶的揮發性物質檢測方法提供了高效、節能的分析方法。此外，萃取效果還受萃取纖維頭材質的影響，不同的材料吸附各種香氣化合物的能力均不同。鹽的加入可以起到鹽析作用，不同的鹽濃度影響揮發性物質的離子強度從而影響萃取效果。另外解析時間、溫度及進樣模式均能影響檢測結果從而影響萃取效果的分析[29]。因此還可以從以上幾方面進行研究頂空固相微萃取條件，使方法更系統更科學。

單叢茶（鳳凰單叢、嶺頭單叢）主要產自于廣東潮州潮安區和饒平縣內特定生長區域，依賴得天獨厚的地理環境和自然條件，經過特殊復雜的工藝加工而成，成為了具有區域特色的國家地理標志保護產品。采用GC-MS 檢測分析技術從22 個單叢樣品中確定了20 個共有峰，分別為1-辛烯-3-醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮、（E,E）-2,4-庚二烯醛、α-松油烯、3-異丙基甲苯、氧化芳樟醇I、芳樟醇、脫氫芳樟醇、α-松油醇、水楊酸甲酯、臧紅花醛、癸醛、β-環檸檬醛、香葉醇、吲哚、α-紫羅酮、香葉基丙酮、β-紫羅酮、雪松醇、鄰苯二甲酸二異丁酯。在潮州地區，傳統的茶葉生產者單株選育，單株采制，在歷代沿習下，孕育了數量繁多、類型豐富的茶樹種質資源，加上當地氣候溫和，雨量充沛的自然條件使得單叢茶揮發性成分種類比例復雜，香型多變[30?31]。因此建立單叢茶揮發性物質指紋圖譜，發現其相似度可達0.9 以上，該結果可為單叢茶的共有物質成分鑒別研究提供理論支持。目前關于單叢揮發性成分指紋圖譜的研究較少，本研究由于樣品限制僅建立潮州地區單叢茶總指紋圖譜，此外，還可從各類香型、各種季節等方面對單叢揮發性指紋圖譜進一步展開研究。本實驗基于指紋圖譜共有峰數據對潮州兩個地區的單叢茶進行判別分析，其自身驗證法和交叉驗證法的正確率均為100%，外部驗證正確分類率為80%。潮安和饒平兩個地區茶葉品質差異主要與茶葉品種、土質狀況、海拔地形以及天氣條件密切相關。潮安區茶葉主要產自鳳凰鎮鳳凰山，以生產鳳凰單叢為主，其品種香型多變，品質風格獨特[31]；饒平縣茶葉主要產自浮濱鎮嶺頭村雙髻娘山，以生產嶺頭單叢為主，其品種為白葉品種，香型以蜜蘭香為主[32]。該結果可為單叢茶地區鑒別提供科學參考。