HPLC 法測(cè)定乳制品中二氫槲皮素含量

冉 丹，吳海智，盧 超，李 萌，徐思敏，羅蘇蘇

（湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南長(zhǎng)沙 410007）

二氫槲皮素別名花旗松素，屬于二氫黃酮類(lèi)化合物[1?2]，由其結(jié)構(gòu)式可知（見(jiàn)圖1），二氫槲皮素含有鄰位二羥基獨(dú)特結(jié)構(gòu)，較一般的生物類(lèi)黃酮化合物更具有優(yōu)越的抗氧化性能[3?4]，被廣泛用作生物活性劑[5?7]，也是一種安全的新型食品添加劑[8?9]。目前二氫槲皮素主要來(lái)源于落葉松[10?11]、水紅花[12?13]、柘木[14]、野生刺葡萄[15]等50 多種植物。有研究報(bào)道，俄羅斯及歐盟多國(guó)已將二氫槲皮素列入食品添加劑類(lèi)別，主要在奶類(lèi)制品、動(dòng)植物油、肉類(lèi)制品保存保鮮中有較為廣泛的應(yīng)用，還開(kāi)發(fā)出相應(yīng)的功能型飲料和其他食品[16?18]。作為一種安全的強(qiáng)效抗氧化添加劑，二氫槲皮素可有效延長(zhǎng)食品保存周期。

圖1 二氫槲皮素分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of dihydroquercetin

2018 年3 月21 日，歐盟委員會(huì)發(fā)布（EU）2017/461 號(hào)法例，根據(jù)歐洲議會(huì)和理事會(huì)（EC）第2015/2283 號(hào)法規(guī)，授權(quán)二氫槲皮素提取物作為新型食品成分投放于歐盟市場(chǎng)，并修訂歐盟委員會(huì)實(shí)施細(xì)則（EU）2017/2470，該法規(guī)定了二氫槲皮素用于食品中的限量和標(biāo)簽要求[19]，規(guī)定奶粉最大使用量為0.052 g/kg，原味酸奶/水果酸奶最大使用量為0.020 g/kg，脫脂奶最大使用量0.005 g/kg，奶油最大使用量為0.070 g/kg，高加索發(fā)酵乳最大使用量為0.008 g/kg，牛油最大使用量為0.164 g/kg，起司最大使用量為0.090 g/kg，巧克力糖果最大使用量為0.070 g/kg，無(wú)酒精飲料最大使用量為0.020 g/kg。二氫槲皮素作為一種二氫黃酮類(lèi)化合物，食用過(guò)量可能會(huì)產(chǎn)生毒副作用[20]，該法例規(guī)定了一般人群使用劑量不超過(guò)100 mg/d。

目前我國(guó)針對(duì)二氫槲皮素尚無(wú)添加限量規(guī)定，也沒(méi)有相關(guān)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。有關(guān)二氫槲皮素檢測(cè)研究的報(bào)道不多，主要為中藥材及原料提取物含量的研究[21?24]，如巴寅穎等[21]采用高效液相色譜法測(cè)定芪紅水煎劑中花旗松素和槲皮素的含量，張衛(wèi)鵬等[22]對(duì)長(zhǎng)白落葉松中花旗松素進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定及含量研究，牛生洋等[15]對(duì)中國(guó)野生刺葡萄不同品種不同部位的花旗松素進(jìn)行了研究。本文旨在以乳粉及乳制品為樣品，開(kāi)發(fā)建立二氫槲皮素的檢測(cè)分析方法，為食品中二氫槲皮素的檢測(cè)研究及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg 二氫槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品，加入適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移定容至100 mL 容量瓶，配制成100 μg/mL 二氫槲皮素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別準(zhǔn)確移取0.5、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，配得濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL 系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.1 材料與儀器

二氫槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（CAS 480-18-2，純度99.4 %）

德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司；冰乙酸、磷酸 分析純國(guó)藥集團(tuán)；乙腈、甲醇 色譜純 國(guó)藥集團(tuán)；固相萃取小柱ProElut PLS（200 mg/6 mL） 迪馬公司；奶粉、牛奶、酸奶、奶酪等 購(gòu)自市場(chǎng)。

Agilent 1260 高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司；Milli-Q 超純水儀 德國(guó)默克密理博公司；M37610-33 渦旋振蕩器 賽默飛世爾公司；SHZW 恒溫水浴鍋 常州萬(wàn)順儀器制造有限公司；US-30D 超聲波振蕩儀 北京中科儀公司；TD-6 高速離心機(jī) 萬(wàn)和儀器制造公司；HPD-25 固相萃取裝置色譜科公司；MTN-2800W 氮吹濃縮儀 天津奧特賽恩斯儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試樣制備及測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg 二氫槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品，加入適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移定容至100 mL容量瓶，配制成100 μg/mL 二氫槲皮素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別準(zhǔn)確移取0.5、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，配得濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL 系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

奶粉等固體試樣稱(chēng)取5.0 g（精確至0.01 g），加入5 mL 熱水混勻溶解；牛奶、酸奶、乳飲料等液體試樣稱(chēng)取5.0 g（精確至0.01 g）。加入乙腈15 mL，渦旋混勻后超聲提取15 min，4000 r/min 離心3 min 后轉(zhuǎn)移上清液，再加入20 mL 乙腈/水（3/1）重復(fù)提取1 次，合并上清液，80 ℃水浴減壓濃縮至5 mL 以下，溫?zé)崴倭慷啻无D(zhuǎn)移至15 mL 比色管待凈化。PLS 柱經(jīng)活化后，待凈化液全部上樣過(guò)柱凈化，依次加入3 mL 水、3 mL 10%甲醇水溶液淋洗，擠壓干，加入3 mL 甲醇洗脫，收集洗脫液，氮吹濃縮，甲醇定容至1 mL，過(guò)PTFE 微孔濾膜（0.45 μm），作為供試液待測(cè)。

奶油、奶酪樣品稱(chēng)取5.0 g（精確至0.001 g），加入5 mL 熱水渦旋至稠狀，加入5 mL 正己烷渦旋混勻，加入15 mL 乙腈，合并乙腈層提取液，按以上步驟濃縮凈化。

1.2.2 液相色譜參考條件 色譜柱：AQ-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；流動(dòng)相：甲醇：1%冰乙酸=40：60；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)：290 nm；洗脫時(shí)間：14 min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)與 Agilent 1260 儀器配套的 Agilent OpenLAB 色譜處理軟件完成數(shù)據(jù)采集分析，采用Excel 軟件進(jìn)行圖形繪制及處理，結(jié)果統(tǒng)計(jì)為3 次平行測(cè)定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇

因乳粉及乳制品基質(zhì)復(fù)雜，含有大量蛋白質(zhì)及脂類(lèi)，對(duì)后續(xù)提取等操作步驟影響極大，須去除干擾，才能準(zhǔn)確檢測(cè)分析二氫槲皮素。考慮二氫槲皮素具有易溶于乙醇、甲醇、乙酸、熱水等的特點(diǎn)[2]，蛋白質(zhì)在酸性環(huán)境中等電點(diǎn)附近可以產(chǎn)生沉淀，高比例有機(jī)相可以沉淀蛋白，此外亞鐵氰化鉀和乙酸鋅也可以沉淀蛋白。結(jié)合以上經(jīng)驗(yàn)，本試驗(yàn)對(duì)7 種提取方式進(jìn)行考察研究，分別為1%三氯乙酸、3%乙酸、乙腈/水（3/1）、甲醇/水（3/1）、乙腈/水（3/1，含1%甲酸）、甲醇/水（3/1，含1%甲酸）、水提取后加入0.5 mL 沉淀試劑（150 mg/mL 亞鐵氫化鉀和300 mg/mL 乙酸鋅）。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，三氟乙酸、乙酸、水提取加沉淀劑三種方式二氫槲皮素回收率較低，乙腈/水、甲醇/水沉淀效果好、回收率高。乙腈/水、甲醇/水提取液中加入1%的甲酸，提取溶劑酸環(huán)境對(duì)樣品中二氫槲皮素的提取效率基本沒(méi)有影響。考慮到乙腈/水提取凈化效果優(yōu)于甲醇/水，更有利于后續(xù)操作，最終選擇乙腈/水（3/1）作為提取試劑，不同提取方式試驗(yàn)結(jié)果如表1。

表1 不同提取方式蛋白沉淀現(xiàn)象及回收率比較Table 1 Comparison of purification effect and recovery rate of protein extracted by different methods

2.2 凈化柱選擇

由二氫槲皮素分子結(jié)構(gòu)式可知，其苯環(huán)上多為酚羥基，推斷呈弱極性，故嘗試選取硅膠和二乙烯苯/N-乙烯基吡咯烷酮兩種類(lèi)型填料固相萃取小柱進(jìn)行試驗(yàn)，包括ProElut C18（500 mg/6 mL）、ProElut C18-U（500 mg/6 mL）、ProElut PLS（200 mg/6 mL）和Oasis HLB（500 mg/6 mL）四種凈化小柱（見(jiàn)表2）。不同固相萃取小柱經(jīng)活化后，對(duì)同一加標(biāo)樣品進(jìn)行上樣凈化，二氫槲皮素上樣量為100 μg，依次使用3 mL水和10%甲醇淋洗，最終3 mL 甲醇洗脫，以考察不同固相萃取小柱對(duì)二氫槲皮素的凈化效果及回收率。試驗(yàn)結(jié)果表明，在相同條件下，所有小柱均能起到較好的凈化作用，ProElut C18-U、PLS 回收率較高分別為94.6%和98.9%，ProElut C18在淋洗階段二氫槲皮素有較大損失，回收率為82.1%，Oasis HLB推測(cè)由于柱容量較大，此洗脫條件洗脫不完全，回收率僅72.4%。分析認(rèn)為，由于ProElut C18硅膠鍵合C18后進(jìn)行了封端處理，其硅膠基質(zhì)表面殘余的硅羥基較ProElut C18-U 少，削弱了與苯環(huán)結(jié)構(gòu)上羥基的極性相互作用，使得二氫槲皮素在淋洗階段被洗脫，而PLS 柱含有親水性的乙烯基吡咯烷酮和疏水性的二乙烯基苯共聚物，對(duì)極性、非極性化合物均有較均衡的吸附作用[25]，所以回收率較好。考慮保留性能及柱容量等因素，本研究后續(xù)選擇ProElut PLS（200 mg/6 mL）作為凈化小柱。

表2 不同SPE 柱回收率比較Table 2 Comparison of recovery rates of different SPE columns

2.3 流動(dòng)相及波長(zhǎng)的選擇

根據(jù)查閱的文獻(xiàn)資料[21?22]，目前分析二氫槲皮素流動(dòng)相主要為含乙酸或磷酸的甲醇水溶液。為探索流動(dòng)相的影響因素，優(yōu)化色譜條件，本次研究擬對(duì)不同流動(dòng)相進(jìn)行比較，探索流動(dòng)相對(duì)二氫槲皮素的保留時(shí)間及峰形的影響（見(jiàn)表3）。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)有機(jī)相甲醇比例為40%時(shí)，二氫槲皮素可以和干擾峰較好分離，出峰時(shí)間在10 min 左右，較為適宜。在流動(dòng)相中添加乙酸、磷酸或三氟乙酸，對(duì)二氫槲皮素峰形均可以起到一定的改善作用，柱效更高。乙酸比例越高，二氫槲皮素出峰越快、峰形越好，綜合考慮保留時(shí)間、峰形及色譜柱的pH 耐受性，本研究選擇甲醇-1.0%乙酸作為色譜分析流動(dòng)相。

表3 流動(dòng)相對(duì)二氫槲皮素保留時(shí)間及峰形影響結(jié)果Table 3 Effect of mobile phase on retention time and peak shape of dihydroquercetin

采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)二氫槲皮素標(biāo)樣在200～800 nm 范圍進(jìn)行光譜掃描，光譜圖見(jiàn)圖2。考慮在低波段很多雜質(zhì)吸收干擾，選擇290 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。標(biāo)樣、空白樣品及加標(biāo)樣品圖譜分別見(jiàn)圖3～圖5。

圖2 二氫槲皮素吸收光譜圖Fig.2 Absorption spectrum of dihydroquercetin

圖3 二氫槲皮素標(biāo)樣圖譜（10 μg/mL）Fig.3 Standard sample map of dihydroquercetin（10 μg/mL）

圖4 空白樣品圖譜Fig.4 Blank sample atlas

圖5 二氫槲皮素加標(biāo)樣品圖譜（0.1 mg/kg）Fig.5 Atlas of dihydroquercetin added standard sample（1 mg/kg）

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

研究二氫槲皮素的光熱穩(wěn)定性，對(duì)二氫槲皮素對(duì)照品的存放及前處理溫度控制有較好的指導(dǎo)意義，所以本實(shí)驗(yàn)取3 組濃度為20 μg/mL 的二氫槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別光照、50 ℃水浴和100 ℃水浴，每隔一定時(shí)間測(cè)定一次，以考察二氫槲皮素在不同條件下的光熱穩(wěn)定性，試驗(yàn)結(jié)果如圖6。試驗(yàn)結(jié)果可知，室溫光照條件對(duì)二氫槲皮素穩(wěn)定性影響較小，50 ℃水浴在6.5 h 之內(nèi)可緩慢降解約10%，100 ℃水浴在6.5 h 之內(nèi)可降解約70%，所以高溫對(duì)二氫槲皮素穩(wěn)定性影響較大，在工藝研究及檢測(cè)前處理分析應(yīng)作為一個(gè)重點(diǎn)關(guān)注因素。

圖6 二氫槲皮素的光熱穩(wěn)定性Fig.6 The photo-thermal stability of dihydroquercetin

2.5 濾膜影響

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用尼龍濾膜過(guò)濾20 μg/mL 二氫槲皮素液體標(biāo)樣，峰面積響應(yīng)值降低約50%，表明尼龍材質(zhì)會(huì)對(duì)二氫槲皮素有較強(qiáng)吸附，宜采用PTFE 微孔濾膜過(guò)濾樣品。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性范圍考察 按優(yōu)化的色譜條件，對(duì)系列二氫槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)濃度對(duì)峰面積的線性擬合可知，二氫槲皮素在0.5～20 μg/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=29.1X+0.74，線性相關(guān)系數(shù)為0.9997。

2.6.2 加標(biāo)回收試驗(yàn) 選取奶粉、牛奶、風(fēng)味酸奶、奶酪四個(gè)種類(lèi)空白樣品進(jìn)行3 個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)量分別為0.5、2.0 和20.0 mg/kg，按前述1.2 中實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行樣品處理及分析測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果如下表4。根據(jù)結(jié)果可知，四個(gè)種類(lèi)樣品3 個(gè)水平回收率范圍為86.0%～101%。

表4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of standard recovery experiment

2.6.3 精密度試驗(yàn) 選一空白液態(tài)奶樣品，按2 mg/kg加入二氫槲皮素標(biāo)樣，充分混勻后進(jìn)行樣品處理及分析測(cè)定，平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)6 次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，結(jié)果如表5 所示，結(jié)果表明，該方法精密度較好，計(jì)算RSD 值為2.06%

表5 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of precision experiment

2.6.4 方法檢出限 將按二氫槲皮素標(biāo)準(zhǔn)供試液進(jìn)行稀釋至3 倍信噪比，確定為檢出限，稀釋至10 倍信噪比，確定為定量限。本方法二氫槲皮素檢出限為0.01 mg/kg，定量限為0.1 mg/kg。

2.7 實(shí)際樣品分析

鑒于二氫槲皮素屬于一種新型食品添加劑，目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)應(yīng)用很少，也未曾有相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)評(píng)估報(bào)道，依據(jù)查閱的文獻(xiàn)資料及歐盟法規(guī)，選擇20 批次奶粉、液態(tài)奶、乳飲品及奶油奶酪進(jìn)行試驗(yàn)，原產(chǎn)地涉及國(guó)內(nèi)及歐美各地區(qū)。實(shí)際樣品中二氫槲皮素的摸查情況結(jié)果見(jiàn)表6。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，市售樣品中二氫槲皮素檢出率為10%（樣品基數(shù)n=20）。

表6 實(shí)際樣品分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table 6 Statistical table of actual sample analysis results

3 結(jié)論

建立了奶粉、酸奶、奶油等乳制品中二氫槲皮素高效液相色譜測(cè)定法，對(duì)提取試劑、凈化柱、流動(dòng)相及波長(zhǎng)等條件進(jìn)行探索和優(yōu)化，從回收率、精密度、檢出限等方面進(jìn)行方法驗(yàn)證，對(duì)實(shí)際樣品中二氫槲皮素含量進(jìn)行分析調(diào)查。精密度RSD 值為2.06%，加標(biāo)回收率范圍為86.0%～101.0%，定量限為0.1 mg/kg，試驗(yàn)結(jié)果表明，此方法可靠，重現(xiàn)性好，對(duì)市售樣品檢測(cè)分析，檢出率達(dá)10%，可以為二氫槲皮素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的建立及標(biāo)準(zhǔn)限量的指定提供參考依據(jù)。