六堡茶改善痰濕質功效評價及基于腸道菌群調節的祛濕機制研究

侯 粲，肖 杰，王黎明，陳潔瑜，趙曉山，范怡航，李 頌，郝彬秀，應 劍,*，張均偉

（1.中糧營養健康研究院有限公司，北京 102209；2.營養健康與食品安全北京市重點實驗室，北京 102209；3.南方醫科大學中醫藥學院，廣東廣州 510515；4.中茶科技（北京）有限公司，北京 102209；5.梧州中茶茶業有限公司，廣西梧州 543001）

痰濕質是一種病理體質，由于水液內停而痰濕凝聚所致，主要特征為黏滯重濁[1]。流行病學調查顯示，我國一般人群中痰濕體質所占比例為7.32%[2]。痰濕質是代謝綜合征形成的風險因素，與其發展預后有著密切關系[3?6]。“痰濕體質土壤論”認為，通過調節痰濕質狀態，可以實現高血脂、高血糖、高血壓等代謝類疾病的“異病同防”[7?9]。痰濕質還與特定人群肝內膽汁淤積癥相關[10]，因此，應用清熱利濕方劑有助于改善痰濕質人群的膽汁淤積癥[11]。油膩飲食與痰濕質的形成相關，多食過量導致脾胃運化不及易形成痰濕[12]；反之，痰濕質之人體內痰濕之邪盛，易困阻脾陽，脾再生濕，相互影響，導致脾系亞健康狀態的出現[13?18]。現代研究認為，腸道菌群紊亂影響消化功能，是脾虛濕困的重要病理因素[19]。與平和質相比，痰濕質中老年人腸道菌群的豐度及多樣性均顯著降低，擬桿菌門相對豐度較低，而厚壁菌門相對豐度較高，雙歧桿菌等厭氧菌減少[20]。

中醫體質學說認為“體質可調”，其調節方式包括心理、運動、飲食調整及適當的中藥、針灸等方法[21?22]。薏苡仁、蓮子、山藥、陳皮、冬瓜、山楂等食藥同源食物具有健脾祛濕的作用，在藥理學上表現為抗菌、降脂、利尿、改善血管功能、調節腸道菌群、調節免疫力等作用[23?25]。六堡茶是黑茶的一種，產自廣西壯族自治區梧州市蒼梧縣六堡鎮，其品質成分的形成與渥堆、窖藏等環節的微生物轉化緊密相關。隨著陳化時間延長，六堡陳茶中茶褐素和茶多糖增加，茶黃酮和酚酸進一步發生轉化，形成新結構的化合物[26]。六堡茶具有抗氧化、調節糖脂代謝、保護肝臟、增強免疫功能、促消化、抗凝血、促進胃排空和小腸推進作用[27?30]，與健脾祛濕類食藥同源物品有相似的藥理作用特點，特別是對于高脂飲食大鼠體現為抑制乙酸分泌、促進丙酸和丁酸分泌的作用[31]；促進雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌和腸球菌等厭氧菌的生長，并抑制需氧菌生長[29]。因此，民間所說六堡茶具有“祛濕”作用，可能與調節腸道菌群、促進代謝相關。但是，六堡茶的祛濕作用尚未得到論證，其可能的機制也尚未進行闡述。

本研究納入亞健康狀態痰濕質人群進行隨機、對照的臨床試驗，考察六堡茶改善痰濕質的作用，以及重點圍繞腸道菌群對其可能的機制進行探討，為其合理應用和推廣提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

六堡茶供試樣本 梧州中茶茶業有限公司提供；空腹血糖（FBG）、總膽紅素與直接膽紅素（TBIL、DBIL）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒 中生北控生物科技股份有限公司；DNA 分離提取（MOBIO PowerSoil DNA Isolation）試劑盒 深圳市安必勝科技有限公司。

ALLEGRAX-25R 多功能高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；ThermoForma5995 超低溫冰箱 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Milli-Q Reference 純水儀 德國默克集團有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 研究對象的選擇標準及分組 依據《中醫體質分類與判定表》和人群亞健康調查問卷，選擇18～30 周歲健康平和體質及痰濕質體質人群作為研究對象，其中平和質以體態適中、面色紅潤、精力充沛、臟腑功能狀態強健壯實為主要特征，痰濕質以體型肥胖、腹部肥滿、口黏苔膩等痰濕表現為主要特征[32]。

采用人群隨機對照研究，共納入健康平和質42 人，痰濕質70 人。在干預期間，將所有人群分為4 組，健康平和質人群為平和質對照組（PH），痰濕質人群分為痰濕質對照組（TS Control，27 人）、六堡茶新茶干預組（Tea，24 人）、六堡茶陳茶干預組（Aged Tea，19 人），進行兩療程（45 d/療程，共90 d）的標準化干預及評價，干預方式見1.2.2。本研究經中國注冊臨床試驗倫理審查委員會倫理審查，文號：ChiECRCT20190168，中國臨床試驗注冊中心臨床研究注冊號碼：ChiCTR1900026342。

1.2.2 六堡茶干預物制作及干預方法 毛茶經篩選、拼配、渥堆、蒸、壓制成型、陳化（相對濕度在75%～90%、溫度在23～28 ℃）等工藝制成新茶成品。新茶成品轉至清潔、陰涼、干爽、無異雜味的倉庫中繼續陳化五年后，制得六堡茶五年陳茶樣品。

平和質對照組（PH）、痰濕質對照組（TS Control）給予生活方式指導，包括膳食營養指導、體力活動指導、睡眠指導[22]。六堡茶新茶干預組（Tea）、六堡茶陳茶干預組（Aged Tea）除生活方式指導外，分別給予六堡茶新茶、六堡茶五年陳茶干預，每次1 袋（10 g），200 mL 沸水浸泡2 min 口服，每日2 次，服用兩個療程（45 d/療程）。

1.2.3 體質轉化分計算 體質得分（轉化分）采用中醫體質調查表對體質的轉化進行評價，按照《中醫體質分類與判定表》評分，每一問題按5 級評分，每個條目原始最低分是1 分，最高分是5 分，計算原始分及轉化分，依標準判定體質類型。原始分=各條目的分數相加。痰濕質轉化分數=[（原始分?條目數）/（條目數×4）] ×100，按照公式計算干預0、25、45 和90 d 體質轉化分數。平和質轉化分大于等于60 分且其他八種體質轉化分均小于30 分，記為平和體質。痰濕質轉化分大于等于40 分且平和質轉化分小于60 分、其他七種體質轉化分不高于40 分，記為痰濕質。

1.2.4 生化指標測定 試驗第0、25 和45 d 上午10 點抽取靜脈血5 mL 于EP 管中，血漿樣品靜置2 h后，3500 r/min、4 ℃條件下離心10 min 取上清液，嚴格按照試劑盒要求進行血清FBG、TBIL、DBIL、ALT、AST、TC、TG、HDL-C、LDL-C 的測定。

1.2.5 腸道微生物16S 基因靶向測序分析 試驗第0、25 和45 d 留取糞便樣品3～5 g 于取樣管中（內含裂解液和穩定液），由深圳譜元科技有限公司完成腸道微生物16S 基因靶向測序分析[33]。

1.3 數據處理

試驗結果通過SPSS 20.0 統計軟件進行統計分析，采用平均數±標準差表示，各組比較應用ANOVA分析，P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 六堡茶干預后痰濕質改善情況

六堡茶干預后痰濕質改善結果如圖1 所示，與平和質對照組相比，痰濕質對照組的痰濕質轉化評分會出現明顯的升高趨勢。六堡茶陳茶干預組和新茶干預組在干預25、45 和90 d 三個時間點的痰濕質轉化分均有下降趨勢，六堡茶陳茶干預組痰濕質轉化分從0 d 的38.97±7.10 下降到25 d 的36.57±5.68、45 d 的33.72±3.12 和90 d 的27.80±3.49，六堡茶新茶干預組由0 d 的40.76±7.95 下降到25 d 的30.86±4.87、45 d 的29.76±5.42 和90 d 的24.29±2.94。六堡茶新茶干預組在干預25、45 和90 d 的痰濕質轉化分均與痰濕質對照組有顯著差異（P<0.05），六堡茶陳茶干預組痰濕質轉化分在干預45 d 之后與痰濕質對照組相比有所下降，且在干預90 d 時，與痰濕質對照組有顯著差異（P<0.05）。

圖1 試驗各組痰濕質轉化評分Fig.1 The phlegm-dampness quality translation score of each group

2.2 六堡茶干預對血液生化指標的影響

本試驗分別對干預前（0 d）、第一療程中期（25 d）和第一療程干預末期（45 d）三個時間節點的空腹血糖（FBG）、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）進行檢測，結果如圖2、圖3、圖4 和圖5 所示。

圖2 試驗各組空腹血糖水平Fig.2 The fasting blood glucose of each group

圖3 試驗各組總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平Fig.3 The total cholesterol, triglycerides, high-density lipoprotein cholesterol and low-density lipoprotein cholesterol of each group

圖4 試驗各組總膽紅素和直接膽紅素水平Fig.4 The total bilirubin and direct bilirubin of each group

2.2.1 六堡茶干預對空腹血糖的影響 實驗干預45 d 后，平和質對照組空腹血糖水平為（4.74±0.37）mmol/L，痰濕質對照組為（4.67±0.29）mmol/L，六堡茶新茶干預組和六堡茶陳茶干預組空腹血糖分別為（4.78±0.32）、（4.74±0.26）mmol/L，與平和質對照組和痰濕質對照組相比，六堡茶新茶干預和陳茶干預對空腹血糖無顯著影響(P>0.05)。

2.2.2 六堡茶干預對血脂水平的影響 六堡茶陳茶和新茶干預后，總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇均有一定程度的下降趨勢，六堡茶陳茶干預組總膽固醇由0 d 的（4.58±0.97）mmol/L下降為45 d 的（4.44±0.83）mmol/L，高密度脂蛋白膽固醇由（1.53±0.38）mmol/L（0 d）下降至（1.44±0.34）mmol/L（45 d），低密度脂蛋白膽固醇由（2.62±0.94）mmol/L（0 d）下降至（2.51±0.82）mmol/L（45 d）；六堡茶新茶干預組總膽固醇由（4.64±0.81）mmol/L（0 d）下降至（4.41±0.70）mmol/L（45 d），高密度脂蛋白膽固醇由（1.54±0.29）mmol/L（0 d）下降至（1.47±0.34）mmol/L（45 d），低密度脂蛋白膽固醇由（2.68±0.72）mmol/L（0 d）下降至（2.51±0.66）mmol/L（45 d），但與平和質對照組、痰濕質對照組相比，變化沒有顯著性差異(P>0.05)，且下降后的值在正常范圍內。本試驗所納入人群的甘油三酯水平整體較低，干預第25 d 和45 d，六堡茶新茶干預組和六堡茶陳茶干預組的甘油三酯較0 d 略有升高（其原因可能與受試人群的飲食結構和習慣有關），但均在正常值范圍內，說明本試驗中六堡茶的干預對正常范圍內的血脂水平沒有顯著影響。

2.2.3 六堡茶干預對膽紅素的影響 六堡茶陳茶和新茶干預后，六堡茶陳茶干預組的總膽紅素由（14.31±8.42） μmol/L（ 0 d） 下降至（ 8.24 ±3.72） μmol/L（45 d），六堡茶新茶干預組的總膽紅素由0 d 的（11.25±5.30）μmol/L 下降至45 d 的（8.34±3.70）μmol/L。六堡茶陳茶干預組直接膽紅素由（5.79±3.44）μmol/L（0 d）下降為（3.52±1.58）μmol/L（45 d），六堡茶新茶干預組直接膽紅素由0 d 的（4.34±2.00）μmol/L 變化為45 d 的（3.43±1.41）μmol/L。即六堡茶陳茶和新茶均具有降低膽紅素（總膽紅素和直接膽紅素）的作用，其中六堡茶陳茶干預組在45 d 干預期內下降值更為明顯，說明其對于總膽紅素和直接膽紅素的調節作用較為明顯。

2.2.4 六堡茶干預對肝功的影響 丙氨酸氨基轉移酶（ALT）及天冬氨酸氨基轉移酶（AST）是反映肝功的重要指標，常用于肝臟或消化系統性疾病的診斷以及評估[34]，各組檢測結果見圖5。結果顯示，在整個干預期內，ALT 及AST 均保持在正常水平，即40 U/L以下。各組ALT 及AST 均出現一定的下降趨勢，六堡茶陳茶干預后，ALT 由（33.53±27.85）U/L（0 d）下降為（29.10±25.43）U/L（45 d），AST 由0 d 的（21.26±11.88）U/L 下降為45 d 的（17.00±6.76）U/L；六堡茶新茶干預組，ALT 由（18.67±9.54）U/L（0 d）下降至（16.09±11.22）U/L（45 d），AST 由（16.30±5.76）U/L（0 d）下降為（14.17±5.52）U/L（45 d），但無顯著差異（P>0.05)，說明六堡茶飲茶干預對于ALT 和AST 影響作用不顯著。

圖5 試驗各組丙氨酸氨基轉移酶和天冬氨酸氨基轉移酶水平Fig.5 The alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase of each group

2.2.5 體質與血生化指標相關性分析 通過血生化檢測指標與平和質轉化分、痰濕質轉化分相關性分析發現（圖6），痰濕質轉化分與丙氨酸氨基轉移酶呈正相關（P<0.05，相關系數為0.131），與總膽紅素呈極顯著負相關（P<0.01，相關系數為?0.139），與直接膽紅素呈顯著負相關（P<0.05，相關系數為?0.141），與其他生化指標相關性不顯著（P>0.05）。莊耀東等[35]指出代謝綜合征與中醫的“痰濁”或“痰濕”關系密切，研究結果為痰濕質轉化分與直接膽紅素呈負相關，與本實驗結果一致。同時痰濕質轉化分與膽固醇和甘油三酯呈正相關，而本實驗結果顯示痰濕質轉化分與膽固醇和甘油三酯相關性不顯著（P>0.05），其原因可能是本實驗所招募人群年齡普遍較輕，存在高血脂的人群占比較小，有待后續進一步證實。

圖6 痰濕質轉化分與血生化指標相關性熱圖Fig.6 Correlation heat-map between phlegm-dampness quality translation score and blood biochemical indicators

2.3 六堡茶干預對腸道菌群的影響

采用干預后（45 d）的腸道菌群豐度數據分析腸道菌群α-多樣性及門屬水平變化情況，多樣性分析包含豐富度（Obeserved_OTUs，反映樣品中含有的物種數目，數值越高表明樣品物種豐富度越高）和均勻度（Shannon 指數，評估樣本中物種組成的豐富度和均勻度，值越大表示該環境的物種越豐富，各物種分配越均勻）[36]。

從圖7A 可以看出，平和對照組、痰濕對照組與六堡茶新茶干預組的Obeserved _OTUs 值相差不大，而六堡茶陳茶干預組的Obeserved_OTUs 值低于其他三組，說明六堡茶新茶對腸道菌群物種豐富度影響較小，而六堡茶陳茶對腸道菌群物種豐富度影響大于新茶，其物種豐富度稍小于其他各組。從圖7B 可以看出，平和質組、痰濕對照組、新茶干預組的Shannon 指數相差不大，各組均勻度基本一致，六堡茶陳茶干預組略有下降，但組內差異較大。六堡茶新茶經陳放數年后，小分子物質氧化、聚合以及被微生物分解、利用，形成六堡茶陳茶，水浸出物增加，且大分子物質增加，更容易到達腸道，從而影響腸道微生態，這可能是六堡茶陳茶干預組腸道微生物物種豐富度和均勻度稍小的原因之一，有待后續進一步進行論證。

圖7 六堡茶干預對腸道菌群α-多樣性的影響Fig.7 Effect of Liupao tea on α-diversity

從腸道菌群門水平變化來看（如圖8 所示），痰濕質對照組中擬桿菌門（Bacterioidetes）水平下降，相對豐度由平和質對照組的0.52±0.28 變化為0.51±0.06，厚壁菌門（Firmicutes）水平有所上升，由平和質對照組的0.39±0.14 變化為0.41±0.13；飲茶后這一變化更為顯著，六堡茶新茶干預組擬桿菌門（Bacterioidetes）相對豐度下降為0.49±0.17、厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度上升至0.42±0.23，六堡茶陳茶干預組擬桿菌門（Bacterioidetes）相對豐度下降為0.48±0.35、厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度上升至0.45±0.08，以六堡茶陳茶干預變化更為明顯。

圖8 腸道菌群門水平的變化情況Fig.8 Changes of gut microbiota in the level of phylum

從腸道菌群屬水平變化來看（如圖9 所示），痰濕質對照組的需氧菌大腸桿菌/志賀菌（Escherichia-Shigella，需氧菌）的相對豐度為0.013±0.026，略高于平和質對照組（豐度為0.010±0.016），飲茶后下降，六堡茶新茶干預組相對豐度為0.009±0.012，六堡茶陳茶干預組相對豐度為0.005±0.034，以六堡茶陳茶干預后下降更為明顯，提示腸道健康情況得到改善。痰濕質對照組的擬桿菌屬（Bacteroides）和考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）的相對豐度（分別為0.29±0.16、0.034±0.021）比平和質對照組高（分別為0.26±0.18、0.030±0.028），六堡茶新茶干預使得擬桿菌屬（Bacteroides）和考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）的相對豐度降低，分別為0.24±0.17、0.027±0.013。痰濕質對照組的糞桿菌屬（Faecalibacterium）相對豐度（0.091±0.059）比平和質對照組略低（0.094±0.057），新茶和陳茶干預均使得糞桿菌屬（Faecalibacterium）的相對豐度略有升高（0.092±0.025、0.094±0.041），糞桿菌屬與丁酸代謝等密切相關，丁酸與腸道屏障改善、炎癥改善等密切相關[37]。與平和質對照組相比，痰濕質對照組的嗜膽菌（Bilophila）相對豐度升高，由0.0019±0.0020 上升為0.0021±0.0022，與攝入油膩飲食的菌群變化現象一致[12]。嗜膽菌的作用可能是降低動物性飲食帶來的心血管風險[38]，飲用六堡茶后，嗜膽菌（Bilophila）的相對豐度提高至六堡茶新茶干預組的0.0024±0.0013 和六堡茶陳茶干預組的0.0022±0.0034，以六堡茶新茶干預組升高更為明顯。嗜膽菌可在膽汁酸豐富的腸道中增殖，其相對豐度的升高，表明飲用六堡茶后膽汁酸分泌進一步增加，可能是解膩、去痰濕的機制之一。

圖9 腸道菌群屬水平的變化情況Fig.9 Changes of gut microbiota in the level of genus

2.4 體質與菌群相關性分析

通過《中醫體質分類及判定表》所定的人群體質類型，對試驗所納入人群的腸道菌群進行檢測，通過平和質轉化分、痰濕質轉化分與目水平菌群的相關性進行分析，如圖10 所示。結果顯示痰濕質轉化分與 Bifidobacteriales 菌、 Sphingomonadales 菌、Izimaplasmatales 菌呈顯著正相關（P<0.05，相關系數分別為0.130、0.120、0.131），與Synergistales 菌呈顯著負相關（P<0.01，相關系數為?0.152），且在六堡茶干預后，Bifidobacteriales 菌、Sphingomonadales菌、Izimaplasmatales 菌的豐度呈下降趨勢、Synergistales 菌豐度呈上升趨勢，即腸道微生物中含有更高豐度的Bifidobacteriales 菌、Sphingomonadales 菌、Izimaplasmatales 菌和更低豐度的Synergistales 菌的人群在體質上更偏向痰濕質體質，更易被六堡茶干預，達到改善痰濕質體質的效果。

圖10 體質轉化分與目水平菌群相對豐度水平相關性Fig.10 The correlation between traditional Chinese medicine constitution translation score and gut microbiota in the level of order

3 討論與結論

人群隨機對照研究顯示，經六堡茶陳茶和新茶干預后，六堡茶陳茶干預組痰濕質轉化分由0 d 的38.97±7.10 下降到25 d 的36.57±5.68、45 d 的33.72±3.12 和90 d 的27.80±3.49，六堡茶新茶干預組痰濕質轉化分由0 d 的40.76±7.95 下降到25 d 的30.86±4.87、45 d 的29.76±5.42 和90 d 的24.29±2.94。六堡茶陳茶干預組的總膽紅素由14.31±8.42 μmol/L（0 d）、下降至8.24 ±3.72 μmol/L（45 d），直接膽紅素由0 d 的5.79±3.44 μmol/L 下降為45 d 的 3.52±1.58 μmol/L。六堡茶新茶干預組的總膽紅素由0 d的11.25±5.30 μmol/L 下降至45 d 的8.34±3.70 μmol/L，直接膽紅素由0 d 的4.34±2.00 μmol/L 變化為45 d的3.43±1.41 μmol/L。說明六堡茶新茶和5 年陳茶能夠降低痰濕質轉化分、降低直接膽紅素和總膽紅素水平，均具備改善痰濕質狀態的作用，在飲茶25 d即可看到改善作用，每日飲茶量為10 g，200 mL 沸水浸泡2 min 口服，每日2 次，其中六堡茶新茶的改善作用優于六堡茶陳茶。

將中醫體質評分與腸道菌群的豐度進行分析，結果發現痰濕質人群的大腸桿菌/志賀菌（Escherichia-Shigella） 、 擬桿菌（Bacteroides） 和考拉桿菌（Phascolarctobacterium）、嗜膽菌（Bilophila）等菌豐度高于平和質人群，而糞桿菌（Faecalibacterium）Cloacibacillus菌、溶桿菌（Lysobacter）、嗜冷桿菌（Psychrobacter）等菌的豐度低于平和質人群，證明腸道菌群紊亂與痰濕質的形成相關。

將受試人群體質與本研究的重要生理指標進行統計學分析，發現痰濕質轉化分與總膽紅素、直接膽紅素水平呈現負相關。本研究發現，飲用六堡茶陳茶和新茶均具有降低膽紅素（總膽紅素和直接膽紅素）的作用，以陳茶更為顯著，提示六堡茶特別是陳茶的祛濕機制之一是改善膽紅素代謝。腸道菌群分析證實，飲茶促使表達膽鹽水解酶的擬桿菌屬豐度下降，提示結合型膽汁酸的分解代謝受到抑制，可能通過進一步作用于FXR 受體通路，將促使膽固醇轉化為膽汁酸。而腸道嗜膽菌的增殖則在飲用新茶組更為明顯，嗜膽菌有助于降低動物性飲食帶來的心血管風險，是人體保護機體的一個反饋機制。因此，盡管新茶和陳茶均可能通過腸道菌群-膽汁酸代謝通路發揮祛濕作用，但是其機制存在差別，是否與其內含的茶多酚、茶多糖、酚酸等含量和結構的差異有關，有待進一步研究予以論證。

本研究所納入的人群按體質進行遴選和分組，由于招募人群的年齡普遍較輕，在血液診斷指標上處于糖脂代謝不同階段的兼而有之，存在高血脂、高血糖、高血壓等多種代謝綜合征的人群占比較小，因此六堡茶對于空腹血糖、脂代謝的調節作用在統計學上不顯著。而飲茶后與代謝疾病、能量代謝有關的薩特氏菌屬（Sutterella）、Izimaplasmatales菌和瘤胃球菌屬（Ruminococcus）的相對豐度水平均發生改變。本研究提示，通過飲用六堡茶帶來祛濕作用，可能有助于在亞健康階段，實現代謝病的“異病同治”，其機制與調節腸道微生態相關。