電火花沉積內植體微槽表面抗菌改性

梁智杰，郭鐘寧，嚴銀銀，黃欽明，勾俊峰，劉江文

（廣東工業大學省部共建精密電子制造技術與裝備國家重點實驗室，廣州 510006）

0 引言

隨著科技發展，內植體市場需求不斷增加。內植體是制造用于替換缺失的生物結構，支持受損的生物結構或增強現有生物結構的醫療裝置[1]。臨床上內植體使用材料最多的依然為金屬材料[2]。醫用金屬材料現在亟待解決的問題之一是抗菌問題[3]。研究表明用于骨科的金屬植入體在植入手術后發生感染的幾率達0.5%～9%[4]。醫用金屬主要采用鈦基材料，具有高強度、低密度（高比強度）、高耐腐蝕性、對人體環境的完全惰性、較高的生物相容性、低模量和高骨親和能力[5]。應用范圍包括但不限于用于正畸手術的牙齒植入物和零件、關節置換零件、用于起搏器和人造心臟瓣膜的容納裝置、高速血液離心機中的儀器和組件等[6]。抗菌材料分為金屬與非金屬，金屬的抗菌材料以Ag＋、Cu2＋、Zn＋等為代表的泛用抗菌劑[7]，非金屬以各類合成藥物例如環丙沙星等為代表的大分子合成物。

對于在植入體表面添加抗菌材料的研究一直沒有停歇。Keynoosh等[8]采用溶膠-凝膠法制備了含銀、氟、羥基磷灰石（Ag-FHA）的復合涂層，加工后復合材料的抗菌性能顯著提。Hadidi等[9]通過電化學方法制備了羥基磷灰石-銅納米復合材料，作為生物醫學應用的抗菌涂層。Vaithilingam等[10]提出了一種利用選擇性激光熔融在Ti6Al4V結構表面吸附膦酸自組裝單分子膜固定環丙沙星（抗菌藥物）的方法，涂層抗菌藥物敏感性實驗表明該藥物釋放后具有治療活性。秦升[11]使用陽極氧化的方法在鈦表面制備二氧化鈦的納米管，再在納米管中負載依諾沙星。Bai等[12]采用脈沖直流磁控濺射法制備了不同Ag含量（1.2%～1.6%）的納米Ti-Ag涂層，涂層獲得良好的抗菌活性。此外還有利用機械加工的方法使鈦表面獲得抗菌性能[13]。內植體表面的抗菌改性技術還存在一些關鍵技術問題亟待解決：（1）需要多步工藝，制備過程復雜；（2）抗菌材料與基體材料結合不牢固容易脫落，穩定性差；（3）抗菌材料的抗菌效果持續性能差。

針對上述的問題，本文提出了一種使用電火花沉積加工的方法，將銀作為抗菌材料添加到金屬植入體中。該方法使用銀絲作為電極，通過電極刷實現多點放電沉積的方式，在帶有溝槽的復雜形貌表面放電沉積，從而實現提升內植體表面的抗菌性能。該方法通過采用柔性的銀絲作為工具電極，適用于各種復雜的表面形狀，具有制備工藝簡單，成本低，適應性強等優點。此外通過電火花沉積加工后的樣品表面的銀穩定性良好，能持續水解產生銀離子作為抗菌劑，保證抗菌的持續性。本研究對制備表面的表面成分、微觀形貌、抗菌性能、抗菌機理進行分析。

1 材料與方法

1.1 試驗設備與材料

試驗中基材材料選用TC4鈦合金（Ti6Al4V），樣品首先被加工成具有正弦波性結構的微槽。帶有微槽結構的表面更有利于與細胞黏附[14]，所以本研究采用帶有微槽的復雜結構進行研究。試驗設備使用上海旗雄自動化科技有限公司的Hz3k-100A的金屬冷焊修復機作為沉積電源。使用銀絲制備成的銀絲刷作為工具電極連接到電源的正極。微溝槽工件作為陰極連接到電源的負極。

1.2 加工條件

盡管銀具有良好的抗菌性能，但在實際處理中體內大量的銀也會引起例如排斥反應和體內細胞毒性的不良反應。為了研究含銀量不同的微槽表面的抗菌效果與細胞相容性之間的關系，需要弄清楚不同工藝參數對微槽表面電火花沉積的影響。電火花沉積過程通常受工具電極和加工的電參數影響。實驗條件如表1所示。

表1 電火花沉積改性工藝參數Table.1 ESDmodification processparameters

1.3 檢測方法

使用X射線衍射儀（D8 ADVANCE，Bruker，德國）測量加工后樣品表面的物相組成。已制備樣品的表面形貌使用激光共聚焦顯微鏡（OLS4000，奧林巴斯，日本）在快速掃描的條件下獲得。樣品的表面形貌利用掃描電子顯微鏡（S-3400N，日立，日本）在10 kV加速電壓下觀測得到。使用電感耦合等離子體質譜（ICAP RQ，Thermo Fisher，德國）定量檢測銀離子釋放能力。使用抑菌環試驗與平板菌落技術法測定樣品的抗菌能力。

2 結果與討論

2.1 物相組成

圖2所示為絲徑為0.2 mm，電壓為45 V，脈寬為50μs，頻率為50 Hz，加工時間為1 min條件下電火花沉積后的含銀微槽表面的XRD圖。圖譜為2θ角范圍為0°～90°，記錄所得。將測量數據衍射峰與標準物質衍射峰對比匹配。可以發現樣表面的物相主要由銀和鈦組成。

圖2 樣品的XRD圖譜Fig.2 XRDpattern of thesample

2.2 表面形貌

2.2.1 電壓對微溝槽表面的影響

實驗在50、55、60、65、70 V電壓下進行，頻率和脈沖寬度分別固定為60 Hz和50μs。圖3所示為不同電壓下電火花沉積后的微槽表面形貌和對應截面曲線。在電壓較低的時候，銀沉積較為均勻微槽的表面形貌并沒有太大改變，能保持原來的形貌。隨著電壓的增大，放電變得劇烈銀沉積量增加，微槽表面會被大量銀沉積物覆蓋，微槽原本的形貌會大幅改變。

圖3 不同電壓電火花沉積加工后微槽表面形貌Fig.3 Topography of themicrogrooveswith different voltage

圖4 所示為不同電壓下樣品的SEM圖。在較低電壓的情況下銀的沉積分布分散。對比不同沉積電壓下電火花沉積后微槽表面形貌，隨著電壓增大，沉積的銀的尺寸增大。在較大電壓的情況下（50～60 V）的時候，會出現銀尺寸的復合結構，在較大尺寸的銀沉積物表面會存在小尺寸銀沉積物。但電壓較大的情況下，加工后微槽的表面形貌會發生很大的改變。采用較小的電壓（40～45 V）加工，微槽的表面形貌并沒有太大的改變，沉積的銀尺寸較小，數量多。

圖4 不同電壓電火花沉積加工后微槽SEM圖Fig.4 SEMimagesof thesamplesurfacewith different voltage

2.2.2 脈寬對微溝槽表面的影響

改變脈寬研究加工中沉積電源放電脈寬對沉積的影響。實驗在30、40、50、60、70μs脈寬下進行，電壓和頻率固定為50 V和60 Hz。圖5所示為經過不同脈寬下加工后微槽的表面形貌和對應的截面曲線。在較小的脈寬的情況下放電的時間較短，銀沉積不均。當脈寬增加到50μs時，加工后微槽表面銀沉積均勻，表面形貌沒有發生較大的改變。當脈寬持續增加時，銀沉積的量大幅增加，微槽表面形貌大幅改變。

圖5 不同脈寬電火花沉積加工后微槽表面形貌Fig.5 Topography of themicrogrooveswith different pulsewidth

圖6 所示為不同脈寬下樣品的SEM圖。隨著脈寬的增大，沉積的銀的數量增加。在較大脈寬的情況下（60～70μs）的時候，微槽上的銀沉積物主要為大尺寸（＞100μm），且沉積的銀分布不均勻。在較小脈寬（30～50μs）的情況下沉積的銀主要為小尺寸（10～15μm）為主，在50μs脈寬的情況下整體觀察下銀沉積較為均勻，但通過掃描電鏡高放大倍數下能觀察到沉積物并不是均勻的，存在一定的過加工區域。

圖6 不同脈寬寬電火花沉積加工后微槽SEM圖Fig.6 SEMimagesof thesamplesurfacewith different pulsewidth

2.2.3 頻率對微溝槽表面的影響

實驗在40、50、60、70和80 Hz頻率下進行，脈寬和脈沖寬度固定為50 V和50μs。圖7所示為不同頻率條件下加工后的微槽表面形貌和對應的截面曲線。頻率在40 Hz的時候，微槽的表面銀沉積并不均勻，部分的微槽頂部會出現多次加工的情況。對應的截面曲線也能觀察到這種現象，部分波峰的曲線出現下凹的情況。在50 Hz的時候，加工后微槽的表面形貌并無太大改變，并且銀沉積均勻。將頻率增加到60 Hz，微槽表面沉積的銀增加，對應的截面曲線有所改變，具體表現為曲線更平，曲率減少。當頻率繼續增加到了70 Hz的時候，微槽表面形貌開始發生較大改變。截面曲線會顯示帶有類似雜波的正弦波曲線。頻率增大到80 Hz后，銀沉積的量增大，在微槽上的銀大幅改變了微槽的表面形貌。相對的截面曲線變得更加扁平。

圖7 不同頻率電火花沉積加工后微槽表面形貌Fig.7 Topography of the microgrooves with different wire diameter of frequency

圖8所示為不同頻率下樣品的SEM圖，對比不同頻率下電火花沉積后微槽表面形貌可以發現隨著頻率的增大，沉積的銀的數量增加。對比不同頻率下電火花沉積后微槽表面形貌，隨著頻率的增大，沉積的銀的數量增加。在較大頻率的情況下（70～80 Hz）的時候，微槽上的銀沉積物主要為大尺寸，沉積物覆蓋整個微槽的表面。在較小脈寬（40～60 Hz）的情況下沉積的銀主要為小尺寸為主，隨著頻率增大，在微槽上沉積的銀的數量逐漸增加。

圖8 不同頻率電火花沉積加工后微槽SEM圖Fig.8 SEMimagesof thesamplesurfacewith different frequency

2.3 表面粗糙度

使用激光共聚焦顯微鏡（OLS4000，日本，奧林巴斯）附帶的粗糙度測量，在精細掃描條件下，對每個樣品隨機選取10個不同的區域進行測量取平均值。結果如圖9所示，未加工的微槽為2.09±0.367μm。

圖9 樣品粗糙度Fig.9 Sample Roughness

從結果看，加工后的微槽相比未加工的微槽粗糙度有所上升。在改變電壓的條件下，加工后樣品表面的平均粗糙度相差不大，但當電壓達到60 V時，出現較大的偏差，部分區域最小粗糙度與最大粗糙度相差達3μm。在改變脈寬的條件下，在脈寬為50μs時樣品表面粗糙度相對其他脈寬參數具有最高值，且偏差也為最大。結合表面形貌可以得知，在50μs時每一次放電增加，每一次放電生成的銀沉積物大小增加，但這些尺寸加大的銀沉積物在微觀上并沒有大量相連，大多數的銀沉積物獨立存在。隨脈寬增大，銀沉積物的大小增加并且更多的銀沉積物連成片，樣品表面粗糙度反而下降。綜合以上因素，在脈寬為50μs條件下加工后表面相對其他脈寬參數具有最大的粗糙度，且偏差較大。在改變頻率的條件下，使用不同參數加工后樣品的表面粗糙度相差不大。但在40 Hz與80 Hz的條件下粗糙度偏差較大。

2.4 抗菌性能

通過對各稀釋梯度接種培養后的培養基進行平板計數。為了研究不同電參數下電火花沉積含銀微槽表面的抗細菌黏附效果，實驗選擇了典型的革蘭氏陰性菌E.coli和革蘭氏陽性菌S.aureus作為測菌種。實驗中將樣品放置在干凈玻璃培養皿中，再分別對應加入10 mL濃度為8×107CFU/mL的E.coil菌液與10 mL濃度為8×107CFU/mL的S.aureus菌液，放入37℃恒溫孵育箱中培養24 h。之后取出樣品，用生理鹽水沖洗表面，再放入超聲清洗洗脫表面黏附的細菌，對洗脫液進行平板菌落培養。圖10所示為抗菌試驗的結果。

圖1 設備與材料Fig.1 Equipment and materials

圖10 不同加工參數下微槽抗菌率Fig.10 Antibacterial rate of microgrooves under different processingparameters

變量為電壓的第一組中，樣品在抗大腸桿菌的實驗中都有良好的效果，整體抗率都能在90%以上。結合微槽表面形貌的觀察，在較小電壓進行加工的情況下，微槽表面的銀沉積較為均勻，表面的形貌基本保持原來的形貌，且抗菌效果較好。第二組樣品中變量為脈寬，在抗大腸桿菌的實驗中都有良好的抗菌效果。結合表面形貌的觀察結果分析，在放電脈寬較低的時候，放電時間較短，能形成的銀沉積物的尺寸較小、分布不均勻。隨著脈寬的增加，銀沉積物尺寸和數量增加，但大尺寸的銀沉積物的抗菌能力比小尺寸的銀沉積物差。第三組樣品中變量為頻率，在抗大腸桿菌的實驗中都有良好的抗菌效果。當變量為頻率時，所觀測到的規律與前兩組變量類似：當頻率增大，加工后樣品的抗菌能力下降。通過對比不同頻率電火花沉積后微槽的表面形貌可以得知：在頻率較低的時候（40 Hz），放電加工不均勻，導致銀的沉積不均勻最終影響了樣品的抗菌效果。但是當頻率增大到60 Hz或更高時，放電加工覆蓋微槽的全部區域，銀沉積的量也逐漸增加。在一些區域會出現多次放電，多次沉積的現象。直觀表現為通過電鏡觀察，會發現沉積的銀的數量增多，尺寸明顯增大。在較高的頻率下大量的銀沉積會在放電中重新融熔形成大尺寸的銀沉積物。

2.5 抗菌機理

銀通過水解生成銀離子作為抗菌劑產生抗菌效果[15]。選取電壓參數為40 V、50 V、60 V與未加工樣品，放入模擬體液（SBF）10 mL中浸泡24 h，使用電感耦合等離子體質譜（ICAPRQ，Thermo Fisher，德國）對樣品浸泡后溶液的銀離子濃度進行檢測，檢出限ppb為0.019，定量限ppb為0.063。結果如圖11所示。

圖11 溶液中Ag＋濃度Fig.11 Ag＋concentration in solution

樣品中Ag＋離子濃度分別為：空白對照0μg/L，40 V樣品0.22μg/L，50 V樣品0.13μg/L，60 V樣品0.126μg/L。浸泡后溶液中銀離子濃度隨電壓的增大而減少。在低電壓的加工參數下，銀沉積物的尺寸較小，在模擬體液中容易水解生成Ag＋。同過對樣品的物相與化學組成分析，樣品表面同時存在銀單質與氧化銀。加工后樣品表面的銀于空氣中的氧結合反應生成氧化銀。所以在模擬體液浸泡時，樣品析出銀離子分為兩個階段。第一階段，銀的氧化層遇水水解成銀離子，反應如式（1）所示。第二階段氧化銀水解完成后，銀接觸水發生水解，具體反應如式（2）所示。

3 結束語

本文使用電火花沉積加工方法可以使得內植體表面獲得抗菌能力，并且這種方法可以適用在復雜的表面形貌中。

加工的工藝參數對加工后樣品的抗菌性能有很大影響，采用較低的電壓、脈寬、頻率加工后的表面銀沉積物尺寸較小，抗菌效果更好。

小尺寸的銀具備更良好抗菌性能的原因是因為其相較于大尺寸的銀沉積具有較大的比表面積，在溶液或體液中更容易水解產生銀離子，抗菌性能由銀離子提供。