基于SDF-1α/CXCR4通路探討補腎活血湯對骨質疏松大鼠骨折愈合的促進作用*

鄂 遠，王雨辰

（常州市武進中醫醫院，江蘇 常州 213139）

隨著人口的不斷老齡化，骨質疏松癥（osteoporosis，OP）已成為我國重要的公共衛生問題[1]。流行病學調查[2]顯示，在50歲以上的人群中，尤其是女性，OP的患病率急劇上升，約40%會發生骨質疏松性骨折（osteoporosis fracture，OPF）。相比于普通骨折，OPF愈合較難，是導致老年患者致殘和死亡的主要原因之一[3]。中醫在防治OPF中有其獨特優勢，補腎活血湯為補腎、活血的中醫經驗方，而腎主骨，因此被應用于骨折等骨傷科疾病的治療[4]。骨折愈合包括間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）趨化歸巢、增殖和分化的炎癥階段，骨痂形成的修復階段，以及破骨細胞吸收和成骨細胞新骨骨質形成的塑形階段[5]。其中，MSCs的趨化歸巢、增殖和分化是骨折正常愈合的前提。基質細胞衍生因子-1α（Stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α）/CXC趨化因子受體4（C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4）通路的激活為MSCs趨化、增殖和分化所必需，SDF-1α可引導MSCs向骨折處遷移并分化為成骨細胞，最終實現骨形成和骨愈合[6]。研究發現[7-8]，骨質疏松癥老年大鼠骨髓MSCs（bone MSCs，BMSCs）的成骨分化和遷移能力明顯減弱，可能與骨形成明顯減少有關，上調CXCR4水平可以改善BMSCs的遷移，可能有利于促進OPF愈合。本研究推測，補腎活血湯促進OPF愈合的作用可能與活化SDF-1α/CXCR4通路有關，并通過構建OPF大鼠模型對此進行探究，以期為臨床應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6個月齡SPF級健康雌性SD大鼠40只，體質量310～330 g，由江蘇省中醫藥研究院采購，動物使用許可證號：SYXK（蘇）2016-0018。飼養環境：溫度（22±2）℃，濕度（65±5）%，光照/黑暗12 h交替，自由飲食，取材時將大鼠麻醉處死。本研究經醫院動物倫理委員會批準并在3R原則下開展實驗。

1.2 藥物與試劑 補腎活血湯，方藥組成：菟絲子、熟地黃、補骨脂各18 g，杜仲、枸杞子、肉蓯蓉、當歸、獨活、沒藥、山萸肉各6 g，紅花3 g，所有中藥材購于本院中藥房。將上述中藥材在水中浸泡30 min，加入400 mL無菌水煎煮，最終濃縮至含生藥量1 g/mL備用。CXCR4拮抗劑AMD3100（純度≥98%，批號：A5602，Sigma公司）；大鼠骨橋素（Osteopontin，OPN）ELISA試劑盒（批號：D731102）、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）ELISA試劑盒（批號：D731033）及骨鈣素（Osteocalcin，OCN）ELISA試劑盒（批號：D731045）均購自生工生物公司；兔源SDF-1α單抗試劑盒（批號：ab155090）、兔源CXCR4單抗試劑盒（批號：ab124824）、兔源OCN單抗試劑盒（批號：ab93876）、抗兔HRP-DAB免疫組化染色試劑盒（批號：ab64264）均購自Abcam公司。

1.3 主要儀器 uCT50顯微CT（SCANCO Medical AG公司）；臺式高速冷凍離心機（美國Thermo）；QX-W550型生物力學測試機（上海企想儀器）；SMZ745光學顯微鏡（日本尼康）。

1.4 造模與分組 40只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、補腎活血湯組和補腎活血湯+CXCR4拮抗劑組，每組10只。大鼠麻醉固定后，備皮開腹，除對照組大鼠剪除卵巢附近脂肪組織外，其余各組大鼠剪除卵巢。正常飼養8周后，造模大鼠骨密度明顯低于對照組則骨質疏松模型制備成功[9]。之后除對照組外，截斷其余3組大鼠的右側股骨，并插入克氏針，即成功建立骨折模型[9]，對照組大鼠不進行手術。術后X光檢查，股骨處有明顯骨折線則OPF模型制備成功。

1.5 實驗給藥 補腎活血湯組大鼠每天灌胃給予10 g/kg補腎活血湯[9]；補腎活血湯+CXCR4拮抗劑組大鼠每天灌胃給予10 g/kg補腎活血湯的同時，骨折處皮下注射40 mmoL/kg AMD3100[10]治療，對照組和模型組大鼠分別灌胃和注射等體積生理鹽水，連續給藥4周。

1.6 觀察指標

1.6.1 血清骨因子OPN、ALP、OCN 末次治療24 h后麻醉處死各組大鼠。分離腹腔取腹主動脈血，并4 ℃3 000 r/min離心15 min取血清，用于血清因子檢測。將血清與大鼠OPN、ALP、OCN試劑盒試劑混勻后，按說明書檢測各因子水平。同時分離留取各組大鼠右側股骨，剔除肌肉、脂肪等多余組織，用于后續檢測。

1.6.2 骨微結構指標 將大鼠麻醉后置于照射平臺上，采用X射線對股骨骨折處攝片，以評估骨折愈合情況。將“1.6.1”中股骨放在掃描專用圓筒中，設置掃描儀掃描參數為：55 kVp X射線、145 μA電流，以相同的方向進行掃描，每個平面采集1 000個圖像。通過SCANCO評估程序一鍵分析骨折處新生骨組織的結構參數，包括骨密度（BMD）、骨體積分數（BV/TV）、骨小梁數量（TB.N）等，以評價新生骨質的微觀結構。

1.6.3 生物力學指標 采用力學測試機對各股骨進行三點彎曲試驗以評估其生物力學性能。將股骨樣品以相同方向放置在相距20 mm的兩個桿上，以1.0 mm/min的恒定速度將移動的十字頭力傳遞至中軸，并讀取儀器上骨剛性、骨最大載荷及彈性載荷等指標。

1.6.4 骨組織形態學觀察 股骨組織經4%多聚甲醛固定、EDTA溶液脫鈣、常規脫水等處理后，制備石蠟塊，從骨折處開始對股骨進行切片（4 μm/片），經蘇木素染色、鹽酸分化、PBS脫色、伊紅復染色后，在光學顯微鏡下觀察。

1.6.5 股骨組織SDF-1α、CXCR4、OCN蛋白 股骨石蠟切片經脫蠟、水化、抗原修復、一抗SDF-1α（1 ∶500）、CXCR4（1∶200）、OCN（1∶200）孵育10 h、抗小鼠IgG-Biotin（1∶500）二抗孵育1 h、鏈霉親和素-HRP綴合物孵育30 min、DAB顯色、蘇木素染液復染后，在顯微鏡下拍照。每張切片至少對6個視野進行免疫組化評分。

1.7 統計學方法 用Graphpad Prism 8或SPSS 25.00行統計分析，計量資料以“均數±標準差”（）表示，多組比較使用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q或Bonferroni-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠骨折愈合情況 對照組大鼠股骨骨折處未見骨折線。治療4周后，模型組、補腎活血湯+CXCR4拮抗劑組大鼠股骨骨折處可見明顯骨折線和少量骨痂；補腎活血湯組大鼠股骨骨折處可見模糊骨折線和大量骨痂。（見圖1）

圖1 各組大鼠股骨X 射線圖像

2.2 各組大鼠骨微結構及生物力學指標比較 與對照組比較，模型組大鼠骨體積分數、骨密度、骨小梁數量、骨剛性、骨最大載荷及骨彈性載荷均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，補腎活血湯組大鼠骨體積分數、骨密度、骨小梁數量、骨剛性、骨最大載荷及骨彈性載荷均明顯升高（P＜0.05）；與補腎活血湯組比較，補腎活血湯+CXCR4拮抗劑組大鼠骨體積分數、骨密度、骨小梁數量、骨剛性、骨最大載荷及骨彈性載荷均明顯降低（P＜0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠骨微結構及生物力學指標比較（）

表1 各組大鼠骨微結構及生物力學指標比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與補腎活血湯組比較，cP＜0.05

2.3 各組大鼠骨折處骨組織形態比較 對照組大鼠骨組織排列較為規則，骨小梁間隙較大且數量較多；模型組、補腎活血湯+CXCR4拮抗劑組大鼠骨折處有少量成骨細胞和新生骨組織；補腎活血湯組大鼠骨折處有較多成骨細胞和新生骨組織。（見圖2）

圖2 各組大鼠骨折處骨組織形態比較（HE，×40）

2.4 各組大鼠血清OPN、ALP、OCN水平比較 與對照組比較，模型組大鼠血清OPN、ALP、OCN水平均降低（P＜0.05）；與模型組比較，補腎活血湯組大鼠血清OPN、ALP、OCN水平均升高（P＜0.05）；與補腎活血湯組比較，補腎活血湯+CXCR4拮抗劑組大鼠血清OPN、ALP、OCN水平均降低（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠血清OPN、ALP、OCN 水平比較（）

表2 各組大鼠血清OPN、ALP、OCN 水平比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與補腎活血湯組比較，cP＜0.05

2.5 各組大鼠骨折處SDF-1α、CXCR4、OCN蛋白表達水平比較 與對照組比較，模型組大鼠骨折處SDF-1α、CXCR4、OCN蛋白相對表達量明顯減少（P＜0.05）；與模型組比較，補腎活血湯組大鼠骨折處SDF-1α、CXCR4、OCN蛋白相對表達量明顯增加（P＜0.05）；與補腎活血湯組比較，補腎活血湯+CXCR4拮抗劑組大鼠骨折處SDF-1α、CXCR4、OCN蛋白相對表達量減少（P＜0.05）。（見圖3、表3）

表3 各組大鼠骨折處SDF-1α、CXCR4、OCN 蛋白相對表量達比較（）

表3 各組大鼠骨折處SDF-1α、CXCR4、OCN 蛋白相對表量達比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與補腎活血湯組比較，cP＜0.05

圖3 各組大鼠骨折處SDF-1α、CXCR4、OCN 蛋白表達情況（免疫組化，×200）

3 討論

OPF患者由于存在骨量減少和骨微結構破壞等基礎病變導致其骨折愈合難度較高。目前對于OP的治療主要采用抗骨吸收藥物和促骨形成藥物，然而存在一定的副作用。中醫學并無“骨質疏松”的名稱，其臨床特征和病理機制與“骨痿”“骨枯”等較為接近，腎精虧虛、骨失滋養為其發病的原因，應從補腎強骨治療[11]。中醫認為骨折愈合的過程涉及瘀去、生新和骨合，對骨折的治療應從活血逐瘀、接筋續骨、滋腎補血等多方面結合進行[12]。補腎活血湯最早記錄于《傷科大成》，具有益腎補精、強骨益髓、活血逐痛等功效，為臨床治療骨折的常用方劑，可同時滿足骨質疏松和骨折的治療思路。臨床研究顯示[13]，補腎活血湯可增加OPF患者術后骨密度，提高其骨礦物質含量，促進骨折愈合。體內和體外研究顯示[9,14]，補腎活血湯可激活Runt轉錄因子（Runt-related transcription factor2，Runx2）及轉錄因子Osterix的表達，促進骨髓MSCs成骨分化及OPF大鼠骨折愈合。本研究觀察到，經補腎活血湯治療的OPF大鼠骨折線模糊，出現大量骨痂，與既往研究一致。并且補腎活血湯可明顯提高骨體積分數、骨密度、骨小梁數量，改善骨微結構，增加骨組織的生物應力，促進骨組織新生，增加血清中成骨因子水平，表明補腎活血湯可促進成骨形成，加速OPF大鼠骨折愈合過程。

炎癥細胞、MSCs等細胞募集、遷移和歸巢至骨折部位對于炎癥過程、新血管及軟骨形成、成骨和骨愈合至關重要，趨化因子等為上述細胞遷移過程中的主要調節劑[15]。SDF-1α為趨化因子CXC亞家族的一員，由骨髓基質細胞分泌，在血管生成和細胞歸巢中起主要作用，CXCR4廣泛分布在MSCs和骨髓基質細胞的表面，為SDF-1α的受體[16]。缺血性組織損傷處SDF-1α表達迅速上調，可招募循環中攜帶CXCR4的MSCs，并將其招募至損傷部位，進而協助組織修復[17]。另有研究指出，糖尿病骨折大鼠骨折部位SDF-1α和CXCR4表達降低，與骨折愈合不良有關[18]。SDF-1α/CXCR4通路可能在骨骼再生中起關鍵作用。本研究發現，模型組大鼠骨折處SDF-1α、CXCR4、OCN蛋白相對表達量低于對照組，可能是其骨折愈合不良的原因。SDF-1α和成骨基因在牽引成骨區的表達顯著增高，SDF-1α/CXCR4信號拮抗劑則可顯著抑制牽引成骨中的骨礦化和新骨形成[10]，而過表達CXCR4可提高OP大鼠骨密度，增加骨形成[19]。熊云譜等[20]發現補腎活血湯含藥血清可促進骨髓MSCs的遷移，并可上調CXCR4蛋白表達。本研究中，補腎活血湯治療后OPF大鼠骨折處SDF-1α、CXCR4、OCN蛋白相對表達量明顯升高，表明補腎活血湯可促進骨組織SDF-1α/CXCR4通路活化，而SDF-1α和CXCR4相互作用可誘導MSCs等向骨折處遷移并分化為成骨細胞，促進骨形成，加速骨折愈合[21]。另外，采用SDF-1α/CXCR4通路拮抗劑AMD3100干預后，補腎活血湯對OPF大鼠骨折愈合的改善作用被AMD3100逆轉，進一步表明補腎活血湯可能通過激活SDF-1α/CXCR4通路，誘導MSCs向骨折處遷移，促進骨形成，加速骨折愈合。

綜上所述，補腎活血湯可能通過激活SDF-1α/CXCR4通路，誘導BMSCs向骨折處遷移，促進骨形成，加速OPF大鼠骨折愈合。然而中藥多同時作用于多靶點，補腎活血湯對OPF愈合的促進作用可能涉及其他機制，有待進一步研究。